貯藏溫度對冷鮮羊肉微生物菌群生長變化的影響

孫丹丹,盧士玲,*,李開雄,張艷麗,張 杰

(1.石河子大學食品學院,新疆石河子 832000;2.新疆綠翔牧業有限責任公司,新疆塔城 834601)

貯藏溫度對冷鮮羊肉微生物菌群生長變化的影響

孫丹丹1,盧士玲1,*,李開雄1,張艷麗2,張 杰2

(1.石河子大學食品學院,新疆石河子 832000;2.新疆綠翔牧業有限責任公司,新疆塔城 834601)

本實驗以傳統微生物的檢測方法結合16S rDNA V6～V8可變區聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳指紋圖譜技術(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)研究在10、4 ℃及冰溫貯藏條件下,冷鮮羊肉菌相的動態變化及其貨架期。經微生物計數及DGGE圖譜分析,10 ℃貯藏條件下,6 d已達到腐敗臨界值,其優勢腐敗菌為腸桿菌屬、乳酸菌屬等;4 ℃條件下,貨架期為27 d,優勢腐敗菌有假單胞菌屬、弧菌屬、嗜冷菌屬、不動桿菌等;冰溫貯藏,其貨架期為39 d,其中假單胞菌屬、嗜冷菌、不動桿菌、清酒乳桿菌等成為優勢腐敗菌。結果表明:冰溫可有效延長冷鮮羊肉的貨架期。

揮發性鹽基氮,冷鮮羊肉,優勢腐敗菌,貨架期,冰溫

冰溫保鮮是近年來新興的一種保鮮技術,是將生鮮食品貯藏在0 ℃以下、冰點以上的溫度范圍內,使食品保持在非凍結狀態下,有效抑制微生物的生長代謝,達到長時保鮮的效果。該技術既降低了傳統凍藏和冷藏過程中生物胺的產生,又維持了食品的新鮮度和風味。但目前國內外冰溫保鮮技術的研究主要是針對生鮮食品,而應用于羊肉研究的相對較少[1]。實際生產過程中,冷鮮羊肉在運輸、銷售、貯藏等冷鏈環節溫度會隨外界條件發生波動,故選取實驗貯藏溫度為冰溫、10、4 ℃。根據柵欄技術原理,本研究主要以羊肉為原料,將冰溫保鮮技術、真空包裝技術和復合保鮮劑保鮮技術相結合,發揮其協同作用,形成對微生物的多靶攻擊,從而確保冷鮮羊肉的質量安全。

PCR-DGGE技術作為一種研究微生物群落復雜性和行為的分子生物學工具,從基因水平揭示微生物的多樣性[2]。在非培養狀態下直接提取樣品中細菌總DNA,既可避免傳統選擇性培養在微生物多樣性研究中的局限又能夠直接反映冷鮮肉中微生物群落原始構相及其動態變化過程[3-4]。本文研究貯藏溫度對冷鮮羊肉微生物菌群生長變化的影響，以了解冷鮮羊肉在貯藏過程中微生物的群落結構及優勢腐敗菌,有利于預測產品的貨架期,從而為研究冷鮮肉的生產、貯藏和流通及食用安全性提供理論依據[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮羊肉 現取自新疆綠翔牧業有限公司;材料 20×28×12絲PE包裝袋;減菌劑 2%乳酸[6];復合保鮮劑[7](現配現用) 0.18%茶多酚、1.2%殼聚糖(1%冰乙酸配制)、0.12% Nisin、74.6%生姜原液等體積混合;鹽酸、硼酸、甲基紅、次甲基藍、氧化鎂、無水乙醇等 均為分析純;培養基 菌落總數培養基、大腸桿菌培養基、乳酸菌培養基、假單胞培養基及其添加劑;細菌基因組DNA提取試劑盒、2xTaq PCR Master Mix 天根生化(北京)有限公司;溶菌酶(sigma)、Mark II、乙醇、瓊脂糖(sigma)、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、尿素、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、甘油、甲酰胺、過硫酸胺、溴化乙錠(EB)、引物(PAGE純化 20D) 生工生物工程(上海)股份有限公司。

D-37520高速冷凍離心機 德國LED熱電子公司;PCR儀 美國Barloworld Scientific有限公司;Bio-Rad Dcode apparatus DGGE電泳儀、GelDoc 2000system凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;DYY-8C水平電泳儀 北京市六一儀器廠;SW-CF-1F超凈工作臺;控溫冰箱 海爾;ZXRD-7-80搖床 上海智誠有限公司;DNP-9272電熱恒溫培養箱;LDZX-40Ⅱ壓力滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;DZ-400/2C真空包裝機 上海青浦食品包裝機械廠;H18424NEW pH計;半微量凱氏定氮儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定方法 新鮮羊肉5 kg,分成100 g大小。先減菌劑(2%乳酸)后復合保鮮劑噴霧各處理15 s后吸水紙真空包裝,分別在冰溫、4、10 ℃溫度下貯藏,每3 d對細菌菌落總數、大腸桿菌、乳酸菌、假單胞菌屬進行計數,測定TVB-N等指標及對樣品DNA的提取。

1.2.2 理化指標的測定 細菌總數的測定:按照GB 4789.2-2010《食品衛生微生物學檢驗:菌落總數測定》[8]進行測定;大腸桿菌的測定:按照GB 47893-2010《食品衛生微生物學檢驗:大腸桿菌群計數》[9]進行測定;假單胞菌的測定:按照ISO 13720-2010 肉和肉制品中假單胞菌屬的檢測[10]進行測定;乳酸菌的測定:按照GB 478935-2010《食品衛生微生物學檢驗:乳酸菌檢驗》[11]進行測定;TVB-N的測定:參照GB/T 5009.44-2003 肉與肉制品衛生標準的分析方法[12]半微量定氮法。

1.2.3 細菌總DNA的提取 參照Ampe等[13]方法,略有改動。無菌環境中稱取10 g羊肉(含平行2組)剪碎放入含90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶內,搖床內設4 ℃搖晃1 h。4 ℃,2000 r/min離心5 min后,把上清液倒入25 mL離心管中10000 r/min離心15 min,將沉淀放入1.5 mL無菌離心管中,參照TAINamp Bacteria DNA Kit提取試劑盒操作說明書進行后續提取。將提取DNA 溶于90 μL TE洗脫緩沖液中,分裝后經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,貯藏在-20 ℃條件。

1.2.4 PCR擴增 PCR擴增采用通用引物U968-L1401[14]。第一輪擴增上游引物為帶GC夾子的U968,下游引物為L1401。對細菌16 S rDNA V6～V8可變區進行擴增。其上游引物為U968-GC:5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGG GGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3′;下游引物為L1401:5′-CGGTGTGTACAA GACCC-3′。上下游引物均由上海生工有限公司合成。PCR反應體系為25 μL,其中DNA模板1 μL,上、下游引物各1 μL,Go Taq Green Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序:94 ℃預變性5 min,30個循環(94 ℃變性1 min;56 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min),最終72 ℃延伸7 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,產物放-20 ℃備用。

1.2.5 DGGE分析

1.2.5.1 PCR擴增產物進行電泳分離 參照Muyzer等[15]人的方法,將細菌16S rDNA V6～V8可變區擴增產物用于PCR-DGGE電泳分析。DGGE電泳變性劑溶液梯度范圍為35%～55%,待0.5×TAE電泳液加熱到預設溫度60 ℃時,先200 V 跑膠10 min,再85 V恒電壓電泳14 h。

1.2.5.2 EB染色 電泳結束后,取下DGGE膠片,放入濃度為10 μL/L溴化乙錠(Ethidium bromide,EB)溶液進行染色20～30 min,染色完畢后將膠片放入ddH2O中漂洗3次,每次約5 min。

1.2.5.3 成像及分析 將漂洗后的膠片放在凝膠成像系統下成像。

1.2.5.4 DNA回收、純化和測序 將成像后DGGE膠片置于紫外燈下,用手術刀切下不同泳道遷移位置不同的條帶,放入1.5 mL無菌離心管中,分別加入20 μL無菌水放4 ℃保鮮柜中過夜。取2 μL作為模板DNA,再次用GCU968-L1401按上述程序進行PCR擴增,產物重復上述PCR-DGGE實驗步驟后證明與切下條帶的位置相同并且為單條帶時,割膠回收。用U968-L1401引物進行擴增后,經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,出現特異性條帶后送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序,將測序結果登陸NCBI網站進行相似性比對。

1.2.6 數據分析 以上實驗數據采用BioEdit、Quantity one 4.6.2、Origin 8.6對數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 微生物指標

2.1.1 菌落總數計數 菌落總數是鮮肉腐敗程度的重要指標。由圖1可看出,不同貯藏溫度下冷鮮羊肉的菌落總數均隨著貯藏時間的延長呈現上升趨勢。3組貯藏溫度初始微生物數量為3.11 lg cfu/g,冰溫貯藏增長速率最為平緩,直至第39 d細菌總數為6.45 lg cfu/g;4 ℃貯藏第27 d菌落總數為6.18 lg cfu/g已腐敗;10 ℃貯藏增長速率最快,第6 d菌落總數為5.69 lg cfu/g接近腐敗界限。由此可知,在同一貯藏時間時,冰溫條件下微生物菌落總數最少。與許立興等[16]人研究冰溫貯藏鴨胸肉30 d時才變質,且冰溫能夠明顯抑制鴨胸肉微生物的生長繁殖的結果不完全一致,可能是本次實驗對原料肉的預處理略有差異。因為原料肉先經2%乳酸減菌處理,可有效減少大腸桿菌和沙門氏菌及對初始微生物數量降低1.2個對數值，與夏小龍[17]等人的研究結果一致;再經復合保鮮劑噴霧處理后4 ℃貯藏貨架期為21 d，與王俊剛[18]等人研究結果一致。在實驗過程中,每組實驗均有平行組,但由于非人為性的實驗條件產生的誤差,使得各處理組的均數間存在差別。

圖1 不同貯藏溫度冷鮮羊肉菌落總數的變化Fig.1 Changes in total bacterial count of chilled mutton at difference storage temperatures

2.1.2 腸桿菌計數 腸桿菌為革蘭氏陰性兼性厭氧菌,是產生腐胺和尸胺的重要細菌之一。新鮮肉中本來不含有腸桿菌,其主要來源于肉體表面,如肉羊器官(皮、毛)、屠宰環境和工具、人員的交叉污染,其次來源于消化道及分割包裝過程。3組樣品初始腸桿菌數量均為1.58 lg cfu/g,但由于3組貯藏溫度不同,腸桿菌隨著貯藏時間的延長增長速率各不相同。其中,10 ℃腸桿菌的增長速率最為急劇直至第6 d為5.89 lg cfu/g;4 ℃腸桿菌的增長速率較10 ℃稍微平緩一些;冰溫貯藏增長最為緩慢。由此,溫度對細菌生長繁殖有很大的影響,當溫度低于微生物生長繁殖的最適溫度時,細菌的遲滯期將會延長,而能在-2.5～0.5 ℃范圍內生長的菌屬種類很少[19]。

圖2 不同貯藏溫度冷鮮羊肉腸桿菌的變化Fig.2 Changes in Escherichia coli of chilled mutton at difference storage temperatures

2.1.3 乳酸菌計數 乳酸菌為兼性厭氧微生物,是真空包裝冷鮮羊肉主要腐敗菌[20]。在真空包裝無氧環境下乳酸菌快速生長繁殖成為優勢菌群,很大程度上抑制其他微生物如假單胞菌、腸桿菌與熱死環絲菌生長。3組樣品初始乳酸菌數量為2.44 lg cfu/g,隨著貯藏時間的延長,均有增長趨勢。3組貯藏溫度不同,對乳酸菌生長代謝的抑制作用大有不同。低溫會減少或停止微生物的代謝作用。當貯藏溫度低于冰點時,可以使原生質內的水分結冰,導致細胞死亡。相比較而言,10 ℃溫度較高,有利于乳酸菌的生長,其生長速率較快;冰溫生長速率較為緩慢。由此說明3組樣品乳酸菌增長速率差異顯著。

圖3 不同貯藏溫度冷鮮羊肉乳酸菌的變化Fig.3 Changes in lactobacillus of chilled mutton at difference storage temperatures

2.1.4 假單胞菌屬計數 假單胞菌屬為專性需氧的革蘭氏陰性菌,有氧環境中假單胞菌增殖快和產氨性能強,它的生長速度幾乎不受溫度的影響。但當真空包裝中氧氣消耗殆盡的同時CO2的大量積累,會導致假單胞菌的生長速率下降。從圖4可知,3組貯藏溫度假單胞初始菌數量為2.01 lg cfu/g,貯藏的溫度越低,假單胞菌的生長速度越緩慢。隨時間的遞增冷鮮羊肉中的假單胞菌屬呈現先上升后下降趨勢。

圖4 不同貯藏溫度冷鮮羊肉假單胞菌的變化Fig.4 Changes in pseudomonas of chilled mutton at difference storage temperatures

2.1.5 貯藏溫度對微生物的影響 冰溫貯藏條件下,冷鮮羊肉貯藏過程中主要腐敗菌的變化曲線圖5可知,由于冷鮮羊肉初始污染微生物種類及數量的差異,使得各菌屬在貯藏過程中的增長速率也不同。在貯藏初期,乳酸菌和假單胞菌屬占主導地位且呈現穩步上升趨勢,直至第24 d時,假單胞菌屬生長速率急劇增加并成為主要優勢腐敗菌;接近貨架期終點時,腸桿菌增長速率增加,占細菌總數69.06%,對冷鮮羊肉的腐敗起到關鍵作用[21]。

圖5 不同貯藏溫度下微生物的生長變化趨勢Fig.5 The growth and change tendency of various microorganisms under different storage temperature

2.1.6 TVB-N值的變化 TVB-N可直接有效反映動物性食品腐敗程度,其含量越高,腐敗程度就越大。由圖6可知,不同貯藏溫度下冷鮮羊肉的腐敗程度隨貯藏時間遞增而呈上升趨勢。3組貯藏溫度第0 d TVB-N值為8.09 mg/100 g,10 ℃貯藏第6 d其TVB-N為26.824 mg/100 g;4 ℃貯藏第12 d TVB-N為14.084 mg/100 g,27 d時TVB-N為25.368 mg/100 g;冰溫貯藏第21 d時TVB-N為14.756 mg/100 g,39 d時為29.568 mg/100 g。周梁等[22]研究4 ℃貯藏條件下冰鮮肉貨架期為13 d,而冰溫處理組第21 d時TVB-N為15 mg/100,此數據和本研究結果不完全一致,可能是本實驗3組樣品先經過2%乳酸對初始微生物進行減菌處理再經復合保鮮劑噴霧處理后貯藏于不同溫度下,經處理后使得樣品表面初始微生物多樣性及數量減少。

圖6 不同溫度下羊肉TVB-N值隨貯藏時間的變化Fig.6 Changes in TVB-N of lamb during storage at different temperatures

2.2 細菌總DNA提取及PCR擴增

以提取細菌總DNA為模板,用帶GC夾子U968-L1401引物對16S rDNA V6～V8可變區進行PCR擴增,擴增后產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,通過對比 Mark II可獲得450 bp大小目的片段。

2.3 細菌DGGE圖譜主要條帶的DNA序列分析

本實驗應用獨立的分子生物學方法PCR-DGGE技術對微生物多樣性進行全面和快速的分析評價。PCR產物在38%～55%變性梯度凝膠進行DGGE電泳。由DGGE圖譜表明,在相同時間不同貯藏溫度下,各泳道均存在大量條帶且不同泳道的條帶數量、位置、亮度各不相同。冷鮮羊肉在貯藏初期微生物具有較高的多樣性:沙門氏菌、熱死環絲菌、陰溝腸桿菌、巨球菌、赫氏埃希菌等不同種屬的細菌均存在,說明屠宰車間環境、工具、人員等微生物污染的多樣性,但在不同溫度條件下貯藏一段時間后,部分條帶始終存在;部分條帶亮度逐漸變弱甚至消失,可能低溫抑制細菌的繁殖速度;貯藏后期微生物數量增多,有些條帶亮度由弱變強;甚至在貯藏后期還出現了一些新條帶。在整個貯藏過程中,假單胞菌、嗜冷菌屬、乳桿菌、球菌和不動桿菌為冷鮮羊肉優勢腐敗菌。為了進一步分析細菌多樣性和差異性,將圖7中所標記的19條條帶進行回收、測序,結果如表1所示。

圖7 冷鮮羊肉在不同貯藏溫度下貯藏細菌PCR-DGGE圖譜Fig.7 PCR-DGGE map of cold fresh mutton in different storage temperature

表1 PCR-DGGE圖譜中主要條帶割膠回收測序結果Table 1 In the PCR-DGGE map of the main bands were recovered and sequenced results

由圖7和表1結合分析,冷鮮羊肉貯藏第0 d時存在4條較亮條帶,表明冷鮮羊肉初始微生物污染的多樣性,污染菌主要來源于動物皮毛、屠宰車間環境、屠宰工具及人員流動。a為厭氧菌中的巨球菌,其處于真空包裝狀態下，故存在于貯藏的各時期。b為清酒乳桿菌,它和乳酸桿菌(e)在低溫貯藏初期條帶較弱,但隨著貯藏時間的增加在冷鮮羊肉腐敗程度上逐漸占主導地位,并最終成為特定優勢腐敗菌,與De Filippis F等人研究的特定腐敗菌理論一致[23]。c為葡萄球菌,動物的皮膚、羽毛、腸道等部位都有葡萄球菌存在;d為梭狀桿菌。在整個貯藏過程中條帶s一直存在且很亮,為腸桿菌屬,一般在屠宰過程中肉體很少被腸道中所帶細菌污染,但是在去除內臟工序時如果刺破腸道且沒有及時清潔刀具將導致整個屠宰過程中刀具的交叉污染,由于不同屠宰車間的環境、操作人員等的不同,所以腸桿菌污染的程度不同。f為熱死環絲菌,原料中的污染菌,在冷卻豬肉初始菌相所占比例較小,與倪萍等[24]人的研究熱死環絲菌在低溫環境可快速地生長繁殖,成為冷藏條件真空包裝豬肉主要腐敗菌的結果一致。m為嗜冷菌,在相同貯藏時間不同貯藏溫度下,10 ℃相比較于4 ℃和冰溫條帶較弱,說明低溫有利于嗜冷桿菌的生長;l為假單胞菌屬,是一種嗜冷需氧G-,在低溫條件下幾天后即成為主要優勢菌,肉的腐敗很大程度上取決于肉中初期假單胞菌的量和該菌在菌系中所占比例,冷藏過程中,假單胞菌從初始菌中的50%上升至終末菌中的90%[25]。q為廣布肉毒桿菌,由于3組貯藏溫度的樣品均處于真空包裝狀態,在每個貯藏階段都存在但是條帶分布較弱。r為沙門氏菌,與屠宰衛生狀況、工具潔凈度有一定關系。在貯藏過程中,微生物的消亡與生長交替出現,構成了復雜的細菌群落結構。

3 討論

本實驗以傳統微生物的檢測方法結合PCR-DGGE技術研究不同貯藏溫度下,冷鮮羊肉菌相的動態變化及其貨架期。鑒于溫度對微生物的生長代謝的影響,在微生物分類學上常用最適生長溫度、最高生長溫度、最低生長溫度及溫度存活實驗作為鑒定菌種的一項生理特征,配合其他形態與生理特性,以區別不同溫度范圍內的種、屬。在不同溫度下的貯藏初期,清酒乳桿菌和乳酸桿菌數量較少,但隨著貯藏時間的增加在冷鮮羊肉腐敗程度上逐漸占主導地位,并最終成為特定優勢腐敗菌,與De Filippis F等人研究的特定腐敗菌理論一致[26]。江蕓等人[27]研究發現肉的腐敗很大程度上取決于肉中初期假單胞菌的量和該菌在菌系中所占比例,冷藏過程中,假單胞菌從初始菌中的50%上升至終末菌中的90%。在貯藏后期,存在的優勢腐敗菌有假單胞菌屬、弧菌、嗜冷菌、不動桿菌等。

不同貯藏溫度下,揮發性鹽基氮在整個貯藏過程中始終呈現上升趨勢,這是由于肉中存在的蛋白質在微生物及酶的作用下產生氨及胺類物質。此類物質具有揮發性,其含量與肉品腐敗程度成正比關系。在10 ℃時,TVB-N的增長速率最大,即在相同時間內腐敗程度最為嚴重。相比之下,冰溫溫度較低,冷鮮羊肉的腐敗程度較弱。

4 結論

經相同處理并在吸水紙真空包裝條件下,得出以下結論:在10 ℃貯藏下,貨架期為6 d,其優勢腐敗菌為腸桿菌、彎曲乳桿菌等;4 ℃條件下,貨架期為27 d,優勢腐敗菌主要有假單胞菌屬、弧菌、嗜冷菌、不動桿菌等;冰溫貯藏,貨架期為39 d,其中假單胞菌屬、嗜冷菌、不動桿菌、清酒乳桿菌等成為優勢腐敗菌。冰溫貯藏不僅使冷鮮羊肉保持較好的色澤而且能有效延長冷鮮肉的貨架期,為冷鮮肉的快速發展提供理論依據。

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Effect of temperature on the quality and safety of chilled mutton

SUN Dan-dan1,LU Shi-ling1,*,LI Kai-xiong1,ZHANG Yan-li2,ZHANG Jie2

(1.Food College of Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.Lv Xiang Animal Husbandry Limeted Liability Company of Xinjiang,Tacheng 834601,China)

The study researched dynamic changes of chilled mutton bacteria phase and shelf life in 10 ℃,4 ℃ and ice temperature storage conditions,by the traditional microbial detection method combined with 16S rDNA V6～V8 variable region of the polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis fingerprinting technology(polymerase chain sought gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE).Analysis of microbial count and DGGE map,in 10 ℃,six days had reached the critical value of corruption,the dominant spoilage bacteriaEnterobacter,bendingLactobacillus. In 4 ℃,the shelf life for 27 days,dominant spoilage bacteriaPseudomonasspp.,Vibrio,Psychrophilic,Acinetobacteretc.. In ice temperature storage,shelf life was for 39 days,Pseudomonas,Psychrobacter,Acinetobacter,Lactobacillussake became the predominant spoilage bacteria.The results showed that the ice temperature could effectively prolong the shelf life of chilled mutton.

TVB-N;chilled mutton;dominant spoilage bacteria;shelf life;ice temperature

2016-03-30

孫丹丹(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產品加工，E-mail：guomushzu@sina.com。

*通訊作者:盧士玲(1976-)，女，教授，研究方向：畜產品加工，E-mail：lushiling_76@163.com。

新疆生產建設兵團成果轉化項目(2015AB002)；新疆生產建設兵團重點領域科技攻關(2013BA012)。

TS251

A

:1002-0306(2017)04-0327-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.053