萌發預處理輔助水酶法提取大豆蛋白及油脂

馬 楠,鹿保鑫,*,王 霞,陸慶明,李超楠,劉雪嬌,付 磊

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319;2.九三集團天津大豆科技有限公司,天津 300461)

萌發預處理輔助水酶法提取大豆蛋白及油脂

馬 楠1,鹿保鑫1,*,王 霞1,陸慶明2,李超楠1,劉雪嬌1,付 磊1

(1.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江大慶 163319;2.九三集團天津大豆科技有限公司,天津 300461)

本研究采用萌發預處理方法輔助水酶法提取大豆蛋白及油脂,通過響應面優化實驗確定了大豆油脂水酶法提取的最優萌發處理工藝為:萌發溫度26 ℃、萌發濕度71%、萌發時間43 h,在此條件下油脂及蛋白提取率分別高達92.42%、91.91%。萌發預處理技術可大幅提高水酶法大豆蛋白及油脂提取率,萌發預處理技術作用效果強于粉碎、超聲等預處理技術。

響應面,水酶法,大豆,油脂,蛋白,萌發預處理

植物細胞壁的主要組成成分為果膠、纖維素、半纖維素以及木質素,油脂通常以與蛋白質和碳水化合物等大分子結合的形態廣泛存在于植物籽粒細胞中,因此必須先破壞油料作物的細胞結構以及脂多糖和脂蛋白等復合體[1],才能使油脂有效釋放出來。利用水酶法進行提油主要原理是將油料作物在纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶以及葡聚糖酶等多種酶酶解的條件下,破壞其細胞結構,并且分解復合體提高油脂在細胞中流動性,進而充分釋放出來,同時還可以將水解液以及乳化液中的蛋白質一起提取出來[2]。

為獲取更高提取率,多種預處理方法已被應用于輔助水酶法提取植物油脂及蛋白,其中物理預處理因其簡便、快捷、作用效果顯著被廣泛應用。物理粉碎預處理技術可有效降低油料粒度,粉碎破壞油料細胞壁,使細胞內油脂及蛋白得以釋放,讓酶與油料作物充分接觸,使酶解作用大幅提升[3]。利用超聲進行預處理可以提高分離效果,并可利用空穴效應加速傳熱傳質對油料作物進行輔助提取,研究顯示通過超聲輔助水酶法提油可有效縮短提取時間,提高油脂提取率,降低浸提的溫度,并且具備操作容易等特點[4]。擠壓膨化技術是現在普遍應用的一種預處理技術,其原理是利用高溫、高壓、高剪切的作用將油料作物細胞壁破壞,油料蛋白質變性,蛋白質結構解折疊重組、表面電荷重排,并破壞弱化分子內/間作用力,暴露的蛋白質結構為蛋白酶提供了更多的作用位點,從而有效提高水酶法提油率[5-6]。但物理預處理作用存在能耗需求高、處理均一性差、調控操作有待優化等問題,為了避免以上問題,本文將利用更加溫和的預處理方法增加提油率,即萌發水酶法提油工藝。研究顯示種子發芽時其酶最為活躍,淀粉和蛋白質很容易被高活性的淀粉酶以及蛋白酶酶解,分別生成還原糖及多肽、氨基酸等,而異黃酮和皂甙含量隨貯存物質的降解而增加[7]。淀粉、蛋白酶解及功效組分的增加對于提高水酶法油脂及蛋白提取率有促進作用,更可提高制備產品的功能性。但現今并未有針對性的研究對萌發預處理工藝加以探索,故本研究擬通過響應面法確定水酶法提取大豆油及蛋白的萌發預處理工藝,為創建高效、柔和、綠色的水酶法預處理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆(蛋白質含量39.8%,油脂含量18.5%,水分含量7.5%) 市售;Protex 6L堿性蛋白酶(酶活3.85×105U,最適溫度60 ℃,最適pH9.0) 購自諾維信公司;實驗所用試劑 均為分析純,購自天津迪博化工股份有限公司。

PHSJ-4A型實驗室pH計 中國上海雷磁公司;THZ-80水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇億通電子有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Allegra64R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼公司;JJ-1增力電動攪拌器 江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;LNK-871型凱氏定氮儀 江蘇省宜興市科教儀器研究所;LHS-80HC-I恒溫恒濕培養箱 江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠。

1.2 大豆萌發工藝流程

大豆→篩選→清洗→浸泡24 h→瀝水→在不同條件下進行萌發→每1 d以蒸餾水淋洗兩次→發芽大豆[8]。

選取干燥度一致、飽滿、種皮色澤正常的大豆,將所有大豆種子經0.1% HgCl2溶液浸泡消毒2 min后用純水漂洗5～6次,在蒸餾水中浸泡處理24 h后瀝去水分。然后將種子置于含18 mL去離子水、墊有雙層9 cm定性濾紙的玻璃培養皿中，每皿30粒,置于預設溫度及濕度條件的恒溫光照培養箱中避光萌發[9]。萌發過程中每隔24 h淋洗兩次,瀝去水分、烘干即得發芽大豆。

1.3 萌發預處理輔助水酶法提取大豆油

水酶法基礎工藝參考韓宗元等[10]的實驗方法,將上述萌發處理的大豆經粉碎后過篩60目。取過篩后大豆物料200 g,轉移至燒杯中,以蒸餾水調節料液比至1∶5,pH調整至9.0,然后加入質量分數2.00%的Protex 6L蛋白酶進行酶解操作,控制酶解溫度為55 ℃,在轉速80 r/min下攪拌酶解1.5 h。酶解結束后,懸濁液在4500 r/min下進行離心分離,收集得到游離油及殘渣,并在4 ℃下保存[11-13]。

1.4 單因素實驗設計

1.4.1 萌發溫度對水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影響研究 控制萌發相對濕度為80%,萌發時間48 h,調節萌發溫度為20、24、28、32、36 ℃,考察萌發溫度對水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影響規律。

1.4.2 萌發濕度對水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影響 控制萌發溫度為28 ℃,萌發時間48 h,調節萌發相對濕度為70%、75%、80%、85%、90%,考察萌發濕度對水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影響規律。

1.4.3 萌發時間對水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影響 通過控制萌發溫度為28 ℃,萌發濕度80%,調節萌發時間為24、36、48、60、72 h,考察萌發時間對水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影響規律。

1.5 響應面優化實驗

在單因素實驗基礎上,進一步對實驗進行響應面分析設計,利用Design-Expert軟件優化實驗結果,選取A萌發溫度(℃)、B萌發濕度(%)、C萌發時間(h)3個因素為自變量,以大豆油提取率R1(%)和大豆蛋白提取率R2(%)為響應值,設置3因素5水平進行實驗,如表1所示。

表1 因素編碼表Table 1 Factor code table

1.6 油脂及蛋白提取率計算

蛋白提取率(%)=(大豆含總蛋白質量-酶解提取后殘渣含蛋白質量)/大豆含總蛋白質量×100[14]

油脂提取率(%)=(大豆總含油質量-酶解提取后殘渣含油質量)/大豆總含油質量×100[15]

1.7 不同預處理水酶法的比較

分別參考李楊等[5]、楊柳等[16]調控工藝進行擠壓膨化預處理及超聲預處理操作,另通過多次研磨及100目篩篩分大豆物料實現粉碎預處理操作。以大豆油脂及蛋白提取率為指標考察不同預處理工藝的作用效果。

1.8 數據處理

每組實驗都進行三次平行實驗,并將實驗數據進行誤差分析。采用統計學軟件SPSS 18對實驗數據進行方差分析、相關性和差異顯著性分析;采用Origin 8.5軟件進行作圖;采用Design-Expert軟件進行響應面數據分析及方差分析。

2 結果與分析

2.1 萌發溫度對大豆油脂及蛋白提取率的影響

由圖1可知,隨著萌發溫度的增大,水酶法大豆油脂及蛋白的提取率均呈現先增加后減小的變化趨勢,這種現象可能是由于在較低萌發溫度下大豆萌發不完全,內源蛋白酶對大豆蛋白的水解作用較弱、大豆油脂水解釋放程度低;隨著萌發溫度的增加,大豆萌發程度提高,內源蛋白酶酶解作用更加活躍,蛋白更多地被水解、油脂隨之游離出來,故而表現出更高的提取率;但過高的萌發溫度會部分抑制大豆萌發作用,降低萌發過程中蛋白酶、淀粉等的酶解作用活性,大豆油脂、蛋白提取率隨之降低。在萌發溫度為24 ℃和28 ℃下,水酶法大豆油脂及蛋白提取率分別有較大值。盡管在萌發溫度為24 ℃大豆油脂水酶法提取率較高,但此條件下大豆蛋白提取率較不理想,故選擇萌發溫度為28 ℃作為后續研究的最佳溫度。另外,過高萌發溫度導致油脂及蛋白提取率的降低可能與萌發過程中的呼吸作用增強造成兩組分的降解有關。

圖1 萌發溫度對大豆油脂及蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of germination temperature on extraction rate of soybean oil and protein

2.2 萌發濕度對大豆油脂及蛋白提取率的影響

由圖2萌發濕度對水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影響可知,隨著萌發濕度的增加,水酶法大豆油脂及蛋白提取率呈現先增加后降低的變化趨勢,適度的萌發濕度可增強萌發作用,活化蛋白酶及淀粉酶,使大豆細胞內的油脂體、蛋白體等得以解離,釋放油脂、獲取蛋白。而更高的萌發濕度會抑制大豆種子的呼吸作用,減弱萌發作用、內源酶活性降低,包被在油脂表面的蛋白難以被充分酶解,進而抑制了水酶法提取大豆油脂及蛋白。由圖2可知,萌發濕度為75%時,大豆油脂及蛋白提取率均有較大值,故選擇萌發濕度為75%進行后續研究。

圖2 萌發濕度對水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of germination humidity on extraction rate of soybean oil and protein

2.3 萌發時間對大豆油脂及蛋白提取率的影響

由圖3可知,水酶法大豆油脂及蛋白的提取率隨著萌發時間的延長呈現先增加后降低的變化趨勢,在萌發時間為36 h時大豆油脂提取率有較大值,但此條件下大豆蛋白提取率較低,而在萌發時間為48 h時大豆蛋白提取率有較大值,且此條件下大豆油脂提取率相對較高,故選擇萌發時間為48 h進行后續研究。

圖3 萌發時間對水酶法大豆油脂及蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of germination time on extraction rate of soybean oil and protein

水酶法大豆油及蛋白提取率的變化可能與萌發過程中蛋白質含量的變化有關,李淑艷[17]研究發現大豆的萌發過程經歷了急劇吸水階段和滯緩吸水階段。蛋白質只有溶解在水中才可以被利用,急劇吸水階段為種子萌發準備所需的可溶性蛋白質,此階段為萌發初期,在此階段蛋白含量呈上升趨勢。胡友紀等[18]研究顯示在大豆萌發的初期階段沒有蛋白質形成,并且蛋白酶會把蛋白質分解成氨基酸,并伴有含氮化合物損失。李清芳等[19]證實了大豆種子萌發的前期淀粉酶和蛋白酶具有較高活性,但脂肪酶活性較差。在本研究中過長時間的萌發處理下水酶法油脂提取率的降低可能與脂肪酶活化部分水解油脂有關,而在萌發末期線粒體重新合成蛋白質可能會阻礙了水酶法工藝中的酶解作用。

2.4 響應面優化實驗結果與分析

在單因素實驗基礎上,本實驗利用Design-Expert軟件進一步對實驗進行響應面分析設計,選取A萌發溫度(℃)、B萌發濕度(%)、C萌發時間(h)3個因素為自變量,以水酶法大豆油提取率R1(%)和水酶法大豆蛋白提取率R2(%)為響應值,設置3因素5水平進行實驗,結果如表2所示。

表2 實驗安排及結果Table 2 Experimental arrangement and results

表3 回歸與方差分析結果Table 3 The output of CLA regression and variance analysis results

通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析,建立回歸模型如下:

R1=89.99-2.15A-1.66B-1.30C+0.28AB+0.16AC+0.13BC-1.20A2-0.94B2-0.68C2

采用Design-Expert軟件對模型方程進行方差分析,結果見表3。

兩兩因子的相互作用的響應面分析見圖4。

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析,確定最優工藝下A萌發溫度(℃),B萌發濕度(%)和C萌發時間(h)對應的編碼值分別為-1.64,-1.45,-1.47,即萌發溫度23.08 ℃、萌發濕度70.65%、萌發時間43.59 h,油脂提取率可達92.77%。

蛋白提取率R2通過統計分析軟件Design-Expert進行數據分析,建立二次響應面回歸模型如下:R2=89.14-2.03A-1.18B-1.22C+0.31AB-0.08AC+0.24BC-1.59A2-0.4B2-0.48C2

表4 回歸與方差分析結果Table 4 Results of regression and variance analysis

兩兩因子的相互作用的響應面分析見圖5。

圖5 兩因素交互作用(顯著項)對蛋白提取率影響的響應面圖Fig.5 Response surface analysis of significant effective interaction items of different parameters on protein extraction rate

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行分析,確定最優工藝A萌發溫度(℃),B萌發濕度(%)和C萌發時間(h)對應的編碼值分別為-0.77,-1.34和-1.65,即萌發溫度25.69 ℃、萌發濕度70.98%、萌發時間43.05 h,蛋白提取率為92.21%。

為同時獲取最大大豆油脂及蛋白提取率,采用聯合求解法確定蛋白提取率及油脂均優的工藝條件下A萌發溫度(℃),B萌發濕度(%)和C萌發時間(h)對應的編碼值分別為-0.78、-1.23、-1.60,即萌發溫度25.69 ℃、萌發濕度70.98%、萌發時間43.05 h,模擬預計在此處理條件下,油脂提取率可達92.61%,蛋白提取率可達91.72%。為適應生產需求將上述處理工藝參數優化為萌發溫度26 ℃、萌發濕度71%、萌發時間43 h,經實驗驗證此處理條件下,油脂提取率達92.42%,蛋白提取率可達91.91%。

2.5 不同預處理技術對大豆蛋白及油脂水酶法提取率的比較

研究比較不同預處理技術對大豆蛋白及油脂水酶法提取率,結果如圖6所示。相比于未預處理樣品,萌發預處理可有效地提高水酶法大豆蛋白及油脂提取率。同比于粉碎預處理及超聲預處理,萌發預處理具有更高的蛋白及油脂提取率,但萌發預處理的作用效果略低于擠壓膨化預處理,尤其體現于蛋白質提取率上,這可能與擠壓膨化可更大程度地使大豆蛋白結構變性疏松、暴露出更多酶解位點有關。但從能耗角度上,萌發預處理技術具有更多的優勢。

圖6 不同預處理方法蛋白及油脂提取率的比較Fig.6 Comparison on extraction rate of soy protein and oil by different pretreatment

3 結論

采用萌發預處理方法輔助水酶法提取大豆蛋白及油脂,通過單因素確定實驗及響應面優化實驗確定了適應生產需求的萌發預處理工藝參數:萌發溫度26 ℃、萌發濕度71%、萌發時間43 h,經實驗驗證此處理條件下,油脂提取率達92.42%,蛋白提取率可達91.91%。本研究確定的預處理技術可大幅提高水酶法大豆蛋白及油脂提取率,預處理技術達到的作用效果高于粉碎、超聲等預處理技術。

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Optimizing germination pretreatment conditions for extraction of soy oil and protein by aqueous enzymatic method

MA Nan1,LU Bao-xin1,*,WANG Xia1,LU Qing-ming2,LI Chao-nan1,LIU Xue-jiao1,FU Lei1

(1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural Universitiy,Daqing 163319,China;2.Jiusan Group Tianjin Soya Science and Technology Co.,Ltd.,Tianjin 300461,China)

Germination pretreatment was used to assist extraction of soy oil and protein by aqueous enzymatic method. The optimal condition of germination pretreatment condition was determined as follows:germination temperature 26 ℃,71% humidity,43 h pretreatment time. The oil and protein extraction rate were 92.42% and 91.91% under the optimal condition. Germination pretreatment could significantly increase the oil and protein extraction rate by aqueous enzymatic method,this pretreatment had a better treatment effect than grinding and ultrasonic treatement.

response surface methodology;aqueous enzymatic extraction method;soy;oil;protein;germination pretreatment

2016-09-01

馬楠(1992-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：manan1011@163.com。

*通訊作者:鹿保鑫(1972-)，男，博士，教授，研究方向：農產品加工，E-mail：lubaoxin72@126.com。

大慶市創新能力建設項目(scx2010-06-08)。

TS224.2

A

:1002-0306(2017)04-0202-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.030