常壓室溫等離子體快速誘變選育高產(chǎn)單寧酶菌株

熊 進(jìn),吳鑫穎,邱樹毅,*,簡(jiǎn) 輝,周羅娜,任佳明

(1.廣州市微生物研究所,廣東廣州 510663;2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽 550025)

常壓室溫等離子體快速誘變選育高產(chǎn)單寧酶菌株

熊 進(jìn)1,2,吳鑫穎2,邱樹毅2,*,簡(jiǎn) 輝2,周羅娜2,任佳明2

(1.廣州市微生物研究所,廣東廣州 510663;2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽 550025)

采用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)處理黑曲霉B0201,選育高產(chǎn)單寧酶突變株,為單寧酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。確定等離子體處理?xiàng)l件,采用稀釋平板培養(yǎng)法挑選突變株,利用變色圈法和分光光度法測(cè)定產(chǎn)酶量,獲得最佳誘變時(shí)間為180 s,正突變率高達(dá)19%。通過2%的高濃度單寧酸顯色平板初篩850株菌,液態(tài)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩90株菌,得到高產(chǎn)單寧酶的菌株B1401。誘變后單寧酶酶活為17.61 U/g,是原始菌株酶活8.94 U/g的2倍左右,且傳代菌種產(chǎn)單寧酶穩(wěn)定性良好。

單寧酶,黑曲霉,常壓室溫等離子體,誘變選育

單寧酶(Tannase,EC 3.1.1.20),能夠水解單寧中的酯鍵和縮酚酸鍵,被廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工、皮革、飼料、制藥、食品飲料等領(lǐng)域。美國(guó)食品與藥物管理局已經(jīng)確定單寧酶為安全食品,其在日本也被批準(zhǔn)可以用于食品工業(yè)。單寧酶是一種誘導(dǎo)酶,可由某些微生物在單寧酸等誘導(dǎo)物存在的條件下誘導(dǎo)合成[1]。目前僅有少數(shù)公司實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)單寧酶,主要有印度百康公司、日本龜甲萬公司、德國(guó)ASA特別酶有限公司[2],能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)單寧酶，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和實(shí)際意義。

國(guó)內(nèi)暫時(shí)沒有實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)單寧酶,其主要與菌株產(chǎn)單寧酶活性不高、產(chǎn)酶不穩(wěn)定及分離純化困難有關(guān)[3-5]。利用現(xiàn)代生物技術(shù)選育高產(chǎn)、高活力、能穩(wěn)定遺傳的菌株成為研究熱點(diǎn)。常用于提高菌株產(chǎn)單寧酶的誘變方法有紫外線、N+離子注入、3-硝基-5-甲胍、硫酸二乙酯等,但其誘變方法對(duì)操作人員有一定的危險(xiǎn)性,且誘變方法普遍對(duì)酶活提高不大,菌種遺傳穩(wěn)定差等特點(diǎn)。

常壓室溫等離子體育種機(jī)(ARTP)作用于微生物,能產(chǎn)生溫度低、均勻、種類豐富的等離子射流,具有突變高效、操作簡(jiǎn)單、人員安全等特點(diǎn),已有研究表明該誘變技術(shù)易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株[6],對(duì)多種菌株具有較好的誘變效果[7-8]。本文采用常壓室溫等離子體快速誘變系統(tǒng)對(duì)黑曲霉的孢子懸浮液進(jìn)行誘變,通過建立改良平板初篩培養(yǎng)基以及菌種保藏培養(yǎng)基的方法,并采用搖瓶發(fā)酵測(cè)酶活復(fù)篩,以期篩選出傳代菌種產(chǎn)單寧酶穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)突變株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔗糖、葡萄糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、瓊脂、檸檬酸、檸檬酸三鈉、溴酚藍(lán)等試劑 分析純,國(guó)藥集團(tuán);單寧酸 分析純,天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;黑曲霉B0201(AspergillusnigerB0201) 由貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室紫外誘變?cè)己谇咕旰Y選出來,菌種在4 ℃條件下保存在察氏斜面培養(yǎng)基上。

常壓室溫等離子體(ARTP)誘變系統(tǒng)Ⅱ 無錫思清源生物科技有限公司;UV-2550紫外可見分光光度計(jì) 蘇州儀器有限責(zé)任公司;XW-80旋渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 察氏液態(tài)培養(yǎng)基:按常規(guī)配方配制。

1.2.1.1改良后的平板初篩培養(yǎng)基 蔗糖10 g/L、硝酸鈉3 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、氯化鉀0.5 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L、瓊脂40 g/L、單寧酸20 g/L、溴酚藍(lán)0.04 g/L,調(diào)節(jié)pH=5.5左右。

1.2.1.2 改良后的菌種保藏斜面培養(yǎng)基 蔗糖20 g/L、硝酸鈉3 g/L磷酸氫二鉀1 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、氯化鉀0.5 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L、瓊脂30 g/L、單寧酸10 g/L,調(diào)節(jié)pH=5.5左右。

1.2.1.3 基礎(chǔ)發(fā)酵液態(tài)培養(yǎng)基 單寧酸40 g/L、葡萄糖25 g/L、(NH4)2SO410 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、NaCl 1 g/L,pH5.0。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 實(shí)驗(yàn)室保存的黑曲霉B0201(AspergillusnigerB0201)菌種,轉(zhuǎn)接入菌種斜面保藏培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)4 d,獲得出發(fā)菌株。將斜面培養(yǎng)基活化好的菌種,加入10 mL的生理鹽水洗脫孢子,經(jīng)無菌脫脂棉,放入含有察氏液態(tài)培養(yǎng)基的三角瓶中,用玻璃珠將孢子充分打散,30 ℃、150 r/min充分培養(yǎng)使孢子萌發(fā),等待孢子處于剛剛萌發(fā)狀態(tài),取此狀態(tài)的孢子作為誘變對(duì)象。并將孢子濃度調(diào)整到107個(gè)孢子/mL,取0.5 mL菌懸液于1.5 mL滅菌的EP管中,并充分振蕩混勻,作為原液。

1.2.3 ARTP系統(tǒng)誘變方法 利用清華大學(xué)化工系自主開發(fā)的常壓室溫等離子體育種機(jī)(ARTP)對(duì)黑曲霉的孢子懸浮液進(jìn)行誘變。該裝置操作簡(jiǎn)單,在一定的電源功率、工作氣流量、等離子體發(fā)射源與樣品之間距離的條件下,誘變主要的可變操作參數(shù)是處理時(shí)間[9]。本裝置主要以氦氣為工作氣體,在下文的ARTP操作條件下,要獲得致死率曲線,尋找最佳的誘變條件。因此,取孢子懸浮原液10 μL均勻涂布于ARTP系統(tǒng)無菌金屬片上,將金屬片移至處理倉內(nèi),調(diào)節(jié)金屬片的位置,設(shè)定儀器輸入電壓(100 W)、處理距離(2 mm)、氣體流入速率(12 L/min)、處理時(shí)間(30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 s)等參數(shù)。一次處理時(shí)間從30 s開始依次增加直到300 s,取在金屬片上各不同照射時(shí)間的樣品用無菌水稀釋一定倍數(shù),利用旋渦混合儀使稀釋液混合均勻并取100 μL涂布初篩平板,每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行,以未經(jīng)ARTP處理的孢子懸浮原液(處理0 s)涂布的平板做對(duì)比,利用CFU方法來計(jì)算致死率和正突變率。具體計(jì)算公式如下:

致死率(%)=(誘變前形成的菌落數(shù)-誘變后形成的菌落數(shù))/誘變前形成的菌落數(shù)×100

加強(qiáng)縣鄉(xiāng)人大工作和建設(shè)是堅(jiān)持和完善人民代表大會(huì)制度、加強(qiáng)基層國(guó)家政權(quán)建設(shè)的可靠保證。在中國(guó)特色社會(huì)主義進(jìn)入新時(shí)代這一新的歷史條件下，縣鄉(xiāng)人大只有與時(shí)俱進(jìn)、創(chuàng)新發(fā)展，才能為社會(huì)主義民主法治建設(shè)作出新的更大貢獻(xiàn)。

正突變率(%)=正突變的菌株數(shù)/誘變后的活菌落數(shù)×100

1.2.4 篩選方法

1.2.4.1 平板初篩 將經(jīng)過ARTP育種機(jī)一次誘變后的孢子懸浮液,稀釋一定倍數(shù)并振蕩均勻后涂布于改良后的平板初篩固體培養(yǎng)基上。在30 ℃條件下培養(yǎng),每天定時(shí)觀察,待平板上出現(xiàn)明顯菌落后,將單一菌落轉(zhuǎn)移入一個(gè)滅菌后的初篩固體培養(yǎng)皿正中央繼續(xù)培養(yǎng)3 d左右,測(cè)定菌落周圍由紫色變?yōu)辄S色變色圈直徑(H)與菌落直徑(D)的大小,以H/D比值初步衡量菌株產(chǎn)單寧酶的能力大小。然后挑選出H/D比值較大的菌落進(jìn)行純化并保存于斜面試管中[10]。

1.2.4.2 復(fù)篩 將初篩所得菌株接種于基礎(chǔ)發(fā)酵液態(tài)培養(yǎng)基中,接種量1 mL(108個(gè)孢子/mL)、裝液量50 mL,四層無菌紗布封口,30 ℃、140 r/min的搖床培養(yǎng),每瓶加入適量的玻璃珠,發(fā)酵3 d,測(cè)定胞內(nèi)酶酶活。

1.2.5 胞內(nèi)粗酶液的制備方法 將發(fā)酵物進(jìn)行過濾,收集發(fā)酵菌絲,先用蒸餾水沖洗三遍,然后再用pH5.0的檸檬酸緩沖溶液(0.05 mol/L檸檬酸和0.05 mol/L檸檬酸三鈉混合配制)沖洗三次,盡量排除水分,保存菌絲。將菌絲均分為兩部分,一部分在70 ℃烘干4 h,便于測(cè)定菌體干重;另一部分用于測(cè)定酶活,首先將收集到的菌絲體冷凍2 h左右,再將菌絲、石英砂、檸檬酸緩沖液按質(zhì)量比1∶1∶5在冰浴的條件下充分研磨破碎細(xì)胞,在4 ℃低溫6000 r/min離心機(jī)下離心20 min,最后收集離心上清液定容到25 mL作為待測(cè)胞內(nèi)酶粗酶液。

1.2.6 酶活的測(cè)定 酶活的測(cè)定參考Shweta Sharma[11]和保玉心[12]的檢測(cè)方法,并做相關(guān)改進(jìn)。取三支潔凈的試管分別標(biāo)記為空白管、測(cè)試管、對(duì)照管。40 ℃水浴預(yù)熱底物10 mmol/L沒食子酸丙酯以及粗酶液5 min。在三支試管中都加入0.25 mL沒食子酸丙酯溶液,將0.25 mL、0.05 mol/L、pH=5.0的檸檬酸緩沖液加入到空白管中,將0.25 mL粗酶液加入到測(cè)試管中,后將三支試管都放入40 ℃水浴中準(zhǔn)確計(jì)時(shí)10 min,期間要搖晃混合均勻。然后在所有試管中都準(zhǔn)確加入0.3 mL甲醇繞丹寧(0.05 mol/L)溶液,40 ℃水浴中保溫5 min,再取濃度為0.5 mol/L的KOH的溶液0.2 mL加入所有試管中,在40 ℃水浴中保溫5 min,立即僅在對(duì)照管的反應(yīng)混合物中加入0.25 mL粗酶液。最后每支試管都用4 mL蒸餾水稀釋,在40 ℃下保溫5～10 min后,在520 nm波長(zhǎng)下用蒸餾水做空白,測(cè)定反應(yīng)混合物的吸光值。所有測(cè)試都做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),取算術(shù)平均值。

酶單位活力(U)定義為:在40 ℃、pH5.0的條件下,每分鐘產(chǎn)生1 μmol沒食子酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

相對(duì)酶活(U/g)定義為:每克菌體干重(70 ℃烘干4 h)具有的酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變時(shí)間對(duì)黑曲霉B0201孢子致死率、正突變率的影響

通過菌落計(jì)數(shù)以及測(cè)定酶活,統(tǒng)計(jì)出正突變株數(shù)目。以致死率(%)和正突變率(%)為縱坐標(biāo),時(shí)間(s)為橫坐標(biāo)可作出這株菌進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變的情況,見圖1。

圖1 ARTP誘變時(shí)間對(duì)黑曲霉孢子致死率、正突變率的影響Fig.1 Influence of ARTP radiation time on mortality and mutation rate on Aspergillus niger

圖1所示,對(duì)黑曲霉的孢子ARTP誘變處理,隨著時(shí)間的遞增,菌體的致死率在前90 s急劇上升,處理90 s時(shí)致死率接近95%,說明黑曲霉孢子對(duì)誘變很敏感;處理150 s時(shí),致死率出現(xiàn)了下降達(dá)到90%,這可能是因?yàn)槲⑸镒晕倚迯?fù)功能起作用;處理210 s以后致死率達(dá)到97%左右;處理300 s致死率接近100%,致死率曲線與劉燕等[13]采用ARTP誘變黑曲霉致死率曲線圖形趨勢(shì)相吻合。常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)產(chǎn)生均勻而溫和的等離子體射流,引發(fā)種類豐富的DNA損傷并且獲得大容量突變庫[14],然而突變的發(fā)生具有隨機(jī)性,致死率和正突變之間的關(guān)系沒有直接的線性關(guān)系,正突變的發(fā)生可能與其誘變參數(shù)和菌株特性相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)通過篩選得出正突變菌株數(shù)與存活菌株數(shù)的比值得到正突變曲線,與肖建成等[15]采用ARTP誘變黑曲霉菌株正突變株最高達(dá)28%的正突變率曲線圖形趨勢(shì)相吻合。由圖1隨誘變處理時(shí)間在180 s時(shí),正突變率有最大值達(dá)到19%,與致死率下降時(shí)處理時(shí)間為150 s稍微延后,可能是微生物內(nèi)部一個(gè)修復(fù)并調(diào)整的過程。本實(shí)驗(yàn)為了便于挑選最有可能的單菌落,在180 s時(shí)修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生正突變最佳時(shí),選擇此時(shí)的條件參數(shù)進(jìn)行篩選,正突變率相對(duì)較多。

2.2 黑曲霉突變體的初篩

在S Bradoo和郭魯宏等人的研究基礎(chǔ)上,誘變前后采用2%的單寧酸和1%的蔗糖為平板初篩唯一碳源來源,并且加入了少量溴酚藍(lán),培養(yǎng)基3 d,顏色開始由紫色變?yōu)辄S色,在菌落周圍形成明顯的變色圈,變色圈直徑和菌落直徑大小同該菌之產(chǎn)酶水平呈相關(guān)性,根據(jù)計(jì)算出來的比值作為出發(fā)菌株進(jìn)行復(fù)篩。在相同生長(zhǎng)時(shí)間和條件下,誘變前后結(jié)果見圖2和圖3。

圖 2誘變前Fig.2 Before radiation

圖3 誘變后Fig.3 After radiation

通過圖2與圖3誘變前后的比較,誘變后有明顯的變色圈,并且菌株在相同濃度單寧酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力較強(qiáng),菌落直徑與誘變前相比變大。說明黑曲霉通過誘變后產(chǎn)酶能力提高。

根據(jù)觀察,初步挑選變色圈較大的菌株,測(cè)定變色圈直徑(H)和菌落直徑(D),以H/D比值來衡量菌株產(chǎn)單寧酶的能力大小,從850株菌株中挑選H/D比值比較大或者形態(tài)較為特殊的90株,透明圈直徑和菌落直徑大小及H/D比值見表1。其中原菌株為出發(fā)菌株B0201,其他編號(hào)分別代表不同的菌株。

表1 初篩結(jié)果Table 1 Screening results

注:測(cè)量直徑誤差為±1 mm。。

由表1可知,挑選的850株菌株在篩選平板上篩選,通過觀察變色圈大小、挑選測(cè)量透明圈和菌落直徑較佳的菌落,計(jì)算出H/D比值。透明圈直徑和菌落直徑都有不同程度上的變化,初步根據(jù)形態(tài)大小和H/D比值大小作為標(biāo)準(zhǔn)。由表1可知,H/D比值小于1.2的只有2菌株,H/D比值在1.2至1.3之間的有7株,H/D比值在1.3至1.4之間的有16株,H/D比值在1.4至1.5之間的有52株,H/D比值在1.5至1.6之間的有11株,H/D比值在1.6以上的有2株;篩選的菌株H/D比值大多數(shù)落在1.4值1.5之間,其中H/D比值最大的為1.622,最小為1.16。由于在平板初篩的過程中,平皿中培養(yǎng)基的厚薄、直徑測(cè)量誤差、單菌落轉(zhuǎn)移時(shí)占區(qū)域存在的誤差,導(dǎo)致H/D比值只能作為反應(yīng)酶活的重要參數(shù)。因此將篩選得到90株菌株進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

表2 復(fù)篩結(jié)果Table 2 Rescreening results

表3 產(chǎn)酶穩(wěn)定性Table 3 Enzyme production stability

2.3 黑曲霉突變體的復(fù)篩

發(fā)酵完成后,對(duì)胞內(nèi)粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定,其測(cè)定結(jié)果詳見表2。

由表2可知,初步挑選出90株菌株,然后搖瓶發(fā)酵,共篩選出11株產(chǎn)酶較高的菌株,菌株編號(hào)分別是8、23、40、42、44、60、64、71、79、80、87,其中91%的菌株來自H/D比值為1.4至1.5之間,說明H/D比值較高或較低都不利于得到高產(chǎn)單寧酶菌株,對(duì)多次誘變篩選具有指導(dǎo)意義。復(fù)篩得到最大酶活為菌株編號(hào)40(初步命名為B1401)達(dá)到17.61 U/g,是原始出發(fā)菌株酶活8.94 U/g的2倍左右。

2.4 菌株的遺傳穩(wěn)定性

B1401經(jīng)過10次連續(xù)傳代培養(yǎng),結(jié)果見表3。

采用ARTP誘變一次的菌株,篩選獲得的菌株經(jīng)過改良后的菌種保藏斜面培養(yǎng)基保藏菌種,經(jīng)10次連續(xù)傳代酶活基本保持穩(wěn)定,說明通過ARTP誘變技術(shù)處理獲得的菌株B1401性能穩(wěn)定,改良的菌種保藏培養(yǎng)基良好。

3 結(jié)論

由于通過紫外線獲得的單寧酶產(chǎn)生菌B0201經(jīng)過幾年研究多次傳代,產(chǎn)單寧酶酶活力下降較大,故將常壓室溫等離子體誘變技術(shù)應(yīng)用于單寧酶產(chǎn)生菌B0201的誘變選育,突破了傳統(tǒng)的理化誘變方法,為黑曲霉菌株誘變提供了新的思路和技術(shù)手段,誘變后表現(xiàn)出良好效果。實(shí)驗(yàn)利用黑曲霉孢子剛剛萌發(fā)的狀態(tài)進(jìn)行誘變,黑曲霉孢子對(duì)誘變處理比較敏感,在90 s致死率達(dá)到95%以上;誘變處理時(shí)間180 s時(shí),正突變率達(dá)到最大值19%。實(shí)驗(yàn)通過改良的平板篩選培養(yǎng)基以及菌種保藏斜面培養(yǎng)基,篩選獲得850株菌,根據(jù)H/D比值較大的或形態(tài)較為特殊的菌株挑選出90株菌,對(duì)其液態(tài)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,得到產(chǎn)單寧酶菌株B1401,其中產(chǎn)酶較高的菌株中有91%的菌株來自H/D比值為1.4至1.5之間。單寧酶產(chǎn)酶菌株B1401,液態(tài)搖瓶發(fā)酵產(chǎn)單寧酶酶活為17.61 U/g,是原始菌株酶活8.94 U/g的2倍左右。經(jīng)過10次傳代培養(yǎng),菌株產(chǎn)單寧酶酶活力表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。為了更好的獲得優(yōu)良菌株,可以分批次的繼續(xù)采用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)進(jìn)行再次誘導(dǎo)。

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[15]肖建成,陳楠,江慰,等.ARTP誘變及高效篩選高產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016,35(5):525-530.

中科院建立工業(yè)產(chǎn)油微藻基因敲低技術(shù)

微藻通過光合作用將二氧化碳、光和水轉(zhuǎn)化為油脂，因此，作為一種潛在的清潔能源生產(chǎn)和二氧化碳高值化方案，工業(yè)產(chǎn)油微藻受到了廣泛關(guān)注。然而，藻類高效遺傳工具的匱乏，一直是工業(yè)產(chǎn)油微藻分子育種和光驅(qū)固碳合成生物技術(shù)的重要瓶頸之一。中科院青島生物能源與過程研究所(以下簡(jiǎn)稱青島能源所)與中科院水生生物研究所合作，以微擬球藻為模式，率先建立了工業(yè)產(chǎn)油微藻基因敲低技術(shù)。這里的微擬球藻是一種可利用海水或淡水在室外大規(guī)模培養(yǎng)的工業(yè)微藻，具有生長(zhǎng)速度快、二氧化碳耐受能力強(qiáng)、強(qiáng)勁積累油脂和高值不飽和脂肪酸等優(yōu)點(diǎn)，因此已經(jīng)成為能源與經(jīng)濟(jì)微藻領(lǐng)域的研究模式藻種之一，也成為國(guó)內(nèi)外許多微藻固碳示范工程的優(yōu)先選擇。

青島能源所單細(xì)胞中心博士后學(xué)者魏力告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》記者：“然而反向遺傳工程技術(shù)的匱乏，從根本上阻礙了針對(duì)二氧化碳固定能力和產(chǎn)油效率等諸多工業(yè)性狀的遺傳改造。”為此，魏力帶領(lǐng)的研究小組在海洋微擬球藻中，基于RNA干擾技術(shù)，通過設(shè)計(jì)靶基因的反向重復(fù)序列，形成特異莖環(huán)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了碳酸酐酶和碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等碳代謝相關(guān)基因的高效、特異性敲低，基因沉默株構(gòu)建的成功率達(dá)到40%以上。在水生生物研究所研究員胡晗華的指導(dǎo)下，魏力通過重亞硫酸測(cè)序方法，發(fā)現(xiàn)在基因沉默株中，靶基因的特定區(qū)域展示出獨(dú)特的甲基化規(guī)律，從而揭示了靶基因沉默的分子機(jī)制。研究人員還證明該技術(shù)對(duì)于另一海洋微擬球藻藻株CCMP1779也同樣高效，表明該技術(shù)具有通用性。早在今年8月19日，《植物學(xué)雜志》(The Plant Journal)就報(bào)道了青島能源所單細(xì)胞中心以微擬球藻為模式，率先建立了基于Cas9/gRNA的工業(yè)產(chǎn)油微藻基因組編輯技術(shù)，打開了其反向遺傳工程的大門。日前，The Plant Journal再次以技術(shù)進(jìn)展(Technical Advance)的形式，刊登該研究團(tuán)隊(duì)在微擬球藻遺傳工程方法學(xué)平臺(tái)的突破。青島能源所單細(xì)胞中心主任徐健告訴記者：“靶向基因敲低技術(shù)和基因組編輯技術(shù)各有特色、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，因此兩個(gè)技術(shù)平臺(tái)的建立、聯(lián)用和業(yè)界共享將推動(dòng)工業(yè)固碳微藻合成生物學(xué)的發(fā)展，也將對(duì)能源微藻分子育種技術(shù)產(chǎn)生積極而深遠(yuǎn)的影響。”

摘自：中國(guó)科學(xué)報(bào)

The rapid mutant strains of high tannase yield obtained by atmospheric and room temperature plasmas

XIONG Jin1,2,WU Xin-ying2,QIU Shu-yi2,*,JIAN Hui2,ZHOU Luo-na2,REN Jia-ming2

(1.Guangzhou Institute of Microbiology,Guangzhou 510663,China;2.College of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Atmospheric and room temperature plasmas(ARTP)was used to induceAspergillusnigerB0201,in order to obtain mutant strains with enhanced ability to produce tannase. The optimal treatment condition were determined,and dilution pate culture method was used to screen mutant strains. The color changing circle method and spectrophotometry was used to analyze tannase production,and the best mutation time was 180 s,and the positive mutation rate was 19%. The high concentration of 2% tannic acid was utilized for color plate screening 850 strains. 90 strains of bacteria were screened by liquid shake flask fermentation,and the strain of extraordinary yield of B1401 was achieved. After the mutation,the enzyme activity was 17.61 U/g,which was about double as much as that of the original strain 8.94 U/g,and the stability of the enzyme production was good.

tannase;Aspergillusniger;atmospheric and room temperature plasma;mutation breeding

2016-06-08

熊進(jìn)(1989-)，男，碩士，助理工程師，研究方向：制藥與發(fā)酵工藝，E-mail:591538059@qq.com。

*通訊作者:邱樹毅(1963-)，男，博士，教授，研究方向：應(yīng)用生物技術(shù)，E-mail:syqiu@gzu.edu.cn。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863 計(jì)劃)項(xiàng)目(2014AA021802)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)04-0225-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.034