不同發酵條件對模擬葡萄酒中酒酒球菌檸檬酸代謝的影響

任曉寧,張 宇,陳其玲,劉樹文,2,3,*

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院,陜西楊凌 712100;2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術中心,陜西楊凌 712100;3.西北農林科技大學合陽葡萄實驗示范站,陜西合陽 715300)

不同發酵條件對模擬葡萄酒中酒酒球菌檸檬酸代謝的影響

任曉寧1,張 宇1,陳其玲1,劉樹文1,2,3,*

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院,陜西楊凌 712100;2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術中心,陜西楊凌 712100;3.西北農林科技大學合陽葡萄實驗示范站,陜西合陽 715300)

以酒酒球菌31-DH進行模擬酒蘋果酸-乳酸發酵,使用離子排斥色譜法測定相關代謝物質的含量,研究蘋果酸-乳酸發酵期間及發酵后pH、乙醇和葡萄糖對檸檬酸代謝的影響。結果表明:該方法耗時短、前處理簡單、分離度良好、回收率為87%～108%、精密度為0.77%～4.33%,滿足分析要求。當發酵液處于低pH,高酒精度,低葡萄糖濃度時,檸檬酸代謝緩慢,乳酸、乙酸及2,3-丁二醇的產量較低,雙乙酰含量峰值較高。當發酵液中不含有乙醇時,蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖代謝迅速,伴隨菌體的大量生長,乳酸、乙酸、2,3-丁二醇含量較高,但無雙乙酰的產生。當發酵液中不含有葡萄糖時,檸檬酸代謝速率加快,乳酸產量較低,2,3-丁二醇及雙乙酰產量較高。pH、乙醇、葡萄糖均顯著影響酒酒球菌31-DH對檸檬酸的代謝。

發酵條件,模擬葡萄酒,酒酒球菌,檸檬酸代謝

蘋果酸-乳酸發酵(Malolactic Fermentation,MLF)是葡萄酒釀造過程中重要的二次發酵過程,該過程是在乳酸菌的作用下將L-蘋果酸(二元酸)轉化為L-乳酸(一元酸)和二氧化碳的降酸過程,同時還具有改變葡萄酒色澤,增加微生物穩定性、修飾葡萄酒風味等作用[1-2]。酒酒球菌(Oenococcusoeni)是主導MLF過程的主要乳酸菌菌種,對葡萄酒環境(低pH、高酒精度、營養物質缺乏等)有良好的適應性[3]。MLF期間除代謝蘋果酸外,O.oeni還可以代謝葡萄酒中的其他有機酸,如檸檬酸等[4]。檸檬酸和乳酸的反向轉運會產生跨膜電勢和pH梯度,為菌體的生長提供能量,檸檬酸代謝還可以消耗質子,使細胞質堿化,有助于維持菌體在低pH環境下的胞內pH平衡,從而使菌株更好的適應葡萄酒環境[5]。此外,O.oeni檸檬酸代謝產物(雙乙酰、乙偶姻、2,3-丁二醇等)還是葡萄酒中重要的風味物質,其中雙乙酰可以使葡萄酒具有“黃油味”或“堅果味”,增加葡萄酒的風味和復雜性,另一代謝產物乙酸對葡萄酒的風味和質量也具有一定的影響[6-7]。目前,國內關于檸檬酸代謝的研究主要集中在檸檬酸含量較高的柑橘類水果上,且更多的集中在其合成代謝途徑及調控上[8-9],關于雙乙酰等風味物質的研究主要集中在乳制品及啤酒上[10],對葡萄酒中檸檬酸代謝及雙乙酰產生的研究較少。基于這種情況,本實驗主要探索不同發酵條件對葡萄酒中O.oeni代謝檸檬酸的影響,以期為實際生產中檸檬酸代謝及相關風味物質產生的調控提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒酒球菌31-DH 由西北農林科技大學葡萄酒學院提供;標準品蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、葡萄糖 HPLC級,上海源葉生物科技有限公司;2,3-丁二醇 HPLC級,德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;雙乙酰 高級純,德國Ruibio公司;乙偶姻 高級純,阿拉丁試劑有限公司;濃硫酸、蛋白胨、葡萄糖、酵母浸粉、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、鹽酸半胱氨酸、NaOH、乙醇、酒石酸、L-蘋果酸、檸檬酸、NaCl、(NH4)2SO4、KH2PO4等 均為分析純。

高效液相色譜儀、TW323L型分析天平 日本島津公司;超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;Orion Star A111 pH計、臺式高速離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司;Cary60紫外可見分光光度計 美國Agilent科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 ATB液體培養基的配制(1 L):蛋白胨10 g;葡萄糖10 g;酵母浸粉5 g;MgSO4·7H2O 0.2 g;MnSO4·4H2O 0.05 g;鹽酸半胱氨酸0.5 g;番茄汁250 mL;蒸餾水定容至1 L;用4 mol/L NaOH調pH至4.8,121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種活化 冷凍保藏的酒酒球菌31-DH按2%(v/v)接種量接至10 mL ATB液體培養基中,26 ℃下活化7 d。第一次活化的菌懸液按相同的接種量轉接至10 mL ATB液體培養基中,培養3 d。第二次活化的菌懸液以2%(v/v)接種量轉入100 mL ATB培養基中,培養至對數生長末期,備用。

1.2.3 模擬葡萄酒的配制 實驗中使用模擬葡萄酒,進行不同發酵條件對酒酒球菌代謝檸檬酸的影響,模擬葡萄酒基本化學組成為:乙醇8%(v/v),酒石酸5.0 g/L,L-蘋果酸3.5 g/L,檸檬酸4.0 g/L,D-葡萄糖4.0 g/L,NaCl 0.2 g/L,(NH4)2SO41.0 g/L,KH2PO42.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,MnSO40.05 g/L,酵母浸粉4 g/L,用10 mol/L NaOH調節模擬酒pH至3.4。根據實驗梯度設計調整相應組分含量,配制完成后121 ℃滅菌20 min[11]。

1.2.4 MLF發酵條件的設計

1.2.4.1 pH對酒酒球菌檸檬酸代謝的影響 培養至對數生長末期的酒酒球菌,按10%的比例接種于pH分別為3.0、3.4、3.8的400 mL模擬酒中,用10 mol/L NaOH調節模擬酒的pH,20 ℃培養。

1.2.4.2 乙醇對酒酒球菌檸檬酸代謝的影響 培養至對數生長末期的酒酒球菌,按10%的比例接種于酒精度分別為0、8%、12%(v/v)的模擬酒中,pH調至3.4,20 ℃培養。

1.2.4.3 葡萄糖對酒酒球菌檸檬酸代謝的影響 培養至對數生長末期的酒酒球菌,按10%的比例接種于葡萄糖濃度分別為0、2、4、8 g/L的模擬酒中,pH調至3.4,20 ℃培養。

以上每個處理均設置兩個重復,每3 d取樣測定蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、葡萄糖、雙乙酰和2,3-丁二醇的含量,共取10次樣,其中,當蘋果酸代謝完全時,即為MLF結束,隨后的發酵階段為MLF結束后時期。

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 生長曲線的繪制 每24 h吸取適量菌懸液,600 nm下測定吸光值,以時間為橫坐標,以OD600為縱坐標,繪制MLF過程中菌體的生長曲線。

1.2.5.2 待測物質含量測定 色譜條件:色譜柱為Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid柱(150 mm×7.8 mm),流動相為0.005 mol/L稀硫酸,流速為0.5 mL/min,柱溫為60 ℃,進樣量為20 μL,檢測器為示差檢測器。

標準曲線繪制:配制蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、葡萄糖、雙乙酰、2,3-丁二醇(濃度分別為4、4、4、10、10、4、8 g/L)標準混合液母液,將母液用超純水逐級稀釋8、64、100、500、1000倍,共得到6組不同濃度的標準混合液,將標準混合液經0.45 μm微孔濾膜過濾,每個濃度重復進樣2次,取平均值。以峰面積為橫坐標,標準品濃度為縱坐標,繪制標準曲線。

樣品制備:取不同時期發酵液2 mL在8000 r/min下離心3 min,收集上清液,將上清液與超純水以1∶1的比例稀釋后經0.45 μm微孔濾膜過濾,進樣分析。

1.2.5.3 方法回收率的測定 在采集的所有樣品中隨機選取10個樣品(各取1 mL),分別加入等體積的待測物質標準混合溶液母液(各標準品濃度如1.2.5.2所述),根據加標前和加標后的檢測量計算回收率,每個物質的回收率按照所有測得樣品回收率的平均值計算。

1.2.5.4 方法精密度的測定 采集樣品過程中,隨機選取一次樣品采集過程取6次樣,分別進樣測定相應物質的含量,計算方法的精密度。

表1 不同物質的標準曲線特征Table 1 Standard curve characteristics of different substances

1.3 數據處理

使用Excel 2010及Origin 2016軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 標準混合溶液的色譜圖和標準曲線特征

按照1.2.5.2的色譜條件,將標準混合溶液母液進樣分析,發現檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、葡萄糖、雙乙酰及2,3-丁二醇分離度較好,7種待測物質在13 min前全部出峰,可以滿足實驗要求(圖1)。

圖1 7種標準物質的色譜圖Fig.1 Chromatogram of seven standards

將6組不同濃度的標準混合溶液從低濃度到高濃度依次進樣,根據物質的峰面積與質量濃度進行回歸分析,以峰面積為橫坐標,物質質量濃度為縱坐標,得到各物質的標準曲線特征(表1)。由表1可知:得出的各物質標準曲線的相關系數均大于0.999,線性關系可滿足分析要求。

2.2 方法回收率的測定

由表2可知,除乙酸和雙乙酰回收率較低(均為87%)外,其余代謝產物的回收率在101%～108%之間,而乙酸和雙乙酰回收率較低是由于乙酸和雙乙酰具有一定的揮發性,在樣品處理過程中易損失。由此可得到該色譜條件所測定的實驗結果較準確,用該色譜條件作為測定有機酸、葡萄糖、雙乙酰及2,3-丁二醇的方法是可行的。

表2 方法回收率的測定Table 2 Determination of recovery

2.3 方法精密度的測定

由表3可知,樣品中除了蘋果酸未檢出外,其余6種物質的RSD在0.77%～4.33%之間,均低于5%,該方法用于測定模擬酒中有機酸、葡萄糖、雙乙酰以及2,3-丁二醇時,其精密度可以滿足分析要求。

圖2 不同初始pH對相關物質代謝量及產生量的影響Fig.2 Effect of initial pH on consumption and yield of related substances

表3 方法精密度的測定Table 3 Determination of precision

注:“-”表示未檢出。

2.4 pH對酒酒球菌檸檬酸代謝的影響

在該條件下,蘋果酸迅速發酵,第3 d均發酵完全。由圖2可知,在MLF期間,檸檬酸沒有明顯變化,葡萄糖緩慢代謝,MLF結束后,隨著發酵時間的延長,檸檬酸緩慢代謝,葡萄糖代謝速率降低,在發酵至21～24 d后,檸檬酸與葡萄糖迅速代謝,并伴隨菌體的大量生長,且隨著pH升高,二者進入高速率代謝時期提前,代謝速率提高,這可能是由于pH越高,對菌體的生長越有利,在菌體適應酒環境后,代謝速率明顯提高。乳酸含量在發酵至21～24 d之后迅速升高,且pH越高,乳酸進入迅速產生時期越早。乙酸和2,3-丁二醇含量都隨著時間的變化緩慢升高,且pH越高,其產量越高。在pH3.8時,無雙乙酰的產生。在pH為3.0和3.4時,隨著發酵時間的延長,雙乙酰含量先迅速升高,隨后緩慢降低,這是由于低pH環境下,檸檬酸進入C4代謝途徑有利于維持胞內pH平衡,增強菌體抵抗低pH環境的能力,且隨著發酵時間的延長雙乙酰又被還原為乙偶姻和2,3-丁二醇[5,12-13]。

2.5 乙醇對酒酒球菌檸檬酸代謝的影響

圖3 不同初始酒精度對相關物質代謝量及產生量的影響Fig.3 Effect of initial ethanol concentrations on consumption and yield of related substances

在該條件下,蘋果酸迅速發酵,第3 d均發酵完全。由圖3可知,當酒精度為0%時,檸檬酸與葡萄糖均迅速代謝,MLF結束后,葡萄糖代謝速率降低,發酵至24 d后,迅速代謝完全。當酒精度為8%時,檸檬酸與葡萄糖前期均沒有明顯代謝,發酵至24 d后,檸檬酸代謝速率增加,葡萄糖迅速代謝完全。當酒精度為12%時,檸檬酸與葡萄糖均無明顯代謝。乳酸、乙酸、2,3-丁二醇的含量隨著發酵時間的延長逐漸升高,且酒精度越高,代謝物產量越低,且產生速率越低,這是由于乙醇對菌體具有強抑制作用,當酒精度達到8%時,會延遲菌體對檸檬酸和葡萄糖的代謝[14],當酒精度為12%時,菌體對檸檬酸和葡萄糖的代謝能力迅速降低,導致相應產物的產量較低,當發酵基質中不含有乙醇時,能量物質迅速代謝,同時伴隨著菌體的大量生長[15]。酒精度為0%時,沒有雙乙酰的產生,酒精度為8%和12%時,隨著發酵時間的延長,雙乙酰含量先迅速升高,隨后緩慢降低,且酒精度越低,雙乙酰檢出時期越早,可能是由于當酒精度為12%時,菌體受到極大抑制,各物質代謝速率均降低,導致雙乙酰的產生期延長。

2.6 葡萄糖對酒酒球菌檸檬酸代謝的影響

圖4 不同初始葡萄糖濃度對相關物質代謝量及產生量的影響Fig.4 Effect of initial glucose concentration on consumption and yield of related substances

葡萄糖濃度為0 g/L時,蘋果酸在第5 d發酵完全,其他濃度葡萄糖條件下蘋果酸在第3 d發酵完全。由圖4可知,檸檬酸隨發酵時間的延長緩慢代謝,其中葡萄糖濃度為0 g/L及8 g/L時,檸檬酸代謝速率較快,而當葡萄糖濃度為2 g/L或4 g/L時,檸檬酸代謝速率較慢。葡萄糖前期代謝緩慢,且隨濃度升高,后期代謝速率加快。當葡萄糖濃度較高時,乳酸前期含量無明顯變化,后期隨著糖和檸檬酸的代謝迅速升高。乙酸和2,3-丁二醇含量隨著發酵時間的延長逐漸升高,且隨著檸檬酸和葡萄糖的大量代謝在發酵后期含量明顯升高。當發酵液中不含有葡萄糖時,雙乙酰含量持續增加,當含有葡萄糖時,隨糖濃度降低,雙乙酰含量峰值升高,這是由于葡萄糖對酒酒球菌代謝檸檬酸有一定的抑制作用,當不含葡萄糖時,酒酒球菌會代謝檸檬酸產生大量雙乙酰,當葡萄糖濃度越高,菌體會優先利用葡萄糖提供能量,隨后緩慢代謝檸檬酸[16]。然而Salou等[17]研究認為糖和檸檬酸的共代謝對于雙乙酰的產生是必要的,這可能是由于菌株及實驗條件不同造成的。

3 結論

本研究采用離子排斥色譜法對葡萄酒中糖、有機酸、醇、酮等7種不同類別的物質同時進行了分析檢測,其前處理簡單、分離度良好、回收率為87%～108%、精密度為0.77%～4.33%,滿足分析要求,縮短了檢測的時間,可以作為同時檢測葡萄酒中糖、酸、醇、酮的方法。以蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖為底物進行MLF,MLF期間及發酵后酒酒球菌31-DH的代謝表現為三個階段。pH、乙醇、葡萄糖均顯著影響酒酒球菌對檸檬酸的代謝。當環境條件不適宜酒酒球菌生長時,其雙乙酰產量升高,且其含量隨著時間的變化先升高后降低,因此在實際生產中適當延長MLF時間,酒精發酵時將糖發酵完全可以提高酒中雙乙酰含量,提供相應的“奶油”風味,但應控制發酵時間,避免時間過長造成乙酸含量的升高,從而影響葡萄酒的質量。

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Effect of different conditions on citrate metabolism byOenococcusoeniin model wine

REN Xiao-ning1,ZHANG Yu1,CHEN Qi-ling1,LIU Shu-wen1,2,3,*

(1.College of Enology,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling 712100,China;2.Shaanxi Engineering Research Center of Viti-Viniculture,Yangling 712100,China;3.Heyang Experimental Demonstration Station,Northwest Agriculture and Forestry University,Heyang 715300,China)

WithOenococcusoeni31-DH as material for malolactic fermentation,the effects of pH,ethanol and glucose on the citrate metabolism during and after malolactic fermentation were studied. Ion exclusion chromatography was used to measure the contents of the related substances. The results showed that the experiment was time-saving with simple pretreatments,good separation degree,recovery rate between 87%～108% and RSD between 0.77%～4.33% which met the requirements of analysis. With lower pH values,higher ethanol contents and lower glucose contents of the fermentation broth,the citrate metabolism was slower,the lactic acid,acetic acid and 2,3-butanediol contents were lower,while the diacetyl content peak was higher. When the fermentation broth contained no ethanol,the malic acid,citric acid and glucose were metabolized rapidly,associated with mass growth of bacteria,higher contents of lactic acid,acetic acid and 2,3-butanediol,while no diacetyl. When the fermentation broth contained no glucose,the rate of citrate metabolism accelerated,lactic acid production was low and the production of 2,3-butanediol and diacetyl was high. pH,ethanol and glucose had significant effects on the citrate metabolism ofO.oeni.

fermentation conditions;model wine;Oenococcusoeni;citrate metabolism

2016-05-24

任曉寧(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：釀酒微生物，E-mail：renxiaoning543@163.com。

*通訊作者:劉樹文(1965-)，男，教授，研究方向：葡萄釀酒微生物，E-mail：liushuwen@nwsuaf.edu.cn。

現代農業產業技術體系建設專項資金資助項目(nycytx-30-ch-03)。

TS262.6

A

:1002-0306(2017)04-0180-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.026