寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖活性氧代謝及病程相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)

楊 蘭,潘靜宇,李永才,劉 筱,高春麗,畢 陽(yáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖活性氧代謝及病程相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)

楊 蘭,潘靜宇,李永才*,劉 筱,高春麗,畢 陽(yáng)

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

馬鈴薯塊莖,寡雄蛋白,活性氧代謝,病程相關(guān)蛋白

2015年中國(guó)農(nóng)業(yè)部正式提出推動(dòng)馬鈴薯主糧化,這為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了良好的契機(jī)[1],但是也存在其他問(wèn)題,尤其因目前采后貯藏設(shè)施落后、管理粗放而造成的爛窖現(xiàn)象嚴(yán)重影響馬鈴薯加工原料的供給和采后增值,其中馬鈴薯在采后貯藏期間因病原微生物侵染而發(fā)生腐爛的高達(dá)20%～25%[2]。雖然化學(xué)農(nóng)藥在一定程度上可以減緩病害的發(fā)生,但是存在農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和抗病菌株等問(wèn)題,因此,需要一種安全有效的病害控制技術(shù)來(lái)減少或逐步取代化學(xué)農(nóng)藥的使用。近年來(lái),誘導(dǎo)植物抗病性成為研究熱點(diǎn),許多因子都能誘導(dǎo)植物的抗病反應(yīng),其中生物防治以其安全性、有效性成為目前采后病理學(xué)的研究熱點(diǎn)[3]。

寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)能夠產(chǎn)生分子量約為10 ku的擬激發(fā)子蛋白,Picard將其命名寡雄蛋白(oligandrin),它是一種與激發(fā)子有相似功能的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白,能夠激發(fā)植株的抗病性防御反應(yīng)[4]。自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái),寡雄蛋白作為擬激發(fā)素引起了人們極大的注意,成為近年來(lái)真菌生物激發(fā)子研究的熱點(diǎn)之一。寡雄蛋白能夠?qū)ζ渌喾N致病腐霉(Pythiumspp.)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersi)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)所引起的多種重要蔬菜病害產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[4]。

植物在受到外源激發(fā)子誘導(dǎo)后會(huì)有兩類反應(yīng),一類是快速的局部反應(yīng),即過(guò)敏反應(yīng)(Hypersensitive Response,HR),另一類是誘發(fā)了植物一系列的防御反應(yīng),使作物產(chǎn)生全面的抗性,即誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced Systematic Resistance,ISR)[5]。植物體內(nèi)所產(chǎn)生的病程相關(guān)蛋白和防御酶系都與植物的抗病性息息相關(guān),可作為植株抗性的重要生理指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),寡雄蛋白能夠誘導(dǎo)番茄植株的防御反應(yīng),在病原菌侵入處形成富含胼胝質(zhì)的細(xì)胞壁沉積物和胞間阻塞,而且在侵染部位還會(huì)大量積累真菌毒素,從而抑制寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)的侵染和定殖[6]。前期的研究結(jié)果表明24 μg/mL寡雄蛋白處理能有效的降低馬鈴薯塊莖干腐病的擴(kuò)展,但其具體的作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。因此,本研究以甘肅馬鈴薯“新大坪”為試材,從活性氧代謝的角度探究寡雄蛋白處理誘導(dǎo)果實(shí)抗病反應(yīng)的機(jī)理,為采后馬鈴薯病害控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“新大坪”馬鈴薯 購(gòu)于甘肅省定西市安定區(qū),挑選無(wú)病害、大小均勻的馬鈴薯,運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后在5～8 ℃條件下貯藏備用;多利維生寡雄腐霉(Pythiumoligandrum) 北京比奧瑞生物科技有限公司提供;硫色鐮刀菌(Fusariumsulphureum) 分離純化自感病的馬鈴薯塊莖;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸羥胺 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;交聯(lián)聚乙烯毗咯烷酮(PVPP)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、二硫蘇糖醇(DTT) 北京索萊寶科技有限公司;對(duì)氨基苯磺酸、α-萘胺 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;鹽酸、丙酮、H2O2分析純,成都市科龍化工試劑廠。

UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津;H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 寡雄蛋白濾液的制備 參照Wang等[7]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。將配制好的液體培養(yǎng)基分裝到50 mL的三角瓶中,121 ℃滅菌30 min。每瓶接入直徑8 mm活化的寡雄腐霉菌絲塊8塊,于25 ℃、150 r/min下暗培養(yǎng)7 d,培養(yǎng)液經(jīng)8000 r/min離心10 min,上清液用4層無(wú)菌濾紙過(guò)濾,即得無(wú)菌發(fā)酵液,濃度為100%,置于4 ℃冰箱中備用。寡雄腐霉液體培養(yǎng)基簡(jiǎn)稱PO培養(yǎng)液,配方參照王愛(ài)英[8]所描述的方法進(jìn)行配制。

1.2.2 寡雄蛋白的提取、純化 在得到的寡雄腐霉濾液中邊加固體硫酸銨邊攪拌,加至硫酸銨最終濃度為50%,4 ℃靜置過(guò)夜,10000×g離心15 min,沉淀保存于-20 ℃?zhèn)溆?上清液中再加固體硫酸銨至60%(所有方法同上),依次類推,一直加到100%[9],每級(jí)收集的沉淀用雙蒸水溶解,裝入分子截留量為8 ku的透析袋中,放在生理鹽水中透析48 h以除去鹽類物質(zhì),期間更換生理鹽水?dāng)?shù)次,用0.2% BaCl2檢測(cè)硫酸銨是否除去。吸取透析袋中液體,剩余沉淀即為寡雄蛋白。

1.2.3 寡雄蛋白對(duì)馬鈴薯塊莖的誘抗作用 挑選外觀整齊、無(wú)病蟲害的馬鈴薯塊莖,自來(lái)水清洗后,用2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min進(jìn)行表面消毒,然后用無(wú)菌水沖洗后自然晾干,隨后再用75%酒精表面消毒,最后用滅菌鐵釘(直徑3 mm)在塊莖赤道部位均勻刺3 mm×3 mm的傷口3個(gè),之后用移液槍接種10 μL 56、24、18、12、6 μg/mL寡雄蛋白,誘抗12 h后的塊莖分別接種10 μL硫色鐮刀菌(Fusariumsulphureum)孢子懸浮液,對(duì)照接種10 μL無(wú)菌水,之后用塑料袋包裝,在室溫條件下貯藏并測(cè)定不同時(shí)期的病斑直徑。每個(gè)濃度3個(gè)塊莖,重復(fù)3次。

1.2.4 取樣方法 參照Bi等[10]的方法并稍作修改。將馬鈴薯制成馬鈴薯切片,用本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的最佳質(zhì)量濃度的寡雄蛋白(24 μg/mL)進(jìn)行誘抗處理后,接種培養(yǎng)1周的F.sulphureum菌餅(直徑3 mm),分別取處理后第0、0.5、1、2、3、4 d組織,用無(wú)菌不銹鋼刀切取切片表層0～3 mm處的馬鈴薯組織3 g,用錫箔紙包好后立即用液氮進(jìn)行冷凍,然后保存于-80 ℃超低溫冰箱中待測(cè)。

1.2.5 活性氧代謝相關(guān)酶活性和產(chǎn)物含量的測(cè)定

1.2.5.1 超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定 a.粗酶液的提取:參照Lacan[11]的方法并修改。取3.0 g樣品組織,加入3 mL 100 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5,含5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)和2% PVPP(W/V)),冰浴條件下研磨成勻漿后于4 ℃、12000×g離心30 min,上清液立即用于酶活性測(cè)定。

b.SOD的活性測(cè)定:參照Wang等[12]的方法并修改。酶活性以每毫克蛋白抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位(U/mg protein)表示。

c.CAT的活性測(cè)定:參照Beers等[13]的方法并修改。在240 nm處測(cè)定2 min內(nèi)樣品的吸光值,以每分鐘反應(yīng)體系吸光度值減少0.01所需的酶量為一個(gè)酶活性單位(U),表示為U/(mg protein)。

1.2.5.2 過(guò)氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)活性的測(cè)定 a.POD活性測(cè)定:參照Venisse等[14]的方法并修改。POD反應(yīng)體系為3 mL 0.025 mol/L愈創(chuàng)木酚、0.2 mL 0.25 mol/L H2O2和0.05 mL粗酶液。該酶活性以每分鐘反應(yīng)體系在波長(zhǎng)470 nm處吸光度值讀數(shù)變化增加1所需的酶量為1個(gè)活性單位(U),表示為U/(mg protein)。重復(fù)測(cè)定3次。

b.PPO活性測(cè)定:參照Chen等[15]的方法并做修改。PPO反應(yīng)體系包括2 mL 0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液、0.5 mL 0.05 mol/L鄰苯二酚和0.2 mL粗酶液。加酶液后1 min于420 nm處開(kāi)始記錄反應(yīng)體系每分鐘的吸光值變化,連續(xù)測(cè)定2 min,以每分鐘吸光度值變化增加1時(shí)所需的酶量為1個(gè)活性單位,表示為U/(mg protein)。樣品重復(fù)測(cè)3次。

表1 引物設(shè)計(jì)表Table 1 Primer design

1.2.5.3 H2O2含量的測(cè)定 參照Prochazkova等[16]的方法并修改。取3.0 g樣品組織,加入5 mL冷丙酮,冰浴磨成勻漿后于4 ℃下12000×g離心20 min。取1 mL上清液,加入100 μL 20%的四氯化鈦溶液(溶于濃鹽酸,V/V)和200 μL濃氨水,混勻反應(yīng)5 min后離心15 min。沉淀部分用冷丙酮洗滌4次以減少色素的干擾,最后將沉淀溶于2.5 mL 2 mol/L H2SO4溶液中,于410 nm測(cè)定溶液的吸光度值。按同法作H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線。H2O2含量以μmol/g FW表示。

1.2.6 病程相關(guān)蛋白的測(cè)定

1.2.6.1 幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定 粗酶液的提取以及活性測(cè)定參照張衍榮等[18]的方法進(jìn)行。以每秒鐘每克樣品(鮮重)中酶分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-9mol N-乙酰葡糖胺為一個(gè)幾丁質(zhì)酶活性單位,單位是1×10-9mol/s·g FW。

1.2.6.2β-1,3葡聚糖酶活性的測(cè)定 參照Wirth等[19]的方法。以昆布多糖為底物,以每秒鐘每個(gè)樣品中酶分解昆布多糖產(chǎn)生10-9mol葡萄糖為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.2.7 寡雄蛋白處理后相關(guān)基因表達(dá) 取寡雄蛋白誘抗處理后的馬鈴薯組織,液氮速凍后-80 ℃超低溫冰箱中保存。采用TRIZOL法對(duì)其進(jìn)行RNA的提取。

根據(jù)NCBI查得馬鈴薯的基因序列(表1),進(jìn)而設(shè)計(jì)特異性引物,選擇內(nèi)參基因18 s(GenBank ID:AB971541.1)用于Real-time PCR。這部分實(shí)驗(yàn)在生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行,通過(guò)柱式植物總RNA抽提純化試劑盒,按照標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟進(jìn)行基因蛋白的分離純化,并進(jìn)行測(cè)定。PCR反應(yīng)條件設(shè)定為:95 ℃變性3 min;95 ℃變性15 s;60 ℃延伸40 s;記錄熒光強(qiáng)度,40個(gè)循環(huán)。對(duì)于比較Ct值的相對(duì)定量,則根據(jù)目的基因的Ct值,按照2-ΔΔCtQ的分析方法,對(duì)于目的基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan’s多重顯著分析和Microsoft Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并繪制圖表,圖中豎線代表標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 寡雄蛋白對(duì)馬鈴薯塊莖抗干腐病的誘導(dǎo)

用不同濃度的寡雄蛋白處理馬鈴薯塊莖后再進(jìn)行損傷接種,發(fā)現(xiàn)其能不同程度地抑制病斑的擴(kuò)展。在6～24 μg/mL范圍內(nèi),隨著蛋白濃度的減小,病斑的擴(kuò)展增加。其中最佳誘抗?jié)舛葹?4 μg/mL,在塊莖培養(yǎng)9 d時(shí),最佳誘抗?jié)舛忍幚淼牟“咧睆綖閷?duì)照組的58.3%(圖1)。

圖1 寡雄蛋白對(duì)馬鈴薯塊莖的誘抗作用Fig.1 Resistance effect of oligandrin treatment on potato tuber

2.2 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖活性氧代謝的影響

圖2 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖H2O2含量(A)和產(chǎn)生速率(B)的影響Fig.2 Effect of oligandrin treatment on the H2O2

圖3 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯POD(A)、PPO(B)、SOD(C)和CAT(D)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of oligandrin treatment on expression of POD(A),PPO(B),SOD(C)and CAT(D)genes

2.2.2 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖POD、PPO、SOD和CAT基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比,寡雄蛋白處理誘導(dǎo)了馬鈴薯塊莖POD和PPO基因表達(dá)量的升高,POD基因表達(dá)量在2 d達(dá)到最大值,是對(duì)照組的1.46倍(圖3A),且PPO基因表達(dá)量在2 d和4 d時(shí)達(dá)到高峰,分別較對(duì)照高出4.14倍和1.99倍(圖3B),而對(duì)照組PPO基因表達(dá)量在整個(gè)貯藏期間沒(méi)有明顯變化。同時(shí)寡雄蛋白處理還可明顯誘導(dǎo)SOD和CAT基因表達(dá)量的升高,在貯藏0.5 d時(shí),SOD和CAT基因表達(dá)量達(dá)到最大值,分別為同期對(duì)照的1.42和1.67倍,在隨后的貯藏過(guò)程中呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),貯藏后期處理組和對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(圖3C,圖3D)。

2.2.3 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖POD、PPO、SOD、CAT活性的影響 馬鈴薯塊莖組織POD活性在整個(gè)貯藏過(guò)程中呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì),且處理組POD活性顯著高于對(duì)照,在第4 d達(dá)到最大值,比對(duì)照高21.5%(圖4A)。從圖4B中可以看出,對(duì)照組PPO活性呈現(xiàn)出緩慢升高的趨勢(shì),經(jīng)過(guò)蛋白誘抗處理后,馬鈴薯組織中PPO的活性較對(duì)照組有所升高,并且在第4 d時(shí)大幅增大,比對(duì)照組高33.9%。經(jīng)過(guò)誘抗處理后的馬鈴薯塊莖SOD活性較對(duì)照有所升高,在貯藏1～3 d的過(guò)程中,處理組SOD活性略高于對(duì)照組,且在第3 d時(shí)達(dá)到最大值,比對(duì)照高19.47%(圖4C)。塊莖貯藏期間CAT活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),寡雄蛋白誘抗處理能使塊莖CAT活性上升,且在第2 d達(dá)到最大值,比對(duì)照高66.57%;而對(duì)照組CAT活性在第3 d出現(xiàn)最高峰(圖4D)。

2.3 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖主要病程相關(guān)蛋白產(chǎn)生的影響

圖4 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯POD(A)、PPO(B)、SOD(C)和CAT(D)活性的影響Fig.4 Effect of oligandrin treatment on the POD activity(A),PPO activity(B),SOD activity(C)and CAT activity(D)of potato

2.3.1 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖β-1,3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)的影響 貯藏期間塊莖組織β-1,3葡聚糖酶的基因表達(dá)量表現(xiàn)出緩慢上升的趨勢(shì),在第4 d時(shí)對(duì)照組和處理組表達(dá)量都達(dá)到最大值,寡雄蛋白對(duì)β-1,3葡聚糖酶基因表達(dá)量的誘導(dǎo)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(圖5A)。在整個(gè)貯藏過(guò)程中,對(duì)照組和處理組幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量總體呈現(xiàn)先上升后下降,隨后又上升的趨勢(shì),在貯藏2～4 d的過(guò)程中寡雄蛋白處理誘導(dǎo)了馬鈴薯塊莖中幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量的升高,并且表達(dá)量在4 d達(dá)到最大值,比對(duì)照高出23.08%(圖5B)。

圖5 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯β-1,3葡聚糖酶(A)和幾丁質(zhì)酶(B)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of oligandrin treatment on expression of β-1,3-glueanase(A)and chitinase(B)genes of potato tissue

2.3.2 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯塊莖β-1,3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性的影響 在貯藏前期,β-1,3葡聚糖酶活性呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),在第3 d時(shí)有所上升,隨后又呈下降的趨勢(shì)。在整個(gè)過(guò)程中,寡雄蛋白處理的馬鈴薯塊莖β-1,3葡聚糖酶活性低于對(duì)照組(圖6A)。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng),寡雄蛋白誘抗處理顯著提高了塊莖組織幾丁質(zhì)酶活性,在貯藏0.5 d和3 d時(shí)出現(xiàn)峰值,分別較對(duì)照組高出46.32%和50.25%,而對(duì)照組幾丁質(zhì)酶活性在整個(gè)過(guò)程中變化不大(圖6B)。

圖6 寡雄蛋白處理對(duì)馬鈴薯β-1,3葡聚糖酶(A)和幾丁質(zhì)酶(B)活性的影響Fig.6 Effect of oligandrin treatment on the β-1,3-glueanase activity(A)and chitinase activity(B)of potato tissue

3 討論

4 結(jié)論

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Induction of active oxygen metabolism and pathogenesis-relatedproteins in potato tubers by oligandrin treatment

YANG Lan,PAN Jing-yu,LI Yong-cai*,LIU Xiao,GAO Chun-li,BI Yang

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

potato tuber;oligandrin;reactive oxygen metabolism;pathogenesis-related protein

2016-09-02

楊蘭(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：采后果蔬貯藏與保鮮，E-mail：m18794841880_1@163.com。

*通訊作者:李永才(1972-)，男，博士，教授，研究方向：采后果蔬貯藏病害控制，E-mail：lyc@gsau.edu.cn。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)04-0317-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.051