超聲耦合木聚糖酶水解棉籽殼木聚糖高效制備低聚木糖

李良軍,滕 超,2,*,李秀婷,2,王中月,朱運平

(1.食品質量與安全北京實驗室，北京工商大學,北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學,北京 100048)

超聲耦合木聚糖酶水解棉籽殼木聚糖高效制備低聚木糖

李良軍1,滕 超1,2,*,李秀婷1,2,王中月1,朱運平1

(1.食品質量與安全北京實驗室，北京工商大學,北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學,北京 100048)

本研究以棉籽殼水不溶性粗木聚糖為底物,考察超聲耦合酶解棉籽殼木聚糖制備低聚木糖的工藝條件。通過單因素實驗以及Box-Behnken 響應面實驗對低聚木糖的制備工藝進行了優化。實驗結果顯示,最佳超聲耦合酶解條件為時間42 min,溫度45 ℃,反應體系pH=5.1,超聲頻率40 kHz,超聲強度0.22 W/cm2,還原糖總量達到最高50.46%。經HPLC分析,木二糖的含量占粗棉籽殼木聚糖的29.38%,占還原糖總量58.22%。

棉籽殼,木聚糖,低聚木糖,響應面優化

棉籽殼是我國農作物主要廢棄物,存儲量世界第一,但是僅有少量被有效利用[1]。據統計,2015年全國棉花總產量為560.5萬噸,且有繼續上升的趨勢。棉籽殼作為天然纖維質材料密度小,不易運輸,而且外殼堅硬,不適合作造紙原料和動物飼料,被視為廢棄物,造成資源和經濟的巨大損失,同時對環境造成污染[2]。因此尋求棉籽殼合理有效的利用方式成為當前迫切需要解決的問題。

低聚木糖近些年已經作為重要的功能性添加劑被廣泛用于多種食品中,它可直接進入腸道優先被雙歧桿菌等益生菌利用而快速增殖,進而抑制有害菌生長,而且其功效性是其他聚合糖類的近20倍,并對防治高血壓和動脈硬化以及抗衰老、預防癌癥和抑制腫瘤具有很好的效果[3-5]。超聲波技術作為一種高效且對環境友好的制備手段,在食品加工、化工、醫療、生物工程等領域應用廣泛[6-7],尤其通過與酶解反應的技術耦合在生物催化領域得到了快速發展,并日益受到人們的重視[8]。當前研究已經初步證實,超聲波可以促進底物分子之間的相互作用,強化反應物進入及生成物離開酶活性中心的過程,從而提高酶的催化活性[9]。國內外主要集中在超聲耦合從原料中提取木聚糖的研究,提高木聚糖的提取率,而本研究是考察超聲耦合酶解過程來提高低聚木糖的得率,優化了棉籽殼中低聚木糖的制備條件,提升棉籽殼的利用價值,為提高低聚木糖的轉化效率提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棉籽殼 市售,產地新疆,粉碎粒度70～130目;木聚糖酶F1208 為本實驗室保藏菌株嗜熱踝節菌F1208發酵純化獲得,酶活為100 U/mL;D-木糖、對硝基苯酚等試劑 均為國產分析純。

DTD5200S超聲波清洗機 北京弘祥隆生物技術有限公司;Agilent 1200型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;Sugar-D分析柱 日本Shodex公司;WFJ2000型可見分光光度計 龍尼柯(上海)儀器有限公司;HH-4恒溫水浴鍋 江蘇金壇宏華儀器廠;GL-20G-H型離心機 上海安亭科學儀器廠;XMTD-8222型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博訊實業機械有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 木聚糖的提取 本實驗以棉籽殼為原料提取木聚糖,具體方法參照李秀婷[10]等。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 反應體系pH對還原糖轉化率的影響 設定超聲時間為30 min,超聲溫度為40 ℃,超聲頻率為40 kHz,超聲強度為0.13 W/cm2,考察反應體系pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時超聲耦合酶解棉籽殼木聚糖時還原糖轉化率的變化。加酶量為15 U/mL,底物為0.1 g棉籽殼水不溶性木聚糖。超聲結束后沸水浴5 min,冷卻后離心,DNS比色法測定其還原糖總量。

1.2.2.2 超聲時間對還原糖轉化率的影響 設定反應體系pH為5.0,超聲溫度為40 ℃,超聲頻率為40 kHz,超聲強度為0.13 W/cm2,考察超聲時間分別為10、20、30、40、50、60 min時超聲耦合酶解棉籽殼木聚糖時還原糖轉化率的變化,其他操作同1.2.2.1。

1.2.2.3 超聲溫度對還原糖轉化率的影響 設定反應體系pH為5.0,超聲時間為40 min,超聲頻率為40 kHz,超聲強度為0.13 W/cm2,考察超聲溫度分別為35、40、45、50、55 ℃時超聲耦合酶解棉籽殼木聚糖時還原糖轉化率的變化,其他操作同1.2.2.1。

1.2.2.4 超聲頻率對還原糖轉化率的影響 設定反應體系pH為5.0,超聲時間為40 min,超聲溫度為45 ℃,超聲強度為0.13 W/cm2,考察超聲頻率分別為28、40、50、135 kHz時超聲耦合酶解棉籽殼木聚糖時還原糖轉化率的變化,其他操作同1.2.2.1。

1.2.2.5 超聲強度對還原糖轉化率的影響 設定反應體系pH為5.0,超聲時間為40 min,超聲溫度為45 ℃,超聲頻率為50 kHz,考察超聲強度分別為0.04、0.13、0.22、0.31、0.40 W/cm2時超聲耦合酶解棉籽殼木聚糖時還原糖轉化率的變化,其他操作同1.2.2.1。

1.2.3 響應面分析 根據單因素優化實驗結果,選擇超聲時間、超聲頻率、反應體系pH(如表1所示)三因素為自變量,還原糖的轉化率為響應值,對超聲耦合酶解條件做進一步優化。利用Design-Expert軟件設計組合實驗,采用Box-Benhnken中心組合設計原理設計三因素三水平共17個實驗點的響應面分析實驗。

表1 中心組合(Box-Behnken)設計因素編碼、水平Table 1 Experimental range,level and code of independent variables table for the optimization of xylanase production

1.2.4 酶解產物還原糖含量的測定 還原糖含量的測定采用DNS比色法[11]。取0.1 mL木聚糖酶水解液加入450 μL緩沖液、450 μL背景溶液和1 mL DNS試劑,沸水浴中煮沸5 min后顯色,然后迅速用流水冷卻,加入1 mL酒石酸鉀鈉溶液護色,540 nm波長處測定吸光度,以木糖濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制木糖標準曲線,并得出標準方程Y=0.07505X+0.00424(R2=0.998)。

還原糖轉化率(%)=酶解液中還原糖含量(g)/棉籽殼木聚糖底物(g)×100

1.2.5 酶解產物HPLC分析 水解液中木寡糖采用HPLC法定量[12]。實驗條件:流動相為高純水,流速為1.0 mL/min,柱溫箱溫度30 ℃,示差折光檢測器溫度40 ℃,進樣量20 μL。

木糖(木二糖、木三糖)標準曲線的制作:稱取1.0 g木糖(木二糖、木三糖)標準品,用高純水定容至100 mL,配制成質量分數為1.0%(10.0 mg/mL)的溶液。然后將1.0%的木糖(木二糖、木三糖)溶液進行稀釋分別配制不同濃度(0.6%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%)的木糖(木二糖、木三糖)標準溶液,進行HPLC分析,以峰面積(×105)為縱坐標,木糖(木二糖、木三糖)濃度為橫坐標制備木糖(木二糖、木三糖)標準曲線,并分別得出木糖標準方程Y=15.7X-2.15(R2=0.998);木二糖標準方程Y=17.3X+0.95(R2=0.994);木三糖標準方程Y=14.8X+2.99(R2=0.998)。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 反應體系pH對還原糖轉化率的影響 由圖1可以看出,隨著反應體系pH的增加,還原糖轉化率迅速增加,當pH=5時,還原糖轉化率達到最高值,為32.74%。而pH>5時,還原糖轉化率與反應體系pH呈負相關。

圖1 反應體系pH對還原糖轉化率的影響Fig.1 Effect of ratereaction system pH on the reducing sugar conversion rate

2.1.2 超聲時間對還原糖轉化率的影響 由圖2可以看出,超聲時間在未達到40 min時,還原糖轉化率隨著超聲時間的增加呈上升趨勢;超聲時間40 min時還原糖的轉化率達到45.36%,隨后趨于穩定。

圖2 超聲時間對還原糖轉化率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the reducing sugar conversion rate

2.1.3 超聲溫度對還原糖轉化率的影響 由圖3可以看出,還原糖轉化率隨超聲溫度的升高而迅速增加,當溫度達到45 ℃時,還原糖的轉化達到最高,為45.32%,而后轉化率逐漸下降。在超聲耦合酶水解反應過程中,其中最關鍵的兩個因素是空化效應和熱效應。當反應溫度較低時,熱效應為主導因素,超聲波將能量傳遞給整個反應體系,從而加速了酶解速率。隨著溫度繼續增加,空化效應為主導因素,液體微泡的破裂會伴隨著能量的釋放,同時伴隨產生的自由基很可能會攻擊酶的活性中心,從而破壞酶分子的構象,進而導致酶解速率降低,使得還原糖轉化率逐漸下降[13]。

圖3 超聲溫度對還原糖轉化率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the reducing sugar conversion rate

2.1.4 超聲頻率對低聚木糖轉化率的影響 由圖4可以看出,超聲頻率對木聚糖酶的酶解促進作用比較明顯,還原糖轉化率從28～50 kHz逐漸增加,超聲頻率為50 kHz時還原糖轉化率達到峰值,為49.88%。隨著超聲頻率繼續增加,還原糖轉化率呈現下降趨勢。朱少娟等[14]研究表明,超聲頻率較低時,超聲波所產生的能量場增加了木聚糖酶與木聚糖的接觸面積,從而加快了酶解速率;頻率增加到某一特定值時,超聲波可能使酶的活性中心暴露到最大,底物結構更松散,促進酶與底物的結合,使還原糖轉化率達到最大。當超聲頻率繼續增加后,超聲波的能量場過于強烈,破壞了酶分子的構象,使酶的活性中心受到破壞,從而導致酶活性降低,降低了反應速率。

圖4 超聲頻率對還原糖轉化率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on the reducing sugar conversion rate

2.1.5 超聲強度對低聚木糖轉化率的影響 由圖5可以看出,還原糖的轉化率隨著超聲頻率的增加而增加,當超聲強度為0.22 W/cm2時,還原糖的轉化率達到最高,為48.62%。而后隨著超聲強度繼續增加,還原糖得率逐漸下降。在不同的超聲強度下對酶分子的構象產生不同的變化。王振斌等[15]研究中發現,在較低的超聲強度下,使酶分子的能量增加和介質溫度提升,引起酶分子構象的微小變化,使酶分子的超微結構更具柔性、更合理,從而表現出較高的催化活性。在較高的超聲強度下,酶分子的能量進一步加大,構象逐漸趨向于不合理,使酶分子的催化活力遭到破壞,甚至使酶失活,進而降低酶解反應速率。

圖5 超聲強度對還原糖轉化率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic intensity on the reducing sugar conversion rate

2.2 響應面優化

表3 回歸方程的變量分析表Table 3 Multivariate analysis table of the regression equation

注:*:差異顯著(p<0.05);**:差異極顯著(p<0.01)。

利用Design-Expert軟件對響應值進行二次多項回歸擬合,獲得木二、木三糖占總還原糖比例對超聲時間(A)、超聲頻率(B)、反應體系pH(C)的二次多項回歸方程為:Y=49.87+0.97A+4.17B+3.26C-0.25AB+0.55AC+1.07BC-2.94A2-11.97B2-6.70C2

表2 中心組合設計及結果Table 2 Design and result of Box-Benhnken experiment

根據表3可以看出,模型的p<0.01,為極顯著,失擬項的p>0.05,為不顯著,實驗誤差小,說明模型擬合非常可靠。方差結果還表明方程一次項(B、C)、二次項(B2、C2)的影響都是顯著的,其中B、B2、C2的影響是極顯著的,因此各實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系,表明回歸模型的意義和真實性良好。各因素間交互作用的響應面圖見圖6。

圖6 各因素間交互作用的響應面圖Fig.6 Response surface of interaction between various factors

經響應面優化,模型預測最佳棉籽殼低聚木糖的制備條件為:超聲時間41.81 min,超聲頻率41.03 kHz,反應體系pH5.1,反應溫度45 ℃,超聲強度0.22 W/cm2,在此條件下預測的還原糖轉化率為50.77%。對模型進行驗證,考慮實驗的可操作性,將最佳超聲酶解條件調整為:超聲時間:42 min,超聲頻率:40 kHz,反應體系pH5.1,反應溫度45 ℃,超聲強度0.22 W/cm2。經過3次平行實驗驗證,確定實際還原糖轉化率為50.46%,實際值與預測值之間差異小于1%,說明此模型的預測是可靠的。

2.3 酶解產物液相分析

由圖7可知,超聲耦合酶水解液中含有木糖、木二糖、木三糖以及少量的其他低聚木糖,其中木二糖的含量最高,木糖含量非常少,木二糖含量占粗棉籽殼木聚糖29.38%,占總還原糖的58.22%。

圖7 超聲耦合酶水解液的HPLC圖Fig.7 HPLC of ultrasound-coupled enzymatic hydrolysate

3 結論

通過單因素及Box-Behnken Design響應面優化實驗,對超聲耦合酶解條件進行了優化,優化得到的最佳條件為:超聲時間42 min,超聲頻率:40 kHz,反應體系pH5.1,反應溫度45 ℃,超聲強度0.22 W/cm2,還原糖轉化率為50.46%,木二糖占粗棉籽殼木聚糖的29.38%,占總還原糖的58.22%,其產物中木二糖含量處于較高水平,且木糖的含量極少,可以作為提取高純度的木二糖原料,對指導工業中更好地利用棉籽殼廢棄物等具有重大的意義。

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Preparation of xylooligosaccharides from cottonseed husk by ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis

LI Liang-jun1,TENG Chao1,2,*,LI Xiu-ting1,2,WANG Zhong-yue1,ZHU Yun-ping1

(1.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China;2.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China)

The study focused on ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis to produce xylooligosaccharides from cottonseed husk by response surface methodology. The conditions of ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis were optimized by response surface methodology,and its mathematical model was established. Results showed that the optimal parameters of ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis were as follows:the initial pH5.1,hydrolysis time 42 min,temperature 45 ℃,ultrasonic frequency 40 kHz,ultrasonic intensity 0.22 W/cm2. Under the optimal conditions,the conversion ratio of reducing sugar reached 50.46%. Moreover,the components of ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis were measured by HPLC,the conversion ratio of xylobiose was 29.38%,accounted for 58.22% of the total reducing sugar.

cottonseed husk;xylan;xylooligosaccharides;response surface analysis

2016-07-25

李良軍(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物與酶工程， E-mail：liljbtbu@163.com。

*通訊作者:滕超(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：tc2076paper@163.com。

國家自然科學基金項目(31201449)；國家自然科學基金項目(31371723)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)04-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.027