四種新疆發酵駝乳源益生菌對小鼠的免疫調節作用

肖雪筠,張 奕,新華·那比

(新疆醫科大學藥理教研室,新疆烏魯木齊 830011)

四種新疆發酵駝乳源益生菌對小鼠的免疫調節作用

肖雪筠,張 奕,新華·那比

(新疆醫科大學藥理教研室,新疆烏魯木齊 830011)

目的:探究新疆傳統發酵駝乳及乳酪乳清中分離出的四種益生菌對環磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的調節和保護作用。方法:利用環磷酰胺(80 mg·kg-1,ip)制造免疫低下小鼠模型,隨機分為11個組,分別灌胃高、低劑量的馬乳酒樣乳桿菌,東方伊薩酵母菌,高加索酸奶乳桿菌以及戊糖乳桿菌。結果:與模型組相比,四種益生菌組小鼠體重、脾臟、胸腺指數以及脾淋巴細胞增殖活力均有增加(p<0.01);血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)以及尿素氮(UREA)水平出現不同程度降低(p<0.05);Th1型細胞因子增多(p<0.01)。結論:四種益生菌能夠部分緩解環磷酰胺對小鼠免疫抑制作用,調節Th1/Th2平衡,起到免疫調節和保護作用。

益生菌,免疫,細胞因子

新疆傳統發酵駝乳及乳酪乳清是新疆少數民族的日常飲品,富含多種營養元素,具有提高免疫力[1-2]、抗炎[3]、抗氧化[4]和抗癌[5]的作用。其中含有的多種益生菌是其發揮活性的物質基礎之一。研究發現,新疆傳統發酵駝乳中含有十種乳酸菌,四種酵母菌,其中許多益生菌都能夠調節機體非特異性和特異性免疫應答[6],改善慢性肝炎患者的肝功能[7-8],促進小鼠脾細胞IL-4的產生,增強小鼠免疫功能[9]。目前,國內外主要集中于研究發酵乳制品的免疫調節作用,對其中某種益生菌的免疫活性及免疫調節機制有待進一步研究,本文針對上述問題進行了闡述,為新疆發酵乳制品和微生態制劑的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRS肉湯培養基、麥芽汁液體培養基、MRS瓊脂培養基、沙氏瓊脂培養基 均購于青島日水生物技術有限公司;注射用環磷酰胺 江蘇盛迪醫藥有限公司;雙歧桿菌活菌膠囊 麗珠醫藥有限公司;戊巴比妥鈉 德國默克公司;刃天青 Sigma公司;亞甲藍和CCK-8 Solarbio公司;CBA試劑盒 美國BD公司;小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒 天津灝洋生物科技公司;實驗動物采用健康雄性Balb/c小鼠 (20±2) g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供,生產許可證:SCXK(新)2011-0001,飼養環境為光照12 h/d,室溫(21±2) ℃,濕度為50%±5%,普通飼料喂養;菌株來源 均從新疆傳統發酵駝乳和乳酪乳清樣品中分離出的四種益生菌,分別為東方伊薩酵母菌(Issatchenkiaorientalis)、高加索酸奶乳桿菌(Lactobacilluskefir)、馬乳酒樣乳桿菌(Lactobacilluskefiranofaciens),戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus),并由中國農業科學院微生物研究所鑒定。

AY120型電子分析天平 日本島津公司;全自動酶標儀 賽默飛公司;TDL-5A型離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司;MLS-3750型高壓滅菌鍋 上海博訊公司;厭氧產氣袋和厭氧盒 日本三菱公司;SANYO CO2孵箱 日本三洋公司;AC-S型潔凈工作臺 蘇州安泰技術有限公司;BS-120型全自動生化分析儀 深圳邁瑞公司;Aria II型流式細胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種選擇及活化與擴大培養 將來源于新疆發酵駝乳及乳酪乳清中的四種益生菌[10-13]分別進行活化與擴大培養。將乳酸菌與酵母菌凍干粉溶解于少量滅菌蒸餾水中,用無菌槍頭吸取少量凍干粉溶解液置于MRS固體培養基和沙氏瓊脂培養基中涂面和劃線,乳酸菌于37 ℃下培養48 h,酵母菌于37 ℃下培養48～72 h后,挑取乳酸菌單個菌株于MRS肉湯液體培養基中,于37 ℃培養24 h,活化2～3代。挑取單個酵母菌菌株于麥芽汁液體培養基中,于35 ℃培養24 h,活化2～3代。取上述菌懸液各5 mL,經3000 r/min離心10 min,收集菌體,用0.9%生理鹽水洗滌2～3次后,重懸制成菌懸液,于4 ℃存放備用。

1.2.2 乳酸菌與酵母菌活力測定 采用刃天青法測定乳酸菌活力。在9 mL生理鹽水中加入1 mL菌懸液和0.005%刃天青溶液1 mL,在36.7 ℃培養35 min,觀察溶液褪色時間以及顏色變化[14]。

采用亞甲藍還原實驗法測定酵母菌活力,在96孔板中加入125 μL亞甲藍溶液(8 mg/L)和等體積酵母菌溶液,用125 μL酵母溶液和等量去離子水混合為對照,測定660 nm處吸光度,每隔30 s記錄一次數值變化[15]。

1.2.3 實驗動物分組與模型制備 取Balb/c雄性小鼠110只,適應性飼養1周,隨機分為正常對照組、免疫低下模型組、陽性對照組和高加索酸奶乳桿菌、東方伊薩酵母菌、馬乳酒樣乳桿菌、戊糖乳桿菌高劑量組和低劑量組,共11組,每組10只。普通飼料喂養,除正常對照組以外,其余10組連續3 d腹腔注射環磷酰胺(80 mg/kg)[16],自由進水,每周稱重2～3次。四種益生菌組分別灌胃低劑量(0.5×107CFU/mL)和高劑量(0.5×109CFU/mL)菌懸液0.2 mL,陽性對照組灌胃雙歧桿菌(0.5×107CFU/mL)菌懸液,模型組與正常對照組給予同體積生理鹽水。干預第4周末,小鼠禁食不禁水12 h,稱重,麻醉,眼球取血,分離血清,取脾臟、胸腺,用生理鹽水清洗，濾級吸干表面水分后稱重，計算臟器重量與小鼠體重比值，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 脾淋巴細胞增殖實驗 采用CCK-8法測定小鼠脾淋巴細胞活力。取灌胃后各組小鼠,無菌條件下剖開小鼠腹腔取脾,剪碎,研棒研磨過200目篩網,收集分離的脾細胞懸液,1500 r/min離心3 min,棄上清。加紅細胞裂解液8 mL,混勻,靜置5～6 min,待紅細胞完全破碎,2000 r/min離心3 min,棄上清,Hank’s液洗1～2遍,用RPMI-1640(含10%胎牛血清)重懸細胞,計數調整細胞濃度為5×106個/mL備用。96孔板中加入100 μL細胞懸液和10 μL CCK-8,37 ℃,5% CO2孵箱孵育4 h,450 nm處測定吸光度,計算淋巴細胞活力。

1.2.5 小鼠血清生化指標測定 采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清肌酐(CREA),尿素氮(UREA),谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)水平。

1.2.6 小鼠血清細胞因子測定 采用BD CBA檢測試劑盒測定小鼠血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10,按說明書進行操作。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 四種益生菌對小鼠體重的影響

如表1可知,干預一周后,與正常對照組相比,模型組小鼠體重顯著降低(p<0.05),隨后幾周與正常組相比差異極顯著增大(p<0.01)。灌胃第1周后,與模型組相比,戊糖乳桿菌高劑量組小鼠體重極顯著增加(p<0.01),除東方伊薩酵母菌低劑量組體重顯著增加(p<0.05)外,其余益生菌處理組體重均出現極顯著增加(p<0.01)。雙歧桿菌具有免疫調節作用,被用作陽性對照。與模型組相比,雙歧桿菌組體重極顯著增加(p<0.01)。第3周時,除高加索酸奶乳桿菌低劑量組外,戊糖乳桿菌低劑量組、馬乳酒樣乳桿菌低劑量組、馬乳酒樣乳桿菌高劑量的小鼠體重極顯著高于雙歧桿菌組小鼠(p<0.01),戊糖乳桿菌高劑量組顯著高于雙歧桿菌組(p<0.05);東方伊薩酵母菌兩個劑量組小鼠體重均極顯著低于雙歧桿菌組。以上數據說明灌胃3周,除東方伊薩酵母菌兩個劑量組外,其余三種益生菌對維持小鼠體重的作用優于陽性藥組。干預處理4周,除東方伊薩酵母菌低劑量組外,其余益生菌處理組小鼠的體重均極顯著高于模型組(p<0.01),但東方伊薩酵母菌低劑量組小鼠體重極顯著低于模型組(p<0.01)。以上結果表明,四種益生菌能夠使小鼠體重維持在正常水平,對環磷酰胺導致的免疫抑制具有一定改善作用。第4周，除馬乳酒樣乳桿菌低劑量組外,與雙歧桿菌相比,其余益生菌組小鼠體重極顯著降低(p<0.01),馬乳酒樣乳桿菌低劑量組小鼠體重極顯著增加(p<0.01),說明馬乳酒樣乳桿菌低劑量組的作用優于陽性藥組。

表1 四種益生菌對免疫低下Balb/c小鼠體重(g)的影響Table 1 Effects of four probiotics on body weights(g)of Balb/c

注:與正常組比較，a表示差異顯著(p<0.05),A表示差異極顯著(p<0.01);與模型組比較，b表示差異顯著(p<0.05),B表示差異極顯著;與雙歧桿菌組比較，d表示差異顯著(p<0.05),D表示差異極顯著(p<0.01);表2～表6同。

2.2 四種益生菌對小鼠臟器指數的影響

由表2可見,與正常對照組相比,模型組脾臟及胸腺指數極顯著降低(p<0.01);與模型組相比,四種益生菌組和雙歧桿菌組脾臟及胸腺指數均極顯著升高(p<0.01),與雙歧桿菌組相比,各益生菌處理組脾臟指數均出現極顯著降低(p<0.01)。高加索酸奶乳桿菌高劑量組胸腺指數極顯著降低(p<0.01);高加索酸奶乳桿菌低劑量組,馬乳酒樣乳桿菌高劑量組,東方伊薩酵母菌高劑量組顯著增加(p<0.05);戊糖乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌、東方伊薩酵母菌三個低劑量組極顯著升高(p<0.01),其余無明顯影響。以上結果結合體重變化說明免疫低下小鼠模型造模成功且四種益生菌主要作用在于能夠不同程度的提高免疫低下小鼠的脾臟和胸腺指數,使脾和胸腺代償性增生,增強小鼠脾臟、胸腺免疫功能。

表2 四種益生菌對免疫低下Balb/c小鼠臟器指數的影響Table 2 Effects of four probiotics on organ index of immunosuppressed Balb/c mice

2.3 四種益生菌對小鼠脾淋巴細胞活力的影響

由表3可知,與正常對照組相比,模型組脾淋巴細胞活力極顯著下降(p<0.01),雙歧桿菌組脾淋巴細胞活力極顯著升高(p<0.01);與模型組相比,四種益生菌處理組的脾淋巴細胞活力均極顯著升高(p<0.01);與陽性藥組相比,戊糖乳桿菌高劑量組,馬乳酒樣乳桿菌低劑量組脾淋巴細胞活力極顯著升高(p<0.01),戊糖乳桿菌低劑量組,馬乳酒樣乳桿菌高劑量組,東方伊薩酵母菌高劑量組顯著升高(p<0.05)。以上結果說明四種益生菌都不同程度的提高免疫低下小鼠的脾淋巴細胞活力,進而改善環磷酰胺導致的小鼠免疫功能低下。其中戊糖乳桿菌組,馬乳酒樣乳桿菌組,東方伊薩酵母菌高劑量組提高小鼠脾淋巴細胞活力的作用要優于雙歧桿菌組。

表3 四種益生菌對免疫低下Balb/c小鼠脾臟淋巴細胞活力的影響Table 3 Effects of four probiotics on activities of spleen lymphocyte in Balb/c mice

2.4 四種益生菌對小鼠血清生化指標的影響

如表4所示,與正常對照組相比,模型組AST、UREA極顯著升高(p<0.01),ALT顯著升高(p<0.05),而CREA變化不顯著(p>0.05)。與模型組相比,除東方伊薩酵母菌低劑量組和馬乳酒樣乳桿菌高劑量組外,其余益生菌組小鼠血清AST均出現極顯著下降(p<0.01);除戊糖乳桿菌和東方伊薩酵母菌的低劑量組ALT出現顯著升高之外,其余益生菌處理組ALT均極顯著下降(p<0.01);除戊糖乳桿菌低劑量組和雙歧桿菌組外,其余組UREA極顯著下降(p<0.01);除雙歧桿菌組、戊糖乳桿菌低劑量組和高加索酸奶乳桿菌高劑量組外,其余組CREA均極顯著降低(p<0.01)。與雙歧桿菌組相比,除馬乳酒樣乳桿菌組和東方伊薩酵母菌低劑量組,其余組AST極顯著降低(p<0.01);除戊糖乳桿菌和東方伊薩酵母菌低劑量組外,其余益生菌組ALT極顯著降低(p<0.01);除戊糖乳桿菌低劑量組外,其余組UREA顯著下降(p<0.01);除戊糖乳桿菌低劑量組和高加索酸奶乳桿菌高劑量組外,其余組CREA極顯著降低(p<0.01);戊糖乳桿菌和高加索酸奶乳桿菌高劑量組的AST極顯著降低,提示這兩個劑量組可能具有抗炎,減輕肝臟損傷的作用,并且這兩組AST水平也極顯著低于雙歧桿菌組(p<0.01)。以上結果說明造模后主要顯示小鼠肝功能受損,總體來說,各益生菌組都能夠有效地調節免疫低下小鼠的肝腎功能,維持正常的肝腎代謝。

表4 四種益生菌對小鼠血清AST,ALT,UREA和CREA的影響Table 4 Effects of four probiotics on serum AST,ALT,UREA,and CREA in immunosuppressed

表5 四種益生菌對免疫低下小鼠血清細胞因子的影響Table 5 Effects of four kinds of probiotics suspensions on serum cytokines in immunosuppressed

2.5 四種益生菌對小鼠血清細胞因子的影響

由表5可知,與正常對照組相比,模型組IL-2顯著下降(p<0.05),IFN-γ極顯著下降(p<0.01),IL-4和IL-10水平極顯著升高(p<0.01)。與模型組相比,雙歧桿菌組IL-2顯著升高(p<0.05),IFN-γ極顯著升高(p<0.01),IL-10極顯著降低(p<0.01);戊糖乳桿菌兩個劑量組小鼠血清IL-2顯著升高(p<0.05),IFN-γ極顯著升高(p<0.01),戊糖乳桿菌低劑量組IL-4、IL-6和IL-10均極顯著降低(p<0.01),戊糖乳桿菌高劑量組IL-4、IL-10極顯著降低(p<0.01),并使TNF-α顯著升高(p<0.05);高加索酸奶乳桿菌兩個劑量組都能夠使血清IL-2顯著升高(p<0.05),IFN-γ極顯著升高(p<0.01),高加索酸奶乳桿菌低劑量組IL-6出現顯著下降(p<0.05),IL-10顯著升高(p<0.05),高劑量組IL-4、IL-6發生極顯著下降(p<0.01);馬乳酒樣乳桿菌兩個劑量組能使IL-2顯著升高(p<0.05),IFN-γ極顯著升高(p<0.01),高劑量組還能使TNF-α極顯著升高(p<0.01),IL-4、IL-10極顯著降低(p<0.01),馬乳酒樣乳桿菌低劑量組使IL-6極顯著降低(p<0.01);東方伊薩酵母菌組對TNF-α無明顯影響,但是兩個劑量組可顯著升高血清IL-2(p<0.05),極顯著升高IFN-γ(p<0.01),極顯著降低IL-6含量(p<0.01),低劑量組極顯著降低IL-4和IL-10水平(p<0.01)。

結果表明小鼠造模后,TNF-α、IL-2和IFN-γ等三種Th1型細胞因子含量降低,IL-4、IL-6和IL-10等三種Th2型細胞因子含量增加,Th1/Th2平衡向Th2方向移動。給予益生菌灌胃處理后,小鼠免疫應答狀態總體向Th1方向漂移。四種益生菌都能造成血清細胞因子含量在不同程度上發生改變,使免疫應答狀態總體向Th1方向漂移,改善機體免疫抑制狀態和免疫低下小鼠的Th1/Th2失衡,從而提高和恢復免疫力。

3 結論

本課題發現分離自新疆傳統發酵駝乳及乳酪乳清中出的四種益生菌能夠不同程度提高免疫低下小鼠的體重、脾臟指數和脾淋巴細胞活力,不同程度上保護小鼠肝腎功能和正常代謝,通過調節細胞因子含量,糾正免疫失衡,改善機體免疫抑制狀態。上述四種益生菌的作用與劑量高低是否具有線性關系還有待進一步研究,因此將益生菌與臨床治療相結合時還需要考察應用劑量、各個益生菌之間的應用比例以及相互作用等多方面的影響。

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Immunoregulatory effects of four probiotics derived from Xinjiang fermented camel milk in mice

XIAO Xue-jun,ZHANG Yi,XINHUA·Nabi

(Department of Pharmacology,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

Objective:To expolre the immunoregulatory and protective effects of four kinds of probiotics that were isolated from Xinjiang traditional fermented camel milk and cheese whey. Method:Use CTX(80 mg/kg,ip)to establish the immunosuppressive mouse model,then they were randomly assigned into 11 groups,we gave high and low dose ofLactobacilluskefiranofaciens,yeast Issa Oriental,Lactobacilluskefir,andLactobacilluspentosus. Result:Compared with the model group,the body weight,spleen,thymus index,and lymphocyte proliferation ablity were increased(p<0.01),AST,ALT,UREA were decreased(p<0.05),the content of Th1 cytokines were increased(p<0.01). Conclusion:These four probiotics could alleviated the immunosuppressive effects,regulated the Th1/Th2 balance,and played the role of immune regulation and protection.

probiotics;immunity;cytokines

2016-06-28

肖雪筠(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：心血管及免疫藥理，E-mail:xiaoxj_0101@126.com。

*通訊作者:新華·那比(1967-)，女，博士，教授，主要從事心血管藥理學方面的研究，E-mail:xinhua99@hotmail.com。

國家自然科學基金(81160344)。

TS201.4

A

:1002-0306(2017)04-0337-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.055