不對稱PCR技術及其在食源性致病菌檢測中應用的研究進展

李 凡,許恒毅

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

不對稱PCR技術及其在食源性致病菌檢測中應用的研究進展

李 凡,許恒毅*

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

不對稱PCR技術是獲取單鏈DNA的一種重要方法。將不對稱PCR技術與常用核酸檢測方法結合,具有較高的靈敏度和較強的特異性,已被廣泛應用食源性致病菌檢測中。本文對不對稱PCR技術進行簡介,綜述近年來其在食源性致病菌檢測中的應用概況,并對其存在的問題進行了簡單闡述。

不對稱PCR技術,食源性致病菌,檢測

食品安全一直是備受世界各地政府關注的焦點問題,而食源性致病菌是影響食品安全的主要原因之一。據報道,美國每年由致病菌引起的食源性疾病暴發事件達940萬例,其中有55961例住院病例和1351例致死病例[1]。有資料統計表示,2016年第二季度我國國家食品藥品監督管理總局抽檢191672批次食品樣品,不合格樣品4690批次,其中食品中微生物污染問題占不合格總數的25.5%[2]。因此,建立快速、靈敏檢測食源性致病菌的方法尤為重要。

目前用于食源性致病菌檢測的方法主要為傳統培養法,而傳統檢測方法一般需細菌分離、培養及生理生化鑒定,耗時、操作繁瑣,已越來越不能滿足對各種食源性致病菌快速檢測的需求[3-5]。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)由美國Cetus公司的Mullis等人發明并于1985年推出。該技術彌補了傳統檢測方法的不足,具有快速簡便、費用低等優點,已被廣泛應用于各類食品中食源性致病菌的篩查[6-7]。不對稱PCR技術(asymmetric PCR,aPCR)是PCR的一種,可擴增出大量單鏈DNA(single strand,ssDNA),ssDNA與雙鏈DNA相比,由于不存在互補雙鏈的競爭性結合,其雜交效率及檢測靈敏度更高[8],利用這一特點建立基于aPCR的檢測方法,可有效提高檢測的靈敏度與特異性,在食源致病菌檢測中具有良好的應用前景。本文對不對稱PCR技術進行簡介,綜述近年來其在食源性致病菌檢測中的應用概況,并對其存在的問題進行了簡單闡述。

1 不對稱PCR技術的原理

圖1 aPCR原理圖Fig.1 The schematic diagram of aPCR

aPCR是指在PCR反應體系中加入不等量的一對引物,經PCR擴增后產生大量的ssDNA的技術。其反應原理和操作步驟和普通PCR相似,主要區別是體系中添加了不等量的一對引物,分別稱為非限制引物與限制性引物,兩者比例一般為100∶1～50∶1。在模板DNA、dNTP以及適當緩沖液存在的條件下,依賴于DNA聚合酶的催化,對不等量引物所結合的DNA片段進行擴增,在PCR擴增的10～15個循環中,其擴增產物主要是雙鏈DNA,但當限制性引物消耗完后,非限制性引物引導PCR反應進而產生大量ssDNA(見圖1)。

表1 基于aPCR的檢測方法在食源性致病菌檢測中應用的比較Table 1 Comparison for aPCR combining with other technologies for the detection of foodborne pathogens

2 基于aPCR檢測食源性致病菌的技術

目前,大部分基于PCR技術的核酸檢測需對DNA擴增產物進行凝膠電泳分析操作,檢測靈敏度相對較低且涉及溴化乙錠(EB)等致癌物的使用,可能會對環境及操作人員健康造成危害[9-10]。aPCR技術是獲取ssDNA的一種重要方法,將aPCR與各種常用的核酸檢測方法進行結合,取代凝膠電泳程序,可以達到縮短檢測周期、提高靈敏度和增強特異性等作用,有效避免常規PCR檢測方法的不足。表1詳細比較了基于aPCR的檢測方法在食源性致病菌檢測中應用的優缺點。

2.1 aPCR-層析技術

層析技術是以條狀纖維層析材料為固相,借助毛細管作用使樣品中的待測物與層析材料上的受體發生高特異性反應,通過酶促顯色反應或直接使用可目測的著色標記物,對樣品進行檢測與分析[21]。將aPCR技術與層析技術相結合建立的核酸層析技術,通過試紙條可在10～15 min對擴增產物進行檢測[11]。該技術在保證PCR高靈敏度的前提下,有效提高特異性,減少分析時間。Liu等[11]結合aPCR與層析技術同時檢測大腸桿菌O157∶H7、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌,分別根據大腸桿菌O157∶H7基因rfbE、單核細胞增生李斯特菌的hlyA以及金黃色葡萄球菌nuc為目的基因設計引物和捕獲探針,將捕獲探針包被在層析試紙檢測區,通過雜交反應對目的ssDNA進行捕獲,加入以金納米顆粒標記的單鏈核酸序列作為信號探針進行檢測,通過裸眼觀察,同時檢測3株菌的最低檢測限均達到1 pg/μL DNA。此外,通過已知序列間雜交反應以及層析技術不需進行結合標記物與游離標記物的分離,提高了檢測靈敏度及特異性,簡化了分析過程。

2.2 aPCR-ELISA

酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種非放射性標記免疫分析技術。PCR與ELISA結合建立的PCR-ELISA方法,是將預先固定在微孔板上的捕獲探針與PCR產物在一定條件下進行雜交反應,免疫復合物所攜帶的酶分子可將特定的底物分子轉化為具有特定顏色的化合物,通過定性或定量分析有色產物量確定樣品中待測物含量[22]。該方法相對于凝膠光密度定量,其靈敏度、特異性、準確度均有較大的提高,且對儀器要求較低。Li等[23]采用PCR-ELISA法對嬰兒配方奶粉中的阪崎腸桿菌進行檢測,以rpoB為目的基因設計引物并進行PCR擴增,將擴增產物用于ELISA檢測,在供試39株參考菌株中,19株阪崎腸桿菌用該方法檢測都得到很好的陽性結果,其他20株非目的菌都表現出陰性結果,特異性達到100%。未經富集培養,檢測靈敏度達1.06×103CFU/mL,相對于凝膠電泳提高了3個數量級。Hong等[24]將PCR技術與ELISA方法結合,檢測禽肉中沙門氏菌和彎曲桿菌,檢測限分別達到2×102和4×101CFU/mL,與常規PCR相比,分別提高了100～1000倍。雖然PCR-ELISA方法優點甚多,然而PCR產物需進行熱變性使其從雙鏈變成單鏈,步驟繁瑣且存在互補雙鏈,影響其雜交效率。采用aPCR進行檢測,可以避免常規PCR技術的缺陷。目前,aPCR-ELISA方法主要應用于病毒的檢測[12-13],還沒有文獻報道其在食源性致病菌檢測中的應用。

2.3 aPCR-納米金比色法

納米金比色法是利用納米金(gold nanoparticles,AuNPs)分散狀態與集聚狀態顏色的差異來設計的一種直觀檢測技術[25]。不同聚集狀態的AuNPs呈現出明顯的色差,當溶液中AuNPs呈分散狀態時,宏觀上表現為紅色;當AuNPs發生團聚呈聚集狀態時,表現為藍紫色。將與待測DNA互補的兩端探針序修飾到AuNPs表面,若探針與溶液中目標物質作用前后能夠引起AuNPs狀態的改變,溶液的顏色就會產生相應的變化。將aPCR方法與納米金比色技術相結合,能極大的縮短檢測時間,具有PCR的高靈敏度與分子雜交的高特異性的雙重優勢,同時可直觀檢測目的致病菌,成本低、無需依賴大型儀器。Deng等[14]將aPCR和納米金比色法結合檢測炭疽桿菌,利用aPCR擴增得到的大量ssDNA,根據目的ssDNA合成寡聚核苷酸序列,將其修飾在納米金粒子表面作為檢測探針,當加入靶核苷酸序列時,靶序列通過DNA的互補識別與納米金探針的核苷酸雜交,由于納米金粒子距離變小,溶液的顏色從紅色變成藍紫色。結果表明,這兩種方法的結合極大的縮短了檢測時間,雜交反應僅需5 min,檢測靈敏度可達到10 pg/5 μL DNA。Quintela等[16]結合aPCR與納米金比色法檢測牛肉和藍莓中的產志賀毒素大腸桿菌,經過6 h富集培養后,檢測限高達10 CFU/g,比色檢測時間低于1 h,特異性達到100%,與非產志賀毒素的大腸桿菌均沒有發生交叉反應。Deng等[15]報道了用aPCR結合納米金比色法對炭疽桿菌進行檢測,通過裸眼觀察靈敏度達到10 pg DNA,比色檢測時間僅需10 min,與其余非目的芽孢桿菌未見任何交叉干擾,表現出很好的特異性。

2.4 aPCR-生物傳感器

生物傳感器是一種小型、便攜的分析裝置,是利用待測物質與生物活性材料發生生物化學反應,所產生的信號由換能器轉換成電信號,再經信號放大裝置輸出,最終獲得待測物濃度的信息[26]。生物傳感器具有靈敏度高、操作簡單、響應和檢測迅速、攜帶方便等優點。將生物傳感器與aPCR結合,可有效提高特異性,能夠對微生物進行快速、準確的檢測[27]。目前,基于aPCR的生物傳感器根據轉換原理的不同,主要有電化學生物傳感器和光學生物傳感器兩類。

2.4.1 aPCR-電化學生物傳感器 電化學生物傳感器是以電極作為能量轉換元件,利用在電極介質面上進行的電化學反應將被測化學信號轉換為電信號來分析待測物的一種生物傳感器[28]。將電化學生物傳感器與aPCR結合用于病原菌檢測,具有靈敏度高、特異性好、快速便攜等優點。Low等[17]應用電化學DNA傳感器檢測霍亂弧菌的aPCR擴增產物,將雙探針夾心雜交方法與免疫磁性分離技術及電化學DNA傳感器技術緊密結合,通過比對生物體基因的互補堿基對,檢測修飾電極在待測溶液中電化學信號的變化來確定靶細菌的DNA濃度。結果發現,該方法具有100%的特異性,檢測靈敏度為103CFU/mL。Das等[18]將aPCR技術與電化學生物傳感器結合檢測炭疽桿菌,以巰基修飾的寡核苷酸探針為識別元件,PCR擴增后產物未經純化直接與探針進行特異性雜交,檢測限達到1 pmol/L DNA。Wen等[29]采用aPCR-電化學生物傳感器檢測大腸桿菌,將三維DNA四面體探針固定到傳感器芯片表面,以uidA為目的基因進行aPCR擴增得到的大量靶序列,靶序列通過DNA的互補識別與四面體探針及信號探針進行雜交,進而檢測出目的菌。結果表明,這兩種方法的結合極大的提高了檢測靈敏度,檢測限為0.2 pg/μL DNA,相比傳統的ssDNA檢測方法提高了3個數量級。

2.4.2 aPCR-光學生物傳感器 光學生物傳感器是將反應產生的化學信號轉換為光信號的一種生物傳感器,其最大的優點是抗外界干擾能力強。光學生物傳感器的檢測模式有反射、吸收、熒光和化學發光等,在食源性致病菌檢測中最有應用前景的技術主要包括表面等離子共振技術(surface plasmon resonance,SPR)等[30]。SPR是一種基于反射光譜的非標記檢測技術,它先將已知生物分子鍵合在生物傳感器表面,再加入能與之產生相互作用的目標生物分子,生物分子間的結合引起的光學信號隨機被SPR傳感器轉化為電信號進行檢測分析。將SPR與aPCR結合用于病原菌檢測,具有快速、靈敏度、檢測樣本無需標記及實時監測生物分子反應動力學過程等優點。Zhang等[19]結合aPCR與光學SPR傳感器檢測沙門氏菌,將寡核苷酸探針通過生物素-鏈霉親和素作用固定到傳感器芯片表面,利用不對稱PCR擴增出目的ssDNA,與芯片表面探針進行堿基互補配對,檢測限達到0.5 nmol/L DNA,雜交反應時間僅需15 min。Lei等[31]用aPCR結合光學SPR傳感器檢測沙門氏菌,將巰基化的探針通過Au-S鍵固定傳感器芯片金膜表面,利用aPCR擴增出靶序列,靶序列通過DNA的互補識別與巰基化探針及鏈霉親和素的適配子進行夾心操作,檢測靈敏度可達到60 CFU/mL。

2.5 aPCR-寡聚核苷酸芯片技術

寡聚核苷酸芯片技術是將特定的DNA寡聚核苷酸片段(探針)固定于支持物表面上,產生二維核苷酸探針陣列,然后與標記的樣本雜交,通過檢測雜交信號來實現對生物樣本快速、并行、高效地檢測[32]。aPCR與寡聚核苷酸芯片技術結合,利用aPCR技術擴增出一定長度的寡核苷酸單鏈探針代替全長cDNA點樣,制成芯片,可減少非特異雜交,有效區分有同源序列的基因,雜交溫度均一,提高雜交效率,具有高通量、高集成和微型化等優點。Zhu等[20]采用多重aPCR方法與寡聚核苷酸芯片技術結合,對革蘭氏陰性菌中10種內酰胺酶基因及六種重要的點突變型β-內酰胺酶基因進行檢測,結果發現,該方法能夠有效地從參考株和111份臨床分離株中檢測出抗性基因,可高通量、特異性地鑒別出病原微生物的亞種與變異。雖然寡核苷酸微陣列在病原體基因檢測、基因表達比較、基因突變分析以及基因序列分析等領域具有較多優勢。但是價格昂貴、定量分析功能不強等因素也制約著該方法在基層實驗室的應用。

3 總結與展望

食源性致病菌是影響食品安全的主要因素之一。如何從復雜的食品樣品中高靈敏和高特異的檢測出數量極少的食源性致病菌,一直是食品安全領域一個亟待突破的環節。現今,隨著分子生物學技術的迅猛發展,aPCR技術各方面性能不斷獲得完善,已被廣泛應用于食源性致病菌的檢測。aPCR技術相對于傳統的平板計數方法,極大地縮短了節約時間和工作量;將aPCR技術與常用核酸檢測方法結合,相比于常規PCR,其特異性和靈敏度均取得了大幅度提高,適應食品微生物檢驗發展需要。但是,基于aPCR技術的食源性致病菌檢測方面,仍存在一些問題需要不斷地完善和改進,如無法區分活菌和死菌而產生假陽性結果、食品中存在的復雜抑制因子干擾aPCR擴增等,這些問題限制了aPCR技術在食源性致病菌檢測方面的進一步發展。采用核酸交聯劑如疊氮溴化丙錠(PMA)、疊氮溴化乙錠(EMA)等[33-34]有效抑制死菌DNA的擴增,可準確地反應樣本中活菌數量。此外,對樣品前處理技術進行改進,如結合磁分離技術對目的菌進行高效富集與分離,不僅能去除基質干擾,而且能提高aPCR的靈敏度。因此,aPCR配合其他新型試劑或方法能更大程度地體現其應用價值,在檢測食源性致病菌方面具有較好的前景。

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Asymmetric polymerase chain reaction technology and its application in detection of foodborne pathogens

LI Fan,XU Heng-yi*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Asymmetric PCR(aPCR)is an important method to obtain single stranded DNA. This technology combined with commonly nucleic acid detection methods were widely used for the detection of foodborne pathogens due to its high sensitivity and specificity. In this paper,aPCR was introduced,and the application of aPCR in the detection of foodborne pathogens during the past 10 years was reviewed,furthermore,the problems of aPCR were briefly discussed.

asymmetric polymerase chain reaction;foodborne pathogens;detection

2016-07-25

李凡(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與檢測，E-mail：349465359@qq.com。

*通訊作者:許恒毅(1981-)，男，博士，副研究員，研究方向：食品生物技術，E-mail：kidyxu@163.com。

江西省青年科學家(井岡之星)培養對象項目(20142BCB23004)；食品科學與技術國家重點實驗室青年研究基金項目(SKLF-QN-201504)。

TS207.4

A

:1002-0306(2017)04-0379-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.063