鰱魚復(fù)合酶解產(chǎn)物的理化及功能特性研究

周 航,何 強

(四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610065)

鰱魚復(fù)合酶解產(chǎn)物的理化及功能特性研究

周 航,何 強*

(四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610065)

采用復(fù)合蛋白酶及風味蛋白酶對鰱魚魚肉進行復(fù)合酶解,通過控制水解時間制得產(chǎn)品SCH1、SCH2、SCH3、SCH4和SCH5,其水解度分別為7.5%、9.4%、10.3%、11.6%、14.6%,考察其分子量、等電點等基本特性,并與酶解前對比考察其持油性、溶解性、起泡性、乳化性等功能性質(zhì),同時對其體外抗氧化活性進行研究。結(jié)果表明:五種酶解產(chǎn)物的等電點均為pH2左右,重均分子量分布于1000～3000 u之間;與酶解前相比,產(chǎn)品溶解性提高57.99%以上,持油性略有降低;乳化性、起泡性均明顯增強,酸性環(huán)境(pH2)中起泡性最差,而堿性環(huán)境(pH10)中乳化性最強;ABTS+·清除率、脂質(zhì)過氧化抑制率及還原能力均隨水解度增大而升高,其中清除率最高達到90.75%。所研發(fā)鰱魚酶解產(chǎn)品既可直接食用,又能作為原輔料應(yīng)用于食品加工過程,可為鰱魚精深加工產(chǎn)品研發(fā)提供新思路。

鰱魚,復(fù)合酶解,分子量,等電點,功能性質(zhì),抗氧化活性

在我國,鰱魚屬大宗淡水養(yǎng)殖魚類,分布廣泛,生長速度快且個體大,魚體營養(yǎng)豐富,水分含量高,目前多以鮮銷的方式進入市場。但源于其肉薄、刺多、腥味重等缺點,市面銷售價格很低,且鰱魚體內(nèi)的組織酶等活躍,造成滯銷的鰱魚易腐敗變質(zhì),導致大量鰱魚資源的浪費[1]。目前,以鰱魚為原料的加工產(chǎn)品主要有冷凍魚片、魚糜制品、腌制或干制品、魚排等,對于鰱魚蛋白的利用較少[2]。鰱魚蛋白屬優(yōu)質(zhì)蛋白,必需氨基酸種類齊全且含量豐富,若充分利用,必能開發(fā)出兼具經(jīng)濟及營養(yǎng)價值的高值蛋白制品。因此,開發(fā)鰱魚蛋白精深加工產(chǎn)品,提高鰱魚利用率及其附加價值,避免資源浪費是淡水魚行業(yè)亟待解決的重要問題。

郭浩楠[3]等研究了堿性蛋白酶對鰱魚蛋白的酶解效果,發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)均有一定提高;陳志軍[4]等采用復(fù)合蛋白酶對鰱魚蛋白進行水解改性,發(fā)現(xiàn)酶法水解對鰱魚蛋白質(zhì)的部分功能性質(zhì)有一定改善;楊遠帆[5]等研究了堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分段水解鰱魚蛋白的工藝,并以氨基酸態(tài)氮含量為指標確定了高產(chǎn)率水解工藝。本研究基于以上研究,采用風味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對鰱魚魚肉進行復(fù)合酶解,制得不同水解度的酶解產(chǎn)物,并考察其理化性質(zhì)、功能性質(zhì)及體外抗氧化活性,以期為鰱魚蛋白的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰱魚 購于成都市武侯區(qū)郭家橋菜市場;風味蛋白酶(Flavourzyme,28.5×104U/g)、復(fù)合蛋白酶(Protamex,10.7×104U/g) Novo酶制劑公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2′-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 美國Sigma公司;其他試劑 均為分析純。

TG-1850臺式多功能離心機 四川蜀科儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;Nano S90納米粒度及Zeta電位分析儀 英國Malvern公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解工藝 新鮮鰱魚300 g,除去魚鱗、頭尾、內(nèi)臟,經(jīng)粉碎機絞碎后得魚肉150 g,加入150 g蒸餾水調(diào)成魚漿,105 ℃下蒸煮脫脂10 min,紗布過濾沖洗瀝干得魚肉泥。取魚泥100 g加入267 mL蒸餾水,混勻后在53 ℃、pH7.3條件下進行酶解,加酶量為風味蛋白酶(0.24±0.005) g、復(fù)合蛋白酶(0.60±0.005) g,分別酶解15、30、50、80、120 min后,95 ℃下滅酶20 min,酶解液過濾后取樣測定水解度,冷凍干燥(干燥時間48 h,干燥溫度20～35 ℃)制得蛋白粉產(chǎn)品SCH1、SCH2、SCH3、SCH4、SCH5。以鰱魚未經(jīng)水解所得產(chǎn)品為空白樣品(CK)。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 水解度 水解度測定采用pH-STAT法[6]。

1.2.2.2 等電點 等電點測定參考程海明[7]等的方法,其中樣品溶液濃度為1 mg/mL。

1.2.2.3 分子量 重均分子量測定采用Viscoteck 270 maxTM凝膠滲透色譜(GPC)和TSK gel G2000SWXL凝膠色譜柱構(gòu)成的凝膠滲透色譜系統(tǒng)進行檢測。用pH7.0,0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制10 mg/mL的樣品溶液,檢測條件:進樣量100 μL,柱溫30 ℃,樣品溶劑為洗脫液,流速0.6 mL/min。

1.2.2.4 持油性 持油性(oil holding capacity,OHC)以每克樣品吸附油的質(zhì)量表示。準確稱取0.200 g樣品(精確到0.001 g)與5 mL大豆油于離心管(質(zhì)量記為m0)中混勻,室溫下靜置30 min,8000 r/min離心30 min,棄去上清液,稱量樣品和離心管重量(m1),質(zhì)量增加量即為樣品吸油量,計算方法如式(1):

式(1)

1.2.2.5 溶解性 溶解性測定采用氮溶解指數(shù)(NSI)[8]法改進,分別配制0.5 mg/mL樣品溶液,調(diào)節(jié)溶液pH分別為2、4、6、8、10、12,10000 r/min離心15 min,采用考馬斯亮蘭法測定上清液蛋白質(zhì)含量,同時測定對照中蛋白質(zhì)含量,溶解性計算方法如式(2):

式(2)

1.2.2.6 起泡性、泡沫穩(wěn)定性[4,9]準確稱取0.5 g樣品溶于50 mL去離子水中,分別調(diào)pH為2、6、10,10000 r/min分散1 min后轉(zhuǎn)移至量筒中,量取起始泡沫體積,記錄均質(zhì)停止后10、30、60、90 min時的泡沫體積,以此測定樣品泡沫穩(wěn)定性,起泡性及泡沫穩(wěn)定性，計算方法見式(3)、式(4)。

式(3)

泡沫穩(wěn)定性(%)=一段時間后的泡沫體積(mL)/初始泡沫體積(mL)×100

式(4)

1.2.2.7 乳化性[4,9]準確配制0.2%(質(zhì)量分數(shù))的樣品溶液,分別取30 mL調(diào)溶液pH至2、6、10,加入10 mL大豆油后10000 r/min分散1 min,立即用移液槍于容器底部取樣50 μL,加入0.1%(質(zhì)量分數(shù))SDS溶液10 mL,混勻后在500 nm處測定其吸光度,以SDS溶液做空白對照,乳化性計算方法如式(5)。

式(5)

式中:n為稀釋倍數(shù);A為乳化液吸光度;c為樣品質(zhì)量濃度(g/mL);φ為乳化液中油相比例,為0.25。

1.2.2.8 抗氧化能力 ABTS+·陽離子清除能力、還原能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力測定均參考曾維才[10]的方法。

脂質(zhì)過氧化抑制能力測定對曾維才[10]的方法進行改進。測定時采用雞蛋黃勻漿(10%,v/v)作為反應(yīng)的脂質(zhì)媒介。取0.1 mL受試物溶液(5 mg/mL,w/v)與0.5 mL蛋黃勻漿液、0.4 mL蒸餾水及50 μL硫酸亞鐵溶液(70 mmol/L)混合,充分搖勻,37 ℃下孵育30 min,迅速加入1.5 mL乙酸溶液(20%,v/v)、1.5 mL硫代巴比妥酸溶液(0.8%,w/v,用1.1% SDS溶液配制),充分振蕩后95 ℃水浴反應(yīng)60 min。待反應(yīng)物冷卻至室溫,加入5 mL正丁醇,搖勻后10000 r/min離心20 min,取上清液在532 nm下測定吸光度,以不添加脂質(zhì)媒介(10%雞蛋黃勻漿,v/v)的樣品溶液(5 mg/mL,w/v)作對照,以排除樣品自身含有的不飽和脂肪酸的干擾,蒸餾水做空白對照。計算方法如式(6)。

脂質(zhì)過氧化抑制率(%)

式(6)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示,n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚酶解產(chǎn)物的基本特性

預(yù)實驗階段分別考察了堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對鰱魚魚肉的水解作用,通過對水解過程及產(chǎn)物性質(zhì)的分析,最終選擇水解程度高的復(fù)合蛋白酶及產(chǎn)物風味佳的風味蛋白酶對鰱魚魚肉進行復(fù)合水解,酶解時間(180 min)內(nèi)產(chǎn)物水解度保持增長趨勢,表明該時間內(nèi)水解反應(yīng)處于酶量充足的狀態(tài)。通過控制水解時間,制得水解度在7.5%～14.6%之間的五種酶解產(chǎn)物,其等電點及重均分子量見表1所示。

表1 鰱魚酶解產(chǎn)物的基本特性Table 1 Basic characteristics of silver carp hydrolysates

采用納米粒度及Zeta電位分析儀對產(chǎn)品進行等電點測定,樣品在低pH時帶正電荷,高pH時帶負電荷,處于等電點時正負電荷相等,表面電勢為零[11]。五種酶解產(chǎn)物的等電點均在pH2左右(見表1),其中酶解產(chǎn)物SCH5的等電點(pI)為1.9(見圖1)。鰱魚蛋白中酸性氨基酸含量高于堿性氨基酸,水解作用將其肽鏈打斷,斷裂的肽鍵增多,使得蛋白質(zhì)表面的電荷分布發(fā)生變化,且暴露出的酸性氨基酸數(shù)目增加,從而導致樣品等電點均偏酸性。

圖1 鰱魚酶解產(chǎn)物SCH5的等電點Fig.1 Isoelectric point of silver carp hydrolysate SCH5

經(jīng)過蛋白酶的水解作用,鰱魚蛋白大分子聚合物逐步解體,產(chǎn)生分子量較小的多肽和游離氨基酸。隨水解程度的增大,樣品分子量逐漸減小,均處于1000～3000 u之間(見表1),表明酶解過程產(chǎn)生大量肽段及氨基酸,極大的改變了鰱魚蛋白的結(jié)構(gòu),從而導致產(chǎn)物功能性質(zhì)及生物活性的變化。小分子肽的增加有利于溶解性的改善,同時產(chǎn)生具有一定功能性的肽段[12],不僅改變了鰱魚蛋白原有形態(tài)從而提高其實用價值,而且增加產(chǎn)品功能性拓寬其應(yīng)用范圍,為鰱魚蛋白的精深加工奠定了理論基礎(chǔ)。

2.2 溶解性及持油性

蛋白質(zhì)的溶解性與分子大小密切相關(guān),而持油性則源于蛋白微粒對油脂的物理截持作用。水解作用造成蛋白質(zhì)肽鏈斷裂,一、二級結(jié)構(gòu)被破壞,聚合體逐步解體,分子量降低,暴露在外的極性基團(-COOH、-NH2-等)數(shù)目增加,疏水基團相對減少[4,13]。由表2可知,酶解樣品的溶解性有極大改善,與酶解前相比增加57.99%以上,且與水解度呈正相關(guān);持油性則略有下降,與水解度呈負相關(guān),其中SCH1表現(xiàn)出較優(yōu)的持油性能。水解作用破壞了鰱魚蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),隨水解度增加,肽鏈舒展,蛋白質(zhì)微粒越大,總表面積越小,其宏觀上表現(xiàn)為樣品的容積密度越大,持油能力越小[3]。然而SCH1表現(xiàn)出的良好持油性,應(yīng)源于輕度水解條件下鰱魚蛋白的部分空間結(jié)構(gòu)被破壞,肽鏈舒展且斷裂較少,因此對油脂的截留作用較優(yōu)。同時,水解作用使得極性基團增加,親水性提高,從而促使蛋白質(zhì)與水的相互作用增強,致其溶解性增加,且隨水解度的增大(DH7.5%～14.6%),酶解體系中暴露的親水基團增加,溶解性隨之增大。

溶解性能影響蛋白質(zhì)的多種功能性質(zhì),包括增稠、起泡、乳化和凝膠作用等,不溶性蛋白在食品中的應(yīng)用非常有限[14]。經(jīng)過水解作用,鰱魚蛋白的溶解性大大提高,從而拓寬其應(yīng)用范圍,既可作為半成品應(yīng)用于食品加工中,又能作為高營養(yǎng)價值的蛋白粉直接沖調(diào)食用。

表2 鰱魚酶解產(chǎn)物的溶解性和持油性Table 2 Solubility and oil holding capacity of silver carp hydrolysate

2.3 起泡性及乳化性

蛋白質(zhì)同時具有親水親油基團及區(qū)域,是一種兩性高聚物,能自發(fā)的遷移至汽-水界面或油-水界面,因此具有較優(yōu)的表面活性,起泡性和乳化性則是兩種基于良好溶解性下的重要界面性質(zhì)。本實驗分別探討了pH2、pH6、pH10環(huán)境中鰱魚酶解前后的起泡(圖2A)及乳化性能(圖2B)。結(jié)果表明,在不同酸堿環(huán)境中五種酶解產(chǎn)物的起泡性及乳化性高于酶解前(酸性條件下SCH1起泡性略低于酶解前),且在酸性環(huán)境(pH2)中起泡性最差,而堿性環(huán)境(pH10)中乳化性最強。在酸性環(huán)境中SCH2～SCH5起泡性提升15%以上；在中性及堿性條件下，酶解樣品起泡性提升20%以上。

圖2 鰱魚酶解產(chǎn)物的起泡性(A)與乳化性(B)Fig.2 Foaming ability(A)and emulsifying activity index(B)of silver carp hydrolysates

起泡性及乳化性受蛋白質(zhì)溶解性的影響極大,基于鰱魚蛋白的不溶性,其起泡能力及乳化性能明顯較差。又由于水解作用將大分子的蛋白質(zhì)肽鏈逐步斷開,形成小分子的肽,溶解性提高,蛋白質(zhì)能迅速分散至汽-水界面,從而形成粘稠的薄膜[15-16];同時暴露出更多的疏水基團,使蛋白質(zhì)更易于在油/水界面上擴散并定位,因此乳化能力增強[17-18]。由表1可知,五種酶解產(chǎn)物等電點均分布在pH2左右,此時分子表面凈電荷量降至最小值,水合作用減弱導致蛋白質(zhì)分子的聚集和沉降,溶解性變差,導致起泡性變差。酸性環(huán)境下SCH1的起泡性略低于酶解前,推測是由于水解程度低,促使部分肽鏈展開,在汽-水界面形成薄膜的能力較差。此外,不同酶解產(chǎn)物在堿性環(huán)境(pH10)中表現(xiàn)出的良好乳化性能源于蛋白酶的輕度水解作用使其在該環(huán)境下帶有大量負電荷,增加了液滴的靜電相互作用,使液滴之間產(chǎn)生排斥力,從而阻止液滴凝聚[19-20]。

通常來說,具有良好起泡性的蛋白質(zhì)不具有穩(wěn)定泡沫的能力,而產(chǎn)生穩(wěn)定泡沫的蛋白質(zhì)往往顯示不良的起泡性[13]。由圖3～圖5可知,CK在pH2、pH6、pH10環(huán)境中產(chǎn)生的泡沫比例于10 min時仍維持在100%、94.29%及100%,表現(xiàn)出良好的泡沫穩(wěn)定性。與之相反,10 min時酶解產(chǎn)物的泡沫僅在pH2環(huán)境中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,SCH1的泡沫比例為100%,而pH6和pH10中SCH1的泡沫比例僅為10.91%和53.19%,該現(xiàn)象源于蛋白質(zhì)在等電點缺乏界面及吸附分子的推斥相互作用,導致吸附至界面的蛋白質(zhì)數(shù)量增加,泡沫穩(wěn)定性良好[21]。酶解產(chǎn)物具有的良好起泡性及乳化性極大的提高其實用價值,起泡/乳化能力高、適用性強、具有營養(yǎng)價值的產(chǎn)品正是食品工業(yè)需求量極大的理想的起泡劑/乳化劑。

圖3 pH=2時鰱魚酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性Fig.3 Foaming stability of silver carp hydrolysates(pH=2)

圖4 pH=6時鰱魚酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性Fig.4 Foaming stability of silver carp hydrolysates(pH=6)

圖5 pH=10時鰱魚酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性Fig.5 Foaming stability of silver carp hydrolysates(pH=10)

2.4 ABTS+·清除及脂質(zhì)氧化抑制能力

預(yù)實驗中對比考察了酶解產(chǎn)物對ABTS+·及DPPH自由基的清除效果,結(jié)果表明清除ABTS+·的效果更優(yōu),因此本實驗僅探討樣品對ABTS+·的清除能力,以及抑制脂質(zhì)過氧化的效果。如圖6所示,隨樣品水解度增大,ABTS+·清除率及脂質(zhì)過氧化抑制率不斷增加,SCH5(DH14.6%)的清除率和抑制率分別為90.75%、40.54%。

圖6 鰱魚酶解產(chǎn)物的ABTS+·清除能力及脂質(zhì)氧化抑制能力Fig.6 ABTS+· scavenging capability and lipid peroxidation inhibition of silver carp hydrolysates

鰱魚蛋白在水解過程中暴露出部分活性氨基酸基團,生成具有較強供給氫能力的產(chǎn)物,易與ABTS+·陽離子中的活性電子結(jié)合。隨水解度增加,酶解產(chǎn)物中的游離氫離子數(shù)量增多,猝滅自由基氧化活性的能力增強,從而降低體系的氧化態(tài)勢,體現(xiàn)出較強的抗氧化活性。同時,脂質(zhì)過氧化屬自由基鏈式反應(yīng),該過程既需要自由基的啟動,也產(chǎn)生大量的自由基,反應(yīng)過程還依靠自由基的推動作用。酶解產(chǎn)物對其的抑制作用應(yīng)源于抗氧化肽及活性氨基酸對自由基的猝滅和鏈式反應(yīng)的阻斷效應(yīng)的雙重作用[10]。

生物體內(nèi)過量的自由基會攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子,破壞細胞及組織器官,而酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出的較強抗氧化性增加了產(chǎn)品的功能性,進一步拓寬了產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。

2.5 還原能力

實驗中以物質(zhì)對三價鐵離子的還原作用強弱測定其還原能力,反應(yīng)產(chǎn)物在700 nm處有特征吸收峰,其生成量與受試物的還原能力呈正相關(guān),因此以產(chǎn)物吸光度值變化表征樣品還原能力強弱,如圖7所示。結(jié)果表明,隨酶解產(chǎn)物水解度增加,吸光度值逐漸增大。水解過程中暴露的抗氧化肽及抗氧化氨基酸增多,體系中被還原的Fe3+數(shù)量增加,表明其還原能力逐漸增大。

圖7 鰱魚酶解產(chǎn)物的還原能力Fig.7 The reaction on reducing capability of silver carp hydrolysates

3 結(jié)論

本文以鰱魚為原料,采用復(fù)合蛋白酶和風味蛋白酶進行復(fù)合酶解,通過控制水解時間制得水解度在7.5%～14.6%之間的五種酶解產(chǎn)物,其等電點均在pH2左右,重均分子量為1000～3000 u之間。與酶解前相比,產(chǎn)品溶解性增加57.99%以上,SCH1持油性較酶解前提升了(0.86±0.11)g/g樣品,但SCH2～SCH5持油性均低于酶解前;在中性及堿性條件下,樣品起泡性提升20%以上,酸性環(huán)境中SCH2～SCH5提升15%以上;堿性環(huán)境中樣品具備優(yōu)良乳化性(乳化性60%以上)。同時,隨水解程度增加(7.5%～14.6%),樣品表現(xiàn)出遞增的ABTS+·清除能力、脂質(zhì)氧化抑制能力及還原能力。經(jīng)過蛋白酶水解作用,本產(chǎn)品改變了鰱魚的食用方式,增加了食品種類,不僅可作為食品直接食用,亦可作為半成品用于食品加工過程,拓寬了鰱魚蛋白制品的應(yīng)用范圍。本產(chǎn)品兼具功能性及抗氧化性,是鰱魚精深加工產(chǎn)品的新突破,極大的提高了其經(jīng)濟附加值,拓寬其應(yīng)用前景。

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Physicochemical and functional properties of the enzymatic hydrolysates of silver carp

ZHOU Hang,HE Qiang*

(Sichuan University,College of Light Industry and Food Engineering,Chengdu 610065,China)

Using flavourzyme and protamex combined-enzyme method,the silver carp hydrolysates named SCH1,SCH2,SCH3,SCH4 and SCH5 were obtained by controlling the hydrolysis time,whose degree of hydrolysis were 7.5%,9.4%,10.3%,11.6% and 14.6%,and the molecular weight,isoelectric point,oil holding capacity,solubility,emulsifying activity,foaming capacity and antioxidant activity of silver carp hydrolysates were investigated in this paper. The results showed that isoelectric point of hydrolysates was about pH2,and the Mwwas between 1000～3000 u.After enzymatic hydrolysis,solubility of products increased by 57.99 percent,but oil holding capacity decreased. Meanwhile,emulsifying and foaming properties were significantly enhanced,and foaming was the worst in acidic environment(pH2)while the emulsifying was the best in alkaline environment(pH10).The ABTS+·-scavenging capability,lipid peroxidation inhibition and reducing capability were obviously increased as the increased degree of hydrolysis(DH7.5%～14.6%),in which the ABTS+·-scavenging rate reached 90.75%. The products are both functional and antioxidative,which can be eaten directly,and can also be used as raw materials in food processing. Results may provide new idea for the development of some deep processing products of silver carp.

silvercarp;combined-enzymemethod;molecular weight;isoelectric point;functional properties;antioxidant activity

2016-08-16

周航(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：zhouhang0602@foxmail.com。

*通訊作者:何強(1971-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及質(zhì)量安全，E-mail：heq361@163.com。

TS254.1

A

:1002-0306(2017)04-0158-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.022