傳統發酵蔬菜中拮抗溫和氣單胞菌的乳酸菌的篩選與鑒定

林 洋,馬歡歡,呂欣然,孫夢桐,白鳳翎,*,勵建榮

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083)

傳統發酵蔬菜中拮抗溫和氣單胞菌的乳酸菌的篩選與鑒定

林 洋1,馬歡歡1,呂欣然2,孫夢桐1,白鳳翎1,*,勵建榮1

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083)

目的:從傳統發酵蔬菜中篩選對溫和氣單胞菌具有拮抗作用的乳酸菌。方法:采用雙層瓊脂擴散法篩選,通過生理生化反應和16S rRNA序列分析進行鑒定,研究蛋白酶、pH和溫度等因素對乳酸菌無細胞上清液(CFS)抑菌活性的影響,采用掃描電鏡分析乳酸菌無細胞上清液對溫和氣單胞菌細胞結構完整性的影響。結果:從腌漬酸黃瓜中篩選出對溫和氣單胞菌(106CFU/mL)具有較強抑制活性的菌株LZH2-5,經鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。LZH2-5無細胞上清液經胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶處理后其抑菌活性分別喪失29.38%、23.93%、22.30%、19.47%和14.59%;經40、60、80 ℃處理30 min后其拮抗活性基本不變,在100 ℃和121 ℃處理30 min后活性分別下降了16.66%和25.40%,在pH3.0～4.0范圍內保持其抑菌活性,粗提物的最小抑菌濃度12.0 mg/mL。掃描電鏡表明經LZH2-5 CFS處理使溫和氣單胞菌的細胞結構破壞并溶解。結論:從腌漬酸黃瓜中篩選的植物乳桿菌LZH2-5對溫和氣單胞菌具有較強抑制作用,初步分析抑菌活性物質為細菌素類,可作為水產品養殖過程中控制溫和氣單胞菌的拮抗制劑出發菌株。

傳統發酵蔬菜,乳酸菌,拮抗,溫和氣單胞菌,篩選與鑒定

溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)是一廣泛存在于海水和淡水環境中的革蘭氏陰性條件性致病菌,感染魚蝦等水產動物后釋放溶血素、細胞毒素以及腸毒素等多種致病因子,可引起鯽魚、鱸魚、大菱鲆和蝦蛄等水產動物類敗血癥[1-2],造成水產養殖業的巨大經濟損失。溫和氣單胞菌也可通過水產食品感染人,使患者出現腹瀉、急性腸胃炎等癥狀,嚴重時可導致死亡[3-4]。控制水產養殖過程中溫和氣單胞菌引起疾病[5]的有效方法是利用抗菌藥物和中草藥制劑,使用抗菌藥物會使水體和水產動物體內形成藥物殘留,也會導致細菌的耐藥性問題,而中草藥制劑的成本較高。利用微生態制劑控制水產養殖中致病菌是一種綠色安全和高效的方法,目前主要應用光合細菌、芽孢桿菌和乳酸菌制劑取得良好的效果。徐姍楠等[6]從水體環境中分離的紅假單胞菌對嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、副溶血弧菌等29株水產養殖病原菌均有拮抗作用。羅璋等[7]研究表明應用1.68×105CFU/mL的枯草芽孢桿菌BHI 344對溫和氣單胞菌有較強的拮抗作用。

乳酸菌(LAB)主要來源于傳統發酵食品、動物腸道、飼料、土壤淤泥等自然環境,主要通過營養物競爭、生態位競爭等方式以及產生乳酸菌素、羅伊菌素、有機酸、羥基脂肪酸等抑菌物質控制微生物的生長繁殖[8-10],作為微生態制劑具有高效、綠色、無殘留等優勢,廣泛應用于水產養殖的疾病預防與控制[11]。莊國宏等[12]利用分離自健康人群腸道的嗜酸乳桿菌Sr-1和Sr-7對溫和氣單胞菌(107CFU/mL)具有顯著的抑制效果,抑菌直徑分別為16.20 mm和16.50 mm。茍小蘭等[13]采用牛津杯法利用6株魚源乳酸菌對溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌等進行抑制作用研究,結果表明菌株SCKJ 0027對溫和氣單胞菌抑制效果最強,抑菌直徑達到25.30 mm。Mohamed等[14]利用分離自羅非魚和鯉魚腸道中的乳酸菌,對豚鼠氣單胞菌和熒光假單胞菌均有抑制效果,其中對豚鼠氣單胞菌最大抑菌直徑達到30.00 mm。乳酸菌作為拮抗性細菌對氣單胞菌屬的細菌具有較強的抑制作用,本文從內蒙古、遼寧和安徽三地的傳統發酵蔬菜中分離篩選對溫和氣單胞菌有拮抗作用的乳酸菌菌株,為控制水產養殖過程中溫和氣單胞菌污染提供了微生態制劑的菌源。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

傳統農家發酵蔬菜 采自內蒙古寧城縣腌漬酸辣椒、遼寧彰武縣腌漬酸黃瓜、安徽績溪縣腌漬酸豆角和腌雪菜;溫和氣單胞菌LY-23(Aeromonassobria) 本實驗室分離自大菱鲆魚體;MRS瓊脂,LB肉湯 北京奧博星生物技術有限公司;胰蛋白酶(250000 U/g)、木瓜蛋白酶(200000 U/g)、中性蛋白酶(200000 U/g)、堿性蛋白酶200000 U/g)、胃蛋白酶(15000 U/g) 華藍化學有限公司;DNA Marker-D、Taq PCR Master mix、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒 上海生工生物工程有限公司;乳酸菌生化鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司。

DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺 北京市東聯哈爾(北京)儀器制造有限公司;SPX-250智能生化培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠;IKA Vortex GENIUS 3振蕩器 德國IKA公司;5804R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司;ABI stepone plus PCR儀 德國艾本德股份有限公司;DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠;Cheimdox XRS凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;RE-2000A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;Labconco Free Zone 2.5臺式真空冷凍干燥機 美國LABCONCO公司;S-4800掃描電鏡、E-1045鍍金儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌菌株分離 在無菌條件下,取傳統發酵食品10.0 g置于90 mL滅菌生理鹽水中,用振蕩器充分振蕩5 min后,用接種環挑取一環菌懸液在1% CaCO3的MRS培養基上劃線接種,37 ℃培養48 h。挑取有溶鈣圈的白色菌落進一步分離純化,挑取單菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗。

1.2.2 抗溫和氣單胞菌性乳酸菌菌株篩選 挑取革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性的菌株在MRS液體培養基進行活化,取24 h培養物經4 ℃ 6500 r/min離心5 min,用0.45 μm濾膜過濾獲得其無細胞上清液(cell free supernatant,CFS);將溫和氣單胞菌置于LB肉湯中,在37 ℃下靜置培養12 h,活化三代,稀釋到106CFU/mL菌懸液作為指示菌。參照文獻[15]采用雙層瓊脂擴散法對供試菌株溫和氣單胞菌進行拮抗性作用分析,篩選對溫和氣單胞菌具有拮抗活性的菌株。

1.2.3 拮抗性乳酸菌的鑒定

1.2.3.1 乳酸菌鑒定 參照以上方法,篩選得到拮抗效果較好的乳酸菌菌株。

1.2.3.2 生理生化鑒定 參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》和《常見細菌系統鑒定手冊》中的鑒定方法對篩選出的乳酸菌進行生理生化鑒定[16-17]。

1.2.3.3 16S rRNA鑒定 對篩選出的乳酸菌菌株對數期培養物用DNA快速抽提試劑盒提取菌株DNA。采取通用引物,正向引物為27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)反向引物為1492r(5′-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3′)。PCR采用25 μL擴增反應體系:其中含DNA 2.0 ng/μL的模板1 μL,10 μmol/L的上下游引物各1 μL,Taq PCR Master mix 12.5 μL,用超純水補足至25 μL。PCR擴增反應程序如下:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性1 min,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s,循環次數為30次,72 ℃繼續延伸10 min,4 ℃保溫。PCR產物大小經用1.0%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測,驗證后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將得到序列登錄GenBank,BLAST進行同源性比對,MEGA5.0構建出系統發育進化樹。

1.2.4 乳酸菌生長與抗溫和氣單胞菌活性曲線 取0.2 mL乳酸菌懸液接種于10 mL MRS液體培養基中,于37 ℃下恒溫、靜置培養,每隔4 h取菌株的菌懸液測定其pH,并于600 nm測定其OD值,參照1.2.5測定菌株CFS的抑菌活性。

表1 傳統發酵蔬菜中乳酸菌對溫和氣單胞菌的抑制作用Table 1 Antagonistic effects of LAB from Chinese traditional fermented vegetables on A. sobria

注:同列標有不同字母表示顯著差異(p<0.05)。

1.2.5 乳酸菌拮抗溫和氣單胞菌作用研究

1.2.5.1 酶敏感性實驗 分別調至各酶適宜pH后,加入胃蛋白酶(pH2.0)、木瓜蛋白酶(pH7.0)、中性蛋白酶(pH7.0)、胰蛋白酶(pH7.5)和堿性蛋白酶(pH10.0),添加蛋白酶使其在乳酸菌CFS中的終濃度為1.0 mg/mL,37 ℃下水浴2 h,按照1.2.2測定抑菌活性,計算乳酸菌CFS的活性喪失率。

式中:φ(對照)為對照組乳酸菌CFS對溫和氣單胞菌的抑菌直徑;φ(酶處理)為酶處理后乳酸菌CFS對溫和氣單胞菌的抑菌直徑。

1.2.5.2 熱穩定性實驗 將菌株上清液分別在40、60、80、100、121 ℃條件下處理30 min,參照1.2.2測定抑菌活性。

1.2.5.3 pH實驗 利用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl將菌株上清液的pH分別調為3.0、3.5、4.0和4.5按照1.2.2測定抑菌活性。

1.2.6 乳酸菌抑制溫和氣單胞菌MIC測定

1.2.6.1 有機溶劑萃取 采用乙酸乙酯萃取乳酸菌CFS。取100 mL乳酸菌CFS于分液漏斗中,乙酸乙酯100 mL分5次加入進行萃取,沿同一方向輕輕振蕩后靜置,待分層明顯時收集乳化層,將5次萃取液合并。在45 ℃、120 r/min條件下,將乙酸乙酯萃取的細菌素粗提物真空旋轉蒸發至無有機溶劑氣味,殘存液保存至無菌錐形瓶中。

1.2.6.2 MIC測定 參考文獻[18]兩倍微量稀釋肉湯法并稍作修改進行測定。真空冷凍干燥制成粉末置于-18 ℃冰箱保存備用。用LB液體培養基將粗提物粉末稀釋至終濃度為48.0、24.0、12.0、6.0、3.0 mg/mL。取5.0 mL為實驗組,以不加粗提物的LB培養基為對照組,分別加入200 μL溫和氣單胞菌懸液(106CFU/mL),37 ℃恒溫靜置培養24 h,肉眼觀察,無渾濁現象的最低濃度為粗提物的最小抑菌濃度[19],每組重復3次。

1.2.7 乳酸菌CFS作用溫和氣單胞菌細胞電鏡分析 在含有106CFU/mL的菌懸液中加入0.5 MIC和1.0 MIC細菌素粗提物,以不加細菌素粗提物的為對照組,37 ℃靜置培養12 h。6500 r/min,10 min離心收集菌體,在2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定過夜,用0.1 mol/L(pH7.2)PBS洗滌2次洗去殘留戊二醛,分別用40%、70%、90%、100%乙醇對菌體細胞進行脫水處理15 min,將菌體膜涂在蓋玻片上,自然晾干,噴金,掃描電鏡觀察。

1.2.8 實驗數據處理 利用軟件Origin 8.0進行實驗數據處理,數據平行3次,結果用平均值±標準偏差表示,采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計學分析。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌菌株分離

從傳統發酵蔬菜中共分離獲得36個菌落,其中革蘭氏染色陽性,過氧化氫酶實驗為陰性的菌株確定為乳酸菌。經初步鑒定得到23株乳酸菌,純化后按照來源以及挑取順序命名。

2.2 拮抗性乳酸菌的篩選

從傳統農家發酵蔬菜中分離的23株乳酸菌中篩選出8株對溫和氣單胞菌具有拮抗作用的乳酸菌,結果見表1,從來自寧城腌漬酸辣椒、彰武酸黃瓜、績溪酸豆角和腌雪菜中分離獲得拮抗溫和氣單胞菌的乳酸菌菌株。其中,菌株LZH2-5拮抗效果最好,菌懸液和無細胞上清液的抑菌直徑分別為19.34 mm和18.35 mm,因此,選取菌株LZH2-5進行后續實驗。圖1是菌株AJD1-1、LZH1-3和LZH2-5菌懸液和上清液對溫和氣單胞菌的抑菌效果圖,可以看出菌懸液和上清液均具有顯著的抑菌作用。

圖1 分離菌株菌懸液和無細胞上清液對溫和氣單胞菌的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effects of cell suspension and CFS produced by isolated strains on A. sobria

2.3 拮抗性乳酸菌的鑒定

菌株LZH2-5的生理生化鑒定結果見表2,依照文獻[17]可初步判定菌株LZH2-5為乳桿菌屬的Lb.plantarum。

表2 菌株LZH2-5的生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain LZH2-5

注:“+”表示陽性;“-”表示陰性。

圖2 菌株LZH2-5的16S rRNA基因擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain LZH2-5

圖3 菌株LZH2-5的16S rRNA系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree for sequences of strain LZH2-5

圖2是菌株LZH2-5的16S rRNA基因擴增電泳圖,從圖中可以看到特異性亮帶出現在1450 bp處,表明目標片段已成功擴增。將擴增后產物送至生物工程公司進行測序,從而獲得菌株LZH2-5的16S rRNA核苷酸序列,序列號為KX538921。測序菌株得到的結果與NCBI數據庫進行BLAST比對,選取相似性較高的幾個菌株的16S rRNA序列,利用MEGA 5.0構建系統發育樹,結果見圖3。由圖3可知,菌株LZH2-5與KC416990.1(Lb.plantarum)在同一個分支上,置信度為99%,因此菌株LZH2-5被鑒定為植物乳桿菌(Lb.plantarum),該結果與生理生化鑒定結果相同。

2.4 乳酸菌生長與拮抗活性曲線

菌株LZH2-5 經37 ℃靜置培養40 h的pH、生長曲線及對溫和氣單胞菌的抑菌活性的動態變化情況如圖4所示,由圖4可知,菌株LZH2-5對溫和氣單胞菌抑菌活性與細胞生長量兩者之間呈現同步增長的趨勢,但在穩定期呈平穩狀態。隨著抑菌活性與細胞生長量的增加,pH呈現迅速下降在16 h后逐步趨于平穩。LZH2-5對溫和氣單胞菌的最大抑菌活性為培養28 h的CFS,表明在穩定后期菌株LZH2-5產生了抑菌活性物質,因此菌株28 h發酵液的CFS可作為研究LZH2-5抑菌作用的最佳選擇。

圖4 菌株LZH2-5生長及拮抗活性曲線Fig.4 The growth and antagonisticactivity curve of strain LZH2-5

2.5 乳酸菌拮抗性能研究結果

2.5.1 酶處理的影響 菌株LZH2-5的CFS經胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶37 ℃處理2 h后對溫和氣單胞菌的抑菌結果見表3,從中可以看出,與對照組相比,經蛋白酶處理后對溫和氣單胞菌的抑菌活性均降低,對胰蛋白酶的敏感性最高,活性喪失率為29.38%,其次是木瓜蛋白酶,活性喪失率為23.93%,變化最小的為胃蛋白酶。經胃蛋白酶酶處理后,菌株LZH2-5的活性與對照組呈顯著性差異。從酶處理的結果來看,可知LZH2-5的抑菌活性物質具有蛋白性質,可初步判定LZH2-5所產生的抑菌物質為細菌素類。

表3 酶處理對菌株LZH2-5抗溫和氣單胞菌活性的影響Table 3 Effects of enzyme treatment on the antagonistic activity of strain LZH2-5 against A. sobria

表4 pH處理對菌株LZH2-5 CFS抗溫和氣單胞菌活性的影響Table 4 Effects of pH on the antagonistic activity of CFS of LZH2-5 against A. sobria

2.5.2 熱處理的影響 經過不同溫度的熱處理后,菌株LZH2-5的CFS抑菌活性變化結果如圖5所示。由圖5可以看出,菌株LZH2-5的代謝產物經40、60和80 ℃處理30 min后,抑菌活性基本保持不變,表明其代謝產物穩定性良好。這和Miao等[20]的研究結果一致。而經100 ℃、121 ℃處理30 min對溫和氣單胞菌的抑制活性分別下降了16.66%和25.40%。

圖5 熱處理對菌株CFS抗溫和氣單胞菌活性的影響Fig.5 Effects of thermal treatment on the antagonistic activity of CFS against A. sobria

2.5.3 pH處理的影響 不同pH條件下菌株LZH2-5的CFS對溫和氣單胞菌的抑菌活性變化情況如表4所示,從表4中可看出,乳酸菌的抑菌活性隨著pH的升高呈現逐漸降低趨勢,其中,當pH3.0時,抑菌效果最好。表明菌株CFS中除含有乳酸等酸性代謝物質,還具有其他抑菌活性成分,且該抑菌成分在酸性條件下活性較好。LV等[21]研究從中國傳統發酵食品中分離的Lb.coryniformisMXJ 32通過產生LactocinMXJ 32A拮抗多種食源性致病菌并且表現出良好的pH耐受性和熱穩定性。

2.6 最小抑菌濃度(MIC)的測定結果

肉眼觀察12.0 mg/mL及其以上濃度的試管無渾濁現象,確定12.0 mg/mL為粗提物對溫和氣單胞菌的MIC。該結果與張文青等[22]研究86種中草藥對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為12.5 mg/mL的結果相似。

2.7 菌體細胞掃描電鏡

圖6是掃描電鏡觀察到的經LZH2-5處理后溫和氣單胞菌細胞結構的變化,該圖直觀的反映出LZH2-5對菌體形態的影響。未經處理的溫和氣單胞菌(A)細胞完整，胞膜平滑,形態完整,邊緣整齊清晰,兩端圓潤;加入0.5 MIC濃度的LZH2-5處理后(B),菌體細胞塌陷,細胞膜表面不平整失去了圓潤的弧狀形態。加入1.0MIC濃度的LZH2-5處理后(C),菌體變形出現孔洞并且開始溶脹,細胞壁已經嚴重變形破裂。說明LZH2-5能夠破壞溫和氣單胞菌的細胞結構,結果與Lu等[23]研究一致。

圖6 LZH2-5處理對溫和氣單胞菌細胞結構的影響Fig.6 Effects of LZH2-5 on the cells structure of A. sobria注A:未經處理的1.00 μm視野下的細胞形態;B:經0.5 MIC處理的1.00 μm視野下的細胞形態;C:經1.0 MIC處理的3.00 μm視野下的細胞形態。

3 結論

從遼寧彰武傳統腌漬酸黃瓜中篩選出對溫和氣單胞菌具有較好拮抗效果的乳酸菌菌株LZH2-5,經生理生化和16S rRNA鑒定為植物乳桿菌(Lb.plantarum)。經37 ℃恒溫靜置培養28 h后的CFS抑菌活性最強,酸性環境可使抑菌活性增強,在pH4.0以下均能抑制溫和氣單胞菌生長,該菌的抑菌物質熱穩定性好。菌株CFS經不同蛋白酶處理后抑菌活性均有下降,掃描電鏡結果表明經LZH2-5CFS處理使溫和氣單胞菌細胞結構破壞并溶解,可初步推測抑菌活性物質為細菌素類。

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Screening and identification of lactic acid bacteria with antagonistic activity againstAeromonassobriafrom traditional fermented vegetables

LIN Yang1,MA Huan-huan1,LV Xin-ran2,SUN Meng-tong1,BAI Feng-ling1,*,LI Jian-rong1

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.College of Biology Science and Technology,Beijing Forest University,Beijing 100083,China)

Objective:To screen lactic acid bacteria(LAB)with strong antagonistic activity againstAeromonassobriafrom traditional fermented vegetables. Methods:Cell-free supernatants(CFS)from LAB with inhibitory activity againstA.sobriawas screened using the double agar diffusion methods. The strain was identified by biochemical tests and 16S rRNA sequence analysis. The antibacterial substance was analyzed using protease sensitivity test,acid test and heat-treated test. The integrity of cell structure was observed by scanning electron microscope. Results:Strain LZH2-5 with outstanding antagonistic activity againstA.sobria(106CFU/mL)was screened from pickled cucumbers,and it was identified asLactobacillusplantarum. The antagonistic activity of cell-free supernatants produced by strain LZH2-5 was lost 29.38%,23.93%,22.30%,19.47% and 14.59% by treating with trypsin,papain,neutral protease,alkaline protease and pepsin respectively. The antibacterial activity of CFS was stable after thermal treatment with 40,60,80 ℃ for 30 min,and decreased 16.66% and 25.40% after incubation at 100 ℃ and 121 ℃ for 30 min,respectively,and was effective within pH3.0～4.0. The MIC of inhibitory substance was 12.0 mg/mL. The scanning electron microscope images revealed that the integrity of cell ofA.sobriatreated with LZH2-5 CFS was damaged and dissolving. Conclusion:Lb.plantarumLZH2-5 with strong inhibitory activity againstA.sobriawas screened from pickled cucumbers. The antibacterial substance produced by strain LZH2-5 was preliminarily determined as bacteriocins. It can be used as the antagonism original strain for the controlA.sobriain aquaculture.

traditional fermented vegetables;lactic acid bacteria;antagonism;Aeromonassobria;screening and identification

2016-08-09

林洋(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質量控制，E-mail：linyang19940109@163.com。

*通訊作者:白鳳翎(1964-),男，博士，教授，研究方向：食品安全與質量控制和食品微生物學，E-mail：baifling@163.com。

遼寧省科技廳攻關項目(2015103020)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)04-0231-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.035