兩株擬除蟲菊酯類農藥降解菌的分離鑒定及其降解能力的研究

劉 波,唐 潔,陳廷廷,史 穎,曾 林,曾朝懿

(西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039)

兩株擬除蟲菊酯類農藥降解菌的分離鑒定及其降解能力的研究

劉 波,唐 潔*,陳廷廷,史 穎,曾 林,曾朝懿

(西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039)

通過富集培養、梯度馴化方法,以擬除蟲菊酯類農藥降解率為指標,從菜園耕地土壤中分離篩選到兩株可廣譜降解擬除蟲菊酯類農藥的降解菌Q-7和G-04。經形態學觀察、生理生化實驗及16S rRNA基因序列分析,菌株Q-7鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus),菌株G-04鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。兩株降解菌都具備較強的擬除蟲菊酯類農藥耐受性,可在同時含高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯,且累積濃度為640 mg/L的培養基中生長。兩株降解菌能同時降解初始濃度分別為50 mg/L的高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和聯苯菊酯,接種培養72 h后,菌株Q-7對高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯的降解率分別為48.31%、64.31%、33.46%、26.52%,菌株G-04的相應降解率為66.94%、45.04%、29.40%、26.40%。研究結果表明,菌株Q-7和菌株G-04具備廣譜降解擬除蟲菊酯類農藥的能力,可作為修復擬除蟲菊酯類農藥污染環境的優良微生物資源。

擬除蟲菊酯類農藥,蠟樣芽胞桿菌,地衣芽孢桿菌,生物降解

農作物是人類賴以生存和發展的重要食品,易發生病蟲害,常用農藥防治,以提高農作物品質和產量。但農藥的大量使用使作物、土壤及水源受到不同程度污染,嚴重威脅環境和食品安全。目前擬除蟲菊酯類農藥以其殺蟲廣譜、高效、低殘留、性質穩定、安全系數高等優點,在防治農業害蟲方面具有廣泛應用[1];又因其應用范圍廣、接觸人群多、有蓄積性等,從而引起農殘超標、水土污染、人體中毒等現象頻發[2-4]。由于擬除蟲菊酯類農藥理化性質比較穩定,具有耐光、熱分解,且殘留范圍廣,傳統物理化學方法處理難度大、成本高[5]。與其他方法相比,微生物降解具有降解速度快、操作簡單、成本低、無二次污染等優點[6-7]。目前,國內外學者已經從自然界中分離得到了包括細菌、真菌及放線菌等在內的擬除蟲菊酯類農藥降解菌株,如沙雷氏菌屬(Serratia)[8]、微球菌屬(Micrococcus)[9]、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[10]、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)[11]、腸桿菌屬(Ehterobactesp.)[12]、產堿桿菌屬(Alcaligenessp.)[13]、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)[14]、氣單胞菌屬(Aeromonas)[15]、克雷伯菌屬(Klebsiella)[16]、枝孢屬(Cladosporium)[17]和紅球菌屬(Rhodococcus)[18]等。但多數是針對單一或少數幾種擬除蟲菊酯類農藥進行的,以多種擬除蟲菊酯類農藥為底物篩選具備廣譜降解能力微生物菌株的研究報道并不多見,且大多數擬除蟲菊酯類農藥降解菌對高濃度農藥的適應性差,降解能力偏低。

我國耕地自然環境復雜,農藥污染種類多,污染程度差異較大。因此,篩選高效廣譜,適應性強,環境友好的降解菌株是解決上述問題的根本方法。本研究從耕地土壤中分離篩選出兩株擬除蟲菊酯類農藥高效降解菌Q-7和G-04,通過形態學觀察、生理生化實驗以及16S rRNA序列分析,對菌株進行鑒定;并初步探討了兩菌株對四種擬除蟲酯類農藥降解能力的差異。研究結果可進一步豐富廣譜性擬除蟲菊酯降解菌資源庫,為受擬除蟲菊酯類農藥污染農作物生長環境的生物修復及進一步保障其食用安全提供菌株資源和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜園耕作層土壤 采自成都郫縣某一長期施用擬除蟲菊酯類農藥的菜園;高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯標準品(質量分數99.5%) 國家標準物質中心;高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯原農藥(質量分數96.0%) 南京榮誠化工公司;乙腈(色譜純) 美國Adamas-beta公司;Bacteria DNA Kit提取試劑盒、多重PCR擴增試劑盒 天根生化科技有限公司;基礎鹽(MM)選擇培養基 (NH4)2SO41.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41.5 g,MgSO40.2 g,NaCl 0.5 g,蒸餾水1000 mL,pH7.5;Luria-Bertani(LB)富集培養基 胰蛋白胨10.0 g,酵母浸出粉5.0 g,NaCl 10.0 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0;121 ℃滅菌20 min[19],滅菌后加入一定體積的各濃度擬除蟲菊酯原藥溶液使其為實驗所需濃度,混勻備用;固體培養基同液體培養基加入2.0%(w/v)的瓊脂制成固體培養基。

e2695型高效液相色譜儀、2998型光電二極管陣列檢測器 美國Waters公司;Biometra PCR儀 德國Analytik Jena AG公司;Powerpac Basic電泳、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司;7200型可見分光光度計 美國UNICO公司;Heraeus Multifuge X1R高速冷凍離心機 美國thermo Scientific公司;HNY-2102C恒溫培養振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 擬除蟲菊酯類農藥的檢測及其標準曲線方程建立 取培養液1.0 mL并加入適量乙腈于10 mL具塞試管中,超聲波(40 kHz,100 W)輔助提取30 min后用乙腈定容,混勻后12000 r/min離心30 min,取上清液用有機相濾膜過濾,收集濾液進行高效液相色譜(HPLC)檢測。HPLC檢測條件:色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),流動相為乙腈/超純水(90∶10,v/v),流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,檢測波長為210 nm,進樣量為10 μL[20]。

分別配制濃度為10 mg/L的高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯標準液,每種標準液依次進樣量分別為1、2、5、10、20、50 μL,即質量分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg。擬合高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯質量-峰面積的標準曲線。

1.2.2 降解菌的富集馴化 取1.0 g土樣加入100 mL含高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯濃度均為20 mg/L的MM培養基于30 ℃振蕩(180 r/min)培養72 h后,取5 mL培養液轉接至四種擬除蟲菊酯類農藥濃度均為40 mg/L的MM培養基中,再按上述培養條件培養72 h;按照上述操作連續轉接3次,并逐次提高培養基中單種擬除蟲菊酯類農藥的濃度至160 mg/L,使最終總濃度達到640 mg/L。

1.2.3 降解菌的篩選和純化 馴化后,將菌懸液(OD600 nm≈1.0)進行梯度稀釋并分別涂布轉接到高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯濃度均為40 mg/L的LB固體培養基于30 ℃培養48 h,挑取單菌落于高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯濃度均為40 mg/L的LB固體培養基連續劃線純化三代,挑選出菌落形態規則、生長速度較快的菌株,進行傳代、涂布,直至LB培養基上的菌落形態完全一致為止。挑取單菌落劃線培養后進行編號,菌株純化后用20%甘油于-70 ℃冷凍保存。

1.2.4 降解菌降解能力測定 將篩選得到的菌株重新挑取轉接到含單一擬除蟲菊酯類農藥(高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯濃度分別為50 mg/L)的LB培養基中,接入同體積無菌水做空白對照,30 ℃振蕩(180 r/min)培養48 h后取樣對各降解體系進行殘留量測定,并按下式計算各降解體系的降解率,篩選降解譜廣、降解效率高的菌株進行后續研究。

式中,C為樣品液中高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯質量;C0為空白對照中高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯質量。

1.2.5 降解菌的鑒定 將篩選得到的降解菌株分別在MM、LB平板上劃線接種,于37 ℃培養箱中倒置培養24 h,觀察菌落形態。生理生化特征實驗參照《伯杰細菌鑒定手冊》第8版[21]進行。細菌總DNA提取參照文獻[22]的SDS-CTAB原位裂解優化方法進行。

16S rRNA擴增、序列測定及系統發育樹的構建:以細菌總DNA為模板,用16S rRNA的一對引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進行PCR擴增反應。PCR反應體系為50 μL,含有模板DNA 1.5 μL,27f primer 1 μL,1492r primer 1 μL,10×PCR Buffer 5 μL,Mixed dNTP 1 μL,Taq DNA聚合酶0.5 μL,ddH2O 40 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性1.5 min,94 ℃變性0.5 min,55 ℃退火1.5 min,72 ℃延伸1.5 min,30個循環,最后于72 ℃保溫擴展10 min[23]。擴增產物經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳后所需要的DNA條帶采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收,回收產物委托擎科生物技術有限公司完成測序,將測序結果在NCBI(美國國立生物信息中心)的Genbank數據庫中進行同源性比較[24],然后利用系統發育分析軟件和Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

表1 四種擬除蟲菊酯類農藥線性方程Table 1 Linear equation of four kinds of pyrethroid pesticides

表2 不同菌株對擬除蟲菊酯類農藥的降解率Table 2 Degredation rate of pyrethroid pesticides by different strains

注:“Q”和“G”代表不同的耕地土壤源。

1.2.6 降解菌株的降解譜分析 將菌株菌懸液(OD600 nm≈1.0)按5.0%(v/v)的接種量分別接種于含高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯各50 mg/L的LB培養基中,接入同體積無菌水作為空白對照,30 ℃振蕩(180 r/min)培養72 h后,測定降解體系中殘留高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯質量,通過降解率的計算,分析降解菌株對四種擬除蟲菊酯類農藥的降解能力差異。

1.2.7 降解菌株對高效氯氰菊酯的降解過程分析 以高效氯氰菊酯作為擬除蟲菊酯類農藥的代表,分析降解菌株對其的降解過程。將菌株菌懸液(OD600 nm≈1.0)按5.0%(v/v)的接種量分別接種到高效氯氰菊酯濃度為50 mg/L的LB培養基中,接入同體積無菌水作為空白對照,30 ℃振蕩(180 r/min)培養72 h,間隔12 h定量取樣,測定培養液中高效氯氰菊酯殘留量。間隔12 h吸取5 mL培養液,以無菌水做空白對照,于600 nm處測定其吸光度值。

1.2.8 數據分析 實驗數據均有3個平行重復,結果用平均值±標準方差表示,數據的常規分析及圖表繪制采用Excel 2013進行。菌株系統發育分析采用MEGA 5.1軟件進行。

2 結果與討論

2.1 擬除蟲菊酯類農藥的標準曲線

四種擬除蟲菊酯類農藥的高效液相色譜圖如圖1所示。因為存在同分異構體,高效氯氰菊酯和氯菊酯均有多個峰[17],各峰之間分離度較好,檢測時間短,且峰型尖銳、對稱性好。

圖1 四種擬除蟲菊酯類農藥色譜圖Fig.1 Chromatogram of four kinds of pyrethriod pesticides

四種擬除蟲菊酯標準曲線線性方程見表1,其相關系數R2均大于0.999,表明線性關系良好,線性范圍為0.01～0.50 μg。

2.2 擬除蟲菊酯類農藥降解菌的分離鑒定

2.2.1 降解菌株的篩選及純化 經富集馴化、分離后獲得23株可同時耐受四種擬除蟲菊酯類農藥的菌株,其中8株具備降解高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯的能力。通過對降解率進行測定,8株降解菌對四種擬除蟲菊酯的降解率見表2。菌株Q-7和菌株G-04對四種擬除蟲菊酯類農藥降解能力最好,菌株Q-7對高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯的降解率分別為40.23%、57.26%、22.32%、25.72%,菌株G-04的相應降解率分別為60.35%、41.43%、25.67%、28.21%。說明這兩株降解菌能有效降解這四種擬除蟲菊酯類農藥,對該類農藥的降解具備廣譜性。

2.2.2 降解菌株的形態及生理生化特征 將純化后的菌株Q-7、菌株G-04分別劃線接種于MM、LB平板培養基中,37 ℃倒置培養24 h后,菌株Q-7在MM培養基上菌落呈圓形或橢圓形,邊緣整齊、質地軟、無色素、稍有光澤的白色菌落(似蠟燭樣顏色),直徑5～7 mm;在LB培養基上菌落為灰白色,不透明,表面較粗糙,似毛玻璃狀或融蠟狀,菌落較大;菌株G-04在MM培養基上菌落呈扁平圓形、白色、邊緣鋸齒狀、表面皺褶,直徑1～3 mm;在LB培養基上菌落為乳白色、邊緣不整、直徑2～6 mm。將純化得到的兩株降解菌株Q-7、G-04分別進行生理生化實驗,結果見表3。

表3 降解菌株生理生化實驗結果Table 3 Physiological and biochemical test results of strains

注:“+”為陽性;“-”為陰性。

2.2.3 降解菌株16S rRNA序列分析 對菌株Q-7和G-04的16S rRNA序列進行PCR擴增,經過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分別獲得大小約1500 bp的產物,如圖2所示;擴增產物回收后測序,得到菌株Q-7和G-04的16S rRNA擴增序列。利用BLAST檢索分析將菌株Q-7和G-04的16S rRNA擴增序列在Genbank數據庫中進行同源性比對。結果發現,菌株Q-7序列與Bacilluscereus種的同源性最高,其中與BacilluscereusJCM 2152的同源性為100%;菌株G-04序列與Bacilluslicheniformis種的同源性最高,其中與BacilluslicheniformisCICC 10037的同源性為99%。對于16S rRNA序列同源性不小于97%,認為屬于同種;同源性小于95%,屬于不同屬[25]。通過上述同源性比對,基本可以確定菌株Q-7為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus),菌株G-04為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。

圖2 16S rRNA 基因片段PCR擴增產物(Marker、Q-7、G-04)Fig.2 PCR products of 16S rRNA gene fragments of Marker,strain Q-7 and G-04

為了進一步確定菌株Q-7和G-04的種屬,參考菌株Q-7和G-04 16S rRNA基因序列在Genbank數據庫中的比較結果,利用MEGA 5.1軟件和Neighbor-Joining法,以菌株Q-7和G-04的16S rRNA基因序列與Genbank數據庫中所找到的蠟樣芽胞桿菌屬(Bacilluscereus)、地衣芽孢桿菌屬(Bacilluslicheniformis)以及其他種的細菌的16S rRNA基因序列構建系統發育樹,如圖3所示。從構建的發育樹看,菌株Q-7與Bacilluscereus、菌株G-04與Bacilluslicheniformis位于同一個分支上,這也證實了菌株Q-7與菌株G-04分別為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。綜合形態學、生理生化特征實驗、16S rRNA基因序列和系統發育樹,可以確定菌株Q-7、菌株G-04分別為蠟樣芽胞桿菌和地衣芽孢桿菌。

地衣芽孢桿菌和蠟樣芽胞桿菌均屬于常見的芽孢桿菌屬,在重金屬吸附、石油降解、植物病害防治、飼料加工、醫藥開發、環境污染治理等領域都有非常突出的應用價值,但有關其降解環境中擬除蟲菊酯類農藥的研究報道還不多見[26-31]。賴文[32]等從茶園土壤中分離得到一株地衣芽孢桿菌B-1,研究了其對氯氰菊酯的降解及其降解酶;曲杰[33]等報道了可降解氯氰菊酯的蠟樣芽胞桿菌L12的降解能力和細胞疏水性;Zhang[34]等報道蠟樣芽胞桿菌Y-1可促進培養基、污染土壤的溴氰菊酯的降解,并確定了最佳培養條件。但均未涉及對多種擬除蟲菊酯類農藥的降解能力分析。此次分離得到的地衣芽孢桿菌G-04和蠟樣芽胞桿菌Q-7可有效降解多種擬除蟲菊酯類農藥,且耐藥能力強,具有很好的開發應用潛能,是可應用于環境生物修復的降解菌資源。

圖3 菌株Q-7和G-04基于16S rRNA的菌株系統發育分析Fig.3 Phylogenetic tree of strain Q-7 and G-04 based on 16S rRNA sequence

2.3 菌株對擬除蟲菊酯類農藥的降解譜分析

以同時含高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯及聯苯菊酯且四種農藥濃度均為50 mg/L的LB培養基(農藥總濃度200 mg/L)作為降解體系,接種量5%(v/v)、pH7.0、溫度30 ℃條件下培養72 h后,蠟樣芽胞桿菌Q-7對高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯的降解率分別為48.31%、64.31%、33.46%、26.52%,地衣芽孢桿菌G-04對四種農藥的相應降解率為66.94%、45.04%、29.40%、26.40%,如圖4所示。可見,蠟樣芽胞桿菌Q-7和地衣芽孢桿菌G-04均可同時有效降解高效氯氫菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯。其中,蠟樣芽胞桿菌Q-7是氰戊菊酯優勢降解菌,能高效降解氰戊菊酯和高效氯氰菊酯。地衣芽孢桿菌G-04是高效氯氰菊酯優勢降解菌,可高效降解高效氯氰菊酯降解和氰戊菊酯。

圖4 菌株Q-7和菌株G-04對四種擬除蟲菊酯類農藥的降解率Fig.4 Degredation rate of four kinds of pyrethroid pesticides by Q-7 and G-04

同一降解菌株對四種擬除蟲菊酯類農藥之間的降解能力存在明顯差異,原因在于:蠟樣芽胞桿菌Q-7和地衣芽孢桿菌G-04的原始菌株所處土壤環境中農藥種類雜多,殘留量、分布不均,造成土壤微生物對不同農藥耐受、降解能力的差異,且耕地農作物使用擬除蟲菊酯類農藥中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯占比較大;其次不同農藥本身結構差異性大,對環境理化條件、微生物等因素耐受能力差異明顯,如高效氯氰菊酯醇部分的α位為氰基(-CN),而α位的氰基可減少底物和酶結合的空間位阻,降低酯鍵的穩定性,使其更易降解[35];菌株產擬除蟲菊酯類農藥降解酶對不同擬除蟲菊酯類農藥的降解性能差異大,即通過水解、氧化、還原等反應對不同農藥有不同的降解作用。

2.4 菌株降解高效氯氰菊酯的降解過程分析

蠟樣芽胞桿菌Q-7和地衣芽孢桿菌G-04在培養過程中,LB培養基由無色透明逐漸變渾濁,并出現大量的微生物絮狀體。菌株Q-7、菌株G-04在此降解體系中的生長曲線及其對高效氯氰菊酯的降解曲線如圖5、圖6所示。

圖5 菌株Q-7的生長曲線及其對高效氯氰菊酯的降解曲線Fig.5 Growth curve of strain Q-7 and biodegradation of beta-cypermethrin by the strain

圖6 菌株G-04的生長曲線及其對高效氯氰菊酯的降解曲線Fig.6 Growth curve of strain G-04 and biodegradation of beta-cypermethrin by the strain

由圖5和圖6可知,高效氯氰菊酯的降解與兩菌株的生長基本同步,當菌株處于對數生長期(12～48 h)時,高效氯氰菊酯的降解速率較大。培養48 h后,菌株生長逐漸處于平穩期,高效氯氰菊酯的降解速率逐漸變小;經過72 h培養后,空白組高效氯氰菊酯濃度由最初的50 mg/L降至42.20 mg/L,地衣芽孢桿菌G-04將高效氯氰菊酯濃度降至6.81 mg/L,降解率達83.86%;蠟樣芽胞桿菌Q-7將高效氯氰菊酯濃度降至12.32 mg/L,降解率達70.81%。說明兩株菌均能高效降解高效氯氰菊酯,且兩菌株生長量與其降解性能呈正相關。相對于四種擬除蟲菊酯類農藥混合體系,菌株Q-7和G-04對以高效氯氰菊酯為底物的單農藥體系降解率分別提高了22.50%和16.92%,說明蠟樣芽胞桿菌Q-7和地衣芽孢桿菌G-04在單農藥、低濃度的降解體系中表現出更強的降解能力。

3 結論

從菜園耕作層土壤中分離純化出可同時有效降解高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯、聯苯菊酯的菌株Q-7和菌株G-04,通過形態學觀察、生理生化實驗及16S rRNA序列分析,菌株Q-7鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus),菌株G-04鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。兩菌株均具有擬除蟲菊酯類農藥降解的廣譜性,其中蠟樣芽胞桿菌Q-7和地衣芽孢桿菌G-04分別對氰戊菊酯、高效氯氰菊酯有較好的降解效果,兩菌株均具備同時有效降解高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯及聯苯菊酯的能力。在只含高效氯氰菊酯的降解體系中,蠟樣芽胞桿菌Q-7和地衣芽孢桿菌G-04的菌體生長量與降解作用呈正相關,對高效氯氰菊酯的降解能力優于混合擬除蟲菊酯類農藥降解體系。綜上,分離得到的蠟樣芽胞桿菌Q-7和地衣芽孢桿菌G-04具有較好的擬除蟲菊酯類農藥降解性能及應用潛能,為受該類農藥污染的農耕地、水體等區域的生物修復提供了菌株資源。

[1]Tripathi G,Verma P.Fenvalerate-induced changes in a catfish,clarias batrachus:Metabolic enzymes,RNA and protein[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology & Pharmacology,2004,138(1):75-79.

[2]王兆守,李順鵬.擬除蟲菊酯類農藥微生物降解研究進展[J].土壤,2005,37(6):577-580.

[3]González-Rodríguez R M,Rial-otero R,Cancho-grande B,et al.Occurrence offungicide and insecticide residues in trade samples of leafy vegetables[J].Food Chemistry,2008,107(3):1342-1347.

[4]Wolansky M J,Harrill J A.Neurobehavioral toxicology of pyrethroid insecticides in adult animals:A critical review[J]. Neurotoxicology and Teratology,2008,30(2):55-78.

[5]喬潤香,彭星星,鐘國華,等.擬除蟲菊酯類農藥微生物降解研究現狀與方向[C]//成卓敏主編.植物保護與現代農業-中國植物保護學會2007年學術年會論文集.北京:中國農業科學技術出版社,2007:721-724.

[6]Singh B K,Walker A.Microbial degradation of organophosphorus compounds[J].FEMS Microbiology Reviews,2006,30(3):428-471.

[7]張琛,王圣惠,閆艷.高效氯氰菊酯降解菌CH7的分離鑒定及降解條件的優化[J].生物技術通報,2010(1):99-102.

[8]Zhang C,Jia L,Wang S H,et al.Biodegradation of beta-cypermethrin by twoSerratiaspp. with different cell surface hydrophobicity[J].Bioresource Technology,2010,101(10):3423-3429.

[9]Tallur P N,Megadi V B,Ninnekar H Z.Biodegradation of Cypermethrin byMicrococcussp. Strain CPN 1[J].Biodegradation,2008,19(1):77-82.

[10]Zhang W J,Rui W Y,Tu C,et al.Responses of soil microbial community structure and diversity to agricultural deintensification[J].Pedosphere,2005,15(4):440-447.

[11]Malony S E,Maule A,Smith A R W.Transformation of synthetic pyrethroid insecticides by a thermophilicBacillussp[J]. Arch Microbiol,1992,158:282-286.

[12]林淦.陰溝腸桿菌w10j15中擬除蟲菊醋類殺蟲劑降解酶的酶學性質研究[D].福州:福建農林大學,2004.

[13]虞云龍,宋鳳鳴,鄭重,等.一株廣譜性農藥降解菌的分離與鑒定[J].浙江大學學報:農業與生命科學版,1997,23(2):111-115.

[14]Tang J,Yao K,Liu S L,et al.Biodegradation of 3-phenoxybenzoic acid by a novelSphingomonassp. SC-1[J]. Fresenius Environmental Bulletin,2013,22(5a):1564-1572.

[15]唐潔,曾朝懿,張慶,等.氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及其降解底物譜研究[J].食品科學,2014,35(11):160-163.

[16]Hashem F H,Mao E M.Isolation and identification of pyethroid insecticides-degrading bacteria from soil[J].Annals of Agricultural Science,1999,44(1):123-137.

[17]Chen S H,Hu Q B,Hu M Y,et al.Isolation and characterization of a fungus able to degrade pyrethroids and 3-phenoxybenzaldehyde[J].Bioresource Technology,2011,102(17):8110-8116.

[18]Grant R J,Daniell T J,Betts W B.Isolation and identification of synthetic pyrethroid-degrading bacteria[J].Journal of Applied Microbiology,2002,92(3):534-540.

[19]Guo P,Wang B Z,Hang B J,et al.Pyrethroid-degradingSphingobiumsp. JZ-2 and the purification and characterization of a novel pyrethroid hydrolase[J].International Biodeterioration & Biodegradation,2009,63:1107-1112.

[20]史穎,唐潔,姚開,等.氰戊菊酯降解菌的篩選與鑒定及其降解條件優化[J].食品工業科技,2016,37(2):217-222.

[21]布坎南R E,吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].第8版.中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組,譯.北京:科學出版社,1984:729-732.

[22]趙裕棟,周俊,何璟.土壤微生物總DNA提取方法的優化[J].微生物學報,2012,52(9):1143-1150.

[23]倪桂萍,王延平,王華田,等.楊樹人工林土壤細菌DNA的提取與擴增[J].山東大學學報,2013,48(5):23-28.

[24]葉光斌,羅慧波,楊曉東,等.基于免培養法研究瀘州地區濃香型白酒窖泥原核微生物群落結構[J].食品科學,2013,34(17):176-181.

[25]王振雄,徐毅,周培瑾.嗜鹽堿古生菌新種的系統分類學研究[J].微生物學報,2000,40(2):115-120.

[26]Banerjee A,Ghoshal A K.Biodegradation of phenol by calcium-alginate immobilized @@Bacilluscereusin a packed bed reactor and determination of the mass transfer correlation[J]. Journal of Environmental Chemical Engineering,2016,4(2):1523-1529.

[27]Cui H Y,Li W,Li C Z,et al.Intelligent release of cinnamon oil from engineered proteoliposome via stimulation ofBacilluscereusprotease[J].Food Control,2016,67:68-74.

[28]Chen Z,Pan X H,Chen H,et al.Biomineralization of Pb(II)into Pb-hydroxyapatite induced byBacillucereus12-2 isolated from Lead-Zinc mine tailings[J].Journal of Hazardous Materials,2016,301:531-537.

[29]Gobi N,Malaikozhundan B,Sekar V,et al.GFP taggedVibrioparahaemolyticusDahv2 infection and the protective effects of the probioticBacilluslicheniformisDahb1 on the growth,immune and antioxidant responses in Pangasius hypophthalmus[J].Fish & Shellfish Immunology,2016,52:230-238.

[30]Shanthi S,Jayaseelan B D,Velusamy P,et al.Biosynthesis of silver nanoparticles using a probioticBacilluslicheniformisDahb1 and their antibiofilm activity and toxicity effects in Ceriodaphnia cornuta[J].Microbial Pathogenesis,2016,93:70-77.

[31]EL-Sheshtawy H S,Aiad I,Osman M E,et al.Production of biosurfactant fromBacilluslicheniformisfor microbial enhanced oil recovery and inhibition the growth of sulfate reducing bacteria[J]. Egyptian Journal of Petroleum,2015,24(2):155-162.

[32]賴文,劉書亮,趙楠,等.氯氰菊酯高效降解菌的篩選鑒定及其降解特性[J].食品科學,2012,33(21):157-163.

[33]曲杰,王海勝,史延華,等.氯氰菊酯降解菌株L12的分離鑒定及降解特性[J].微生物學報,2011,51(4):510-517.

[34]Zhang H,Zhang Y M,Hou Z G,et al.Biodegradation potential of deltamethrin by theBacilluscereusstrain Y1 in both culture and contaminated soil[J].International Biodeterioration & Biodegradation,2016,106:53-59.

[35]周亞紅.聚α-氰基丙烯酸乙酯和聚甲基丙烯酸乙酯的制備、表征及其密度泛函理論研究[D].南京:南京理工大學,2004.

Isolation and identification of two pyrethroid pesticides degradation strains and research of degradative capabilities

LIU Bo,TANG Jie*,CHEN Ting-ting,SHI Ying,ZENG Lin,ZENG Chao-yi

(College of Food and Biotechnology,Xihua University,Chengdu 610039,China)

Two strains named Q-7 and G-04 capable of a broad spectrum degrading of pyrethroid pesticides were isolated from the plowlandsoil by using enrichment culture,gradient method and the determination of pyrethroid pesticides degradation rate. Based on the morphology,physio-biochemical characteristics,and 16S rRNA sequence analysis,strain Q-7 was identified asBacilluscereus,strain G-04 was identified asBacilluslicheniformis.Two strains showed a strong ability of resistance to the pesticides for growing in liquid medium which containsβ-cypermethrin,fenvalerate,permethrin and bifenthrin with a total concentration of 640 mg/L.Two strains could degradeβ-cypermethrin,fenvalerate,permethrin and bifenthrin with the initial concentration of 50 mg/L simultaneously,the degradation efficiency ofβ-cypermethrin,fenvalerate,permethrin,bifenthrin by stain Q-7 and stain G-04 respectively reached 48.31%,64.31%,33.46%,26.52% and 66.94%,45.04%,29.40%,26.40% within 72 hours. The results showed that the strain Q-7 and strain G-04 possessed capability of broad spectrum degradation of pyrethroid pesticides,could be used as good repair of pyrethroid pesticide environmental pollution microorganism resources.

pyrethroid pesticide;Bacilluscereus;Bacilluslicheniformis;biodegradation

2016-07-20

劉波(1994-)，男，碩士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：lb2tt77@163.com。

*通訊作者:唐潔(1982-)，女，博士，副教授，研究方向：食品安全，E-mail：tangjie1225@mail.xhu.edu.cn。

教育部春暉計劃項目(Z2015122)；四川省教育廳自然科學項目(114ZB0122)；西華大學人才培養重點項目(z1310525)；四川省食品生物技術重點實驗室開放基金(szjj2014-011)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)04-0214-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.032