雞蛋過敏原卵轉鐵蛋白標準物質候選物的研究

袁 錦,周 煌,佟 平,吳志華,4,陳紅兵,4,高金燕

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學食品學院,江西南昌 330047;3.吉安職業技術學院現代農林工程學院,江西吉安 343000;4.南昌大學中德聯合研究院,江西南昌 330047)

雞蛋過敏原卵轉鐵蛋白標準物質候選物的研究

袁 錦1,2,周 煌3,佟 平1,吳志華1,4,陳紅兵1,4,高金燕2，*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學食品學院,江西南昌 330047;3.吉安職業技術學院現代農林工程學院,江西吉安 343000;4.南昌大學中德聯合研究院,江西南昌 330047)

目的:制備高純度的雞蛋過敏原卵轉鐵蛋白,并詳細表征其理化性質及免疫學性質,滿足標準物質候選物的質量要求。方法:通過兩步柱層析法制備卵轉鐵蛋白并分裝、凍干,然后借助質譜鑒定身份;采用SDS-PAGE銀染方法鑒定純度,圓二色光譜、熒光光譜和核磁共振表征高級結構;利用Bradford法檢測含量和SDS-PAGE銀染方法評估穩定性,間接ELISA方法評估其與IgE結合能力。結果:制備的蛋白經質譜鑒定為雞蛋卵轉鐵蛋白,分子量約79.55 ku,等電點為6.85,純度高達94.6%;結構分析顯示,制備的卵鐵蛋白保留了其天然結構特性,并且凍干未使卵轉鐵蛋白的結構產生明顯的變化;在4 ℃條件下儲藏5個月,卵轉鐵蛋白的含量、純度、結構和免疫學活性均無明顯變化。結論:制備的卵轉鐵蛋白可作為標準物質候選物。

雞蛋過敏原,卵轉鐵蛋白,標準物質候選物

食物過敏是目前公認的人類健康問題之一,發生率在幼兒中約占8%,在成人中約占3%～4%,且近年來逐漸增高[1]。牛奶、雞蛋、花生、堅果、魚、甲殼類水產動物、小麥和大豆是公認的八大過敏食物[2]。其中,雞蛋可為人體提供優質的蛋白質,氨基酸比例適合人體生理需要,易被吸收,但同時也是僅次于牛奶的第二大過敏食物[3],其主要的過敏原蛋白包括卵白蛋白、卵類粘蛋白、卵轉鐵蛋白、溶菌酶、卵黃糖蛋白42和α-卵黃蛋白[4]。據報道,約有1%～2%的嬰兒和1.6%～3.2%的兒童對雞蛋過敏[5],嚴重影響了他們的健康。為了減少雞蛋過敏的危害,需要進行食品中雞蛋過敏原蛋白的精準檢測以及雞蛋過敏的正確診斷,而檢測和診斷離不開過敏原標準物質的參比作用。Brand[6]等已經開展了雞蛋過敏原卵轉鐵蛋白(ovotransferrin,OVT)的分離和純化研究工作,市場上也有一些昂貴的卵轉鐵蛋白試劑,但尚不能滿足精準檢測和診斷需求,無法保證食物蛋白過敏原測量的溯源性、有效性、可比性以及國際等效性。迄今為止,卵轉鐵蛋白過敏原標準物質的研究仍是空白,值得探索。因此,本研究以蛋清為原料,通過離子交換和羥基磷灰石柱層析兩步法制備卵轉鐵蛋白并分裝、凍干,然后進行蛋白身份和純度鑒定,并借助一系列理化和免疫學方法評價其質量性能,為卵轉鐵蛋白過敏原標準物質的研制提供關鍵技術和實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柱材CM Sepharose Fast Flow和Bio-Gel HT Fully Hydrated Hydroxyapatite GE公司(美國);牛血清白蛋白標準品 中國國家計量院(NIM);過硫酸銨(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)和α-氰基-4-羥基肉桂酸基質 Sigma公司(美國);40%丙烯酰胺/雙丙烯酰胺儲液 伯樂公司(美國);乙腈和三氟乙酸 默克公司(德國);其他化學試劑 均為分析純;雞蛋 從當地市場購買。

Milli-Q純水儀 美國Millipore公司;蛋白電泳儀、凝膠成像系統、Mode 1860酶標儀 美國伯樂公司;N2000色譜工作站STS 浙江大學智達信息工程有限公司;高速冷凍離心機 德國貝克曼公司;PB-10酸度計 德國Sartorius公司;ABI 4800 MALDI TOF/TOF串聯飛行時間質譜儀 美國Applied Biosystems;MOS-450/AF-CD圓二色光譜 法國Bio-Logic公司;核磁共振儀 德國Bruker Avance。

1.2 實驗方法

1.2.1 卵轉鐵蛋白的制備

1.2.1.1 CM Sepharose Fast Flow柱層析分離卵轉鐵蛋白 新鮮雞蛋取蛋清,用玻璃棒輕輕攪拌,使蛋清中膠狀物溶解,于4 ℃層析柜中低速磁力攪拌30 min。用50 mmol/L、pH4.7的醋酸鈉緩沖液將蛋清pH調至6.0,再4 ℃層析柜中磁力攪拌3.5 h,8000×g離心30 min,取上清液分裝,于-20 ℃保存。參照袁角建[7]分離純化卵轉鐵蛋白的方法,采用CM Sepharose Fast Flow陽離子柱對前處理蛋清中的卵轉鐵蛋白進行初步分離,所選柱子的規格為3.5 cm×50 cm。經活化、脫氣等步驟處理后,將柱材裝入柱子中,用蒸餾水以7 mL/min的流速壓柱,用陽離子柱平衡液以5 mL/min的流速平衡陽離子柱,基線平穩后,取63 mL處理過的蛋清上樣,用700 mL陽離子柱平衡液加上700 mL陽離子柱梯洗液進行線性梯度洗脫。

1.2.1.2 羥基磷灰石柱層析分離 同樣參照袁角建[7]的實驗方法,采用450 mL羥基磷灰石柱(Bio-Gel HT Fully Hydrated Hydroxyapatite)對卵轉鐵蛋白作進一步純化。具體步驟如下:用蒸餾水以4 mL/min的流速壓柱,羥基磷灰石柱平衡液以3 mL/min的流速平衡,平衡后上樣PEG20000濃縮的粗提物卵轉鐵蛋白16 mL,分別用450 mL羥基柱梯度洗液1(pH7.0,80 mmol/L的磷酸緩沖液)和450 mL的羥基柱梯度洗液2(pH7.0,300 mmol/L的磷酸緩沖液)進行線性梯度洗脫,收集目標產物。

1.2.1.3 蛋白的真空冷凍干燥 將收集到的純卵轉鐵蛋白溶液,按860 μL/瓶均勻分裝到3 mL凍干瓶中,并于-80 ℃冰箱中冷凍30 h。采用VIRTIS真空冷凍干燥機進行凍干,-70 ℃下抽真空,凍干約23.5 h后,將凍干機加熱溫度調為30 ℃;30 min后停止凍干,取出用鋁蓋封口、貼標,保存在4 ℃冰箱中。

1.2.2 蛋白質身份鑒定 制備的卵轉鐵蛋白酶解后真空凍干,用1.5 μL質譜上樣緩沖液(30%乙腈,0.1%三氟乙酸)溶解,取0.8 μL點在384孔不銹鋼點樣板上,加0.4 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸基質溶液(5 mg/mL),自然風干、結晶后采用ABI 4800 MALDI/TOF串聯飛行時間質譜儀進行質譜檢測。獲得的一級和二級質譜數據使用GPS Explore(V3.6,Applied Biosystems)軟件進行分析,并通過內置的MASCOT(V2.1,Matrix Science,London,U.K)搜庫軟件對本地數據庫進行檢索、鑒定蛋白質。

1.2.3 純度鑒定 用不連續的SDS-PAGE電泳檢測卵轉鐵蛋白,上樣量為0.125 μg/孔(4%的濃縮膠和12%的分離膠),待電泳跑完后,剝膠進行銀染,對所制備卵轉鐵蛋白的純度進行鑒定。

1.2.4 卵轉鐵蛋白結構表征

1.2.4.1 二級結構檢測 采用MOS-450/AF-CD圓二色光譜儀表征卵轉鐵蛋白的二級結構。將卵轉鐵蛋白的濃度稀釋至0.1 mg/mL(500 μL),以蒸餾水做空白。設定遠紫外掃描波長范圍為190～240 nm,光徑為0.1 cm,帶寬為1 nm,光譜間隔0.1 nm,掃描速度為0.05～20 nm/s,每個樣品分別做三次平行,取其平均值。所得數據用CD在線軟件http://dichroweb. cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml進行分析。

1.2.4.2 表面疏水性檢測 將卵轉鐵蛋白樣品稀釋至0.1 mg/mL,取6 mL蛋白,加入60 μL的ANS(5 μmol/L),混勻后避光反應2 h。用日立F-4500熒光分光光度計,激發波長為390 nm,發射波長為400～600 nm,掃描速度為1200 nm/min,測定卵轉鐵蛋白的熒光值,分析卵轉鐵蛋白的表面疏水性。

1.2.4.3 三級結構檢測 取450 μL,10.13 mg/mL的卵轉鐵蛋白和50 μL D2O于核磁管中,使卵轉鐵蛋白最終濃度為0.12 mmol/L。通過Bruker Avance 600 MHz核磁共振波譜儀,分析卵轉鐵蛋白的核磁圖譜。測定中脈沖序列為zgpr,磁體為14.09 Tesla,掃描次數為1228,溫度控制為25 ℃。

1.2.5 卵轉鐵蛋白穩定性檢驗 標準物質的長期穩定性是指在規定的貯存條件下,在規定的時間間隔內,使其描述的特性值保持在規定范圍內的能力[8]。

1.2.5.1 含量、純度及其儲藏穩定性檢測 將凍干后的卵轉鐵蛋白置于4 ℃、避光及干燥條件下保存。隨機抽取3瓶樣品,在放置第0至5個月后,分別采用Bradford法和SDS-PAGE銀染的方法測定含量和純度。

1.2.5.2 卵轉鐵蛋白的免疫活性檢測 卵轉鐵蛋白的免疫學活性采用人血清間接ELISA對凍干前后卵轉鐵蛋白的IgE結合能力和儲藏穩定性進行檢測,雞蛋過敏患者的血清池由18位對雞蛋過敏的患者的血清混合而成,這18位雞蛋過敏患者的信息如表1。所選患者的血清具備如下特點:對雞蛋過敏呈陽性,且總IgE水平基本都在100 IU/mL左右。

表1 雞蛋過敏患者信息Table 1 Information of egg allergic patients

注:ND*:未檢測。

間接ELISA具體步驟如下:將卵轉鐵蛋白稀釋至1.5 μg/mL,在一塊酶標板上包被100 μL,用PBS(磷酸鹽緩沖液)作陰性對照。4 ℃過夜后,用PBST(磷酸緩沖溶液溶液加上Tween-20)洗板3次,每次5 min;每孔加入250 μL 5%的脫脂乳,37 ℃封阻1 h,然后用PBST洗板3次;每孔加入100 μL 1∶20稀釋度的人血清池,37 ℃反應1 h,PBST洗板3次;每孔加入1∶5000稀釋的生物素標記羊抗人IgE二抗100 μL,37 ℃反應1 h,PBST洗板3次;每孔加入100 μL 1∶60稀釋的HRP-鏈霉素標記的親和素,37 ℃反應,PBST洗板3次;每孔加入100 μL現配的OPD顯色液后,置37 ℃恒溫箱中避光反應15 min,反應結束后,每孔加入2 mol/L H2SO4終止反應,于490 nm處檢測其OD值。

1.2.6 數據處理 采用SPSS 20.0進行數據處理和顯著性分析,采用p<0.05為顯著性差異;應用Origin9.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 卵轉鐵蛋白的身份鑒定和純度分析

制備的蛋白經質譜鑒定分析后,結果如表2所示。通過本地數據庫MASCOT檢索,所鑒定蛋白質與數據庫中編號為sp|P02789的卵轉鐵蛋白匹配度達100%。因此,可以確定制備的蛋白質為雞蛋卵轉鐵蛋白,分子量約79.55 ku,等電點為6.85。

本文首先采用SDS-PAGE考染方法鑒定卵轉鐵蛋白純度,結果顯示為100%。但是,世界衛生組織和國際免疫學聯合會過敏原物質標準化小組建立的過敏原物質標準化項目(Development of certified reference materials for allergenic products and validation of methods for their quantification,CREATE)推薦使用SDS-PAGE銀染方法鑒定過敏原純度[9],因為銀染的靈敏性是考染的50～100倍[10]。因此,所制備卵轉鐵蛋白經SDS-PAGE電泳后,經銀染方法顯色,結果如圖1所示,Quantity One灰度掃描顯示卵轉鐵蛋白純度為94.6%。

圖1 卵轉鐵蛋白的SDS-PAGE銀染圖Fig.1 SDS-PAGE profile of the prepared ovotransferrin by silver staining

2.2 卵轉鐵蛋白的結構表征及冷凍干燥對其結構的影響

為進一步鑒定所制備的卵轉鐵蛋白是否保持其天然結構,同樣參考CREATE項目[9]中推薦的方法,采用圓二色光譜、熒光探針光譜和核磁共振圖譜對制備卵轉鐵蛋白的二級結構、表面疏水性和三級結構進行表征,與文獻中報道的卵轉鐵蛋白結構進行比較。同時在制備過程中,為了保持蛋白質原有的生物性狀和活性,采用真空冷凍干燥的方法進行干燥[11-12]。

表2 卵轉鐵蛋白的質譜鑒定報告Table 2 The identity of ovotransferrin tested by Mass Spectrometry

2.2.1 卵轉鐵蛋白的二級結構 卵轉鐵蛋白的二級結構經圓二色光譜檢測,結果見圖2。從圖2中可知,卵轉鐵蛋白在195 nm和215 nm附近出現了蛋白質的二級結構特征峰,平均摩爾橢圓率最高在8000 deg·cm2/dmol左右,最低在-7000 deg·cm2/dmol左右,這與袁角建[7]和Jacobsen[13]的實驗結果吻合。凍干前后的卵轉鐵蛋白在195 nm附近都有一個明顯的正峰,為β-折疊的特征峰;在215 nm附近也都有一個明顯的負峰,為α-螺旋的特征峰,CD曲線的趨勢基本一致。將所得的圓二色光譜數據通過在線軟件進行分析,得到凍干前后卵轉鐵蛋白的二級結構含量(圖2B)。圖2B中顯示,凍干前后卵轉鐵蛋白的二級結構(包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲)含量基本一致。因此,制備的卵轉鐵蛋白凍干前后未發生明顯的變化,保持了天然二級結構。

圖2 卵轉鐵蛋白的二級結構Fig.2 The secondary structure of ovotransferrin

2.2.2 卵轉鐵蛋白表面疏水性 ANS熒光探針實驗結果如圖3所示,曲線的趨勢也與袁角建[7]的實驗結果相同。而卵轉鐵蛋白凍干前后的熒光曲線比較,在500 nm左右的熒光強度都達到最大,在550～600 nm處兩條曲線出現重疊,但在400～550 nm處,凍干卵轉鐵蛋白比未凍干卵轉鐵蛋白的熒光值略大,且熒光值在500 nm處達最大,表明真空冷凍干燥可能會引起卵轉鐵蛋白部分去折疊,導致分子內部更多的疏水基團暴露出來,從而提高蛋白表面疏水性。

圖3 凍干前后卵轉鐵蛋白表面疏水性的變化Fig.3 The surface hydrophobicity of ovotransferrin before and after lyophilization

2.2.3 卵轉鐵蛋白三級結構 抗原抗體特異性結合是二者空間結構契合、分子間力相互作用的結果,三級結構的穩定是卵轉鐵蛋白過敏原蛋白維持穩定免疫活性的基礎。卵轉鐵蛋白凍干前后的Bruker Avance 600 MHz1H核磁共振結果如圖4所示,與Jacobsen[13]的Bruker Avance 700 MHz1H結果相符,說明所制備卵轉鐵蛋白保持其天然三級結構。從圖4中可以發現,凍干后卵轉鐵蛋白的化學位移都分布在0～7 ppm處,其中4.8 ppm處都為D2O的化學位移,證明其三級結構未發生明顯的變化。

圖4 凍干前后卵轉鐵蛋白的1H核磁共振結果Fig.4 1H NMR spectra of the ovotransferrinbefore(a)and after(b)lyophilization

2.3 卵轉鐵蛋白的穩定性

穩定性是指在規定貯存和使用條件下,標準物質的含量、純度等特性量值保持在規定范圍內的能力[8]。本研究參考Itoh[14]和Johnston[15]相類似方法測試卵轉鐵蛋白的儲藏穩定性,研究結果可為用戶提供參考數據。不同蛋白質具有不同的穩定性,在儲藏過程中如果儲藏不當或者儲存時間過久很容易發生降解,其含量和純度都可能會發生變化。本研究將卵轉鐵蛋白凍干后置于4 ℃儲藏,連續監測5個月內卵轉鐵蛋白的含量和純度(圖5和圖6)。從圖5可以看出卵轉鐵蛋白4 ℃儲藏5個月內含量無顯著變化,圖6中采用高靈敏的銀染方法也顯示沒有降解片段。因此,卵轉鐵蛋白在4 ℃儲藏5個月內含量、純度未發生變化,穩定性好,滿足作為標準物質候選物的穩定性要求。

圖5 卵轉鐵蛋白儲藏過程中含量測定結果Fig.5 The content of the prepared ovotransferrin during the storage

圖6 卵轉鐵蛋白儲藏過程中銀染純度鑒定結果Fig.6 SDS-PAGE silver stainingfor purity of ovotransferrin during the storage

2.4 卵轉鐵蛋白與特異性IgE的結合能力

除了質量、純度的穩定性,合格的過敏原標準物質候選物還應進行免疫學性質的測定和免疫活性穩定性的測定[16-17]。過敏患者血清IgE結合能力的檢測是評價過敏原免疫活性的有效手段[18],本研究采用間接ELISA測定卵轉鐵蛋白的IgE人血清結合能力(圖7)。圖7中每個月的數據是三次重復測定所得的平均值,所得數據采用SPSS軟件進行顯著性差異分析,結果顯示儲藏過程中每個月卵轉鐵蛋白IgE結合能力與未凍干相比都無顯著性差異(p>0.05)。證明制備的卵轉鐵蛋白免疫活性穩定,可以滿足過敏原標準物質候選物的要求。

圖7 卵轉鐵蛋白儲藏過程中IgE結合能力的變化 Fig.7 IgE binding ability of ovotransferrin during storage

3 結論

本研究通過兩步法制備了較高純度的卵轉鐵蛋白,并對其身份、純度、結構、免疫學性質及其儲藏穩定性進行了詳細表征,結果表明:制備的蛋白經質譜鑒定為雞蛋卵轉鐵蛋白,分子量約79.55 ku,等電點為6.85,純度可達94.6%;結構分析顯示,分離純化的卵鐵蛋白保留了其天然結構特性,并且在分裝和凍干過程中,卵轉鐵蛋白的結構未產生明顯的變化;在4 ℃條件下儲藏5個月,卵轉鐵蛋白的含量、純度和免疫學活性均無明顯變化。制備的雞蛋過敏原卵轉鐵蛋白凍干產品符合標準物質候選物的要求,可為最終申報卵轉鐵蛋白有證標準物質提供關鍵數據支撐。

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Study on hen egg allergen ovotransferrinas a reference material candidate

YUAN Jin1,2,ZHOU Huang3,TONG Ping1,WU Zhi-hua1,4,CHEN Hong-bing1,4,GAO Jin-yan2,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Department of Food Science,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Jian Vocational and Technical College of Modern Agriculture and Forestry,Ji’an 343000,China;4.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Objective:To guarantee ovotransferrin(OVT)quality as a food allergen reference material candidate,ovotransferrin was prepared with high purity,and the physicochemical and immunological properties were characterized well. Methods:Ovotransferrin was prepared through two step chromatographies,followed by being subdivided and lyophilized. Afterwards,the prepared ovotransferrin was identified by MALDI TOF/TOF,and the purity was tested by SDS-PAGE with silver staining,followed by measuring the structure by circular dichroism spectroscopy,fluorescence spectroscopy and1H NMR. The content and stability were detected by Bradford protein assay and SDS-PAGE with silver staining. The potential allergenicity of ovotransferrin was assessed by ELISA. Results:The prepared protein was identified to be egg ovotransferrin by MALDI TOF/TOF,with a molecular weight of 79.55 ku and a pI of 6.85. The purity of ovotransferrin was 94.6%. The prepared ovotransferrin maintained its natural structure,and the lyophilization had no significantly effect on ovotransferrin structure. The stability,quality and IgE-binding capacity showed no significant difference within 5 months storage period at 4 ℃. Conclusion:The prepared egg allergen ovotransferrin could be qualified as a reference material candidate.

egg allergen;ovotransferrin;reference material candidate

2016-09-02

袁錦(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：營養與食品衛生，E-mail：yuan2jin@126.com。

*通訊作者:高金燕(1967-)，女，碩士，教授，研究方向：食品營養與安全，E-mail：chbgjy@hotmail.com。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)項目(2013AA102205)；科技部國際科技合作項目(2013DFG31380)；國家自然科學基金(31301524)；江西省自然科學基金計劃(20133ACB20009，20142BAB214001)；食品科學與技術國家重點實驗室項目(SKLF-ZZA-201612,SKLF-QN-201514)。

TS253.4

A

:1002-0306(2017)04-0342-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.056