孔雀石綠及隱色孔雀石綠在花鱸組織中的分布與消除規律

丁軍偉,鄧建朝,楊賢慶,*,李來好,趙慶志,吳燕燕,陳勝軍,李春生

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

孔雀石綠及隱色孔雀石綠在花鱸組織中的分布與消除規律

丁軍偉1,2,鄧建朝1,楊賢慶1,*,李來好1,趙慶志1,2,吳燕燕1,陳勝軍1,李春生1

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

本實驗用濃度為0.15 mg/mL的孔雀石綠藥浴花鱸1 h后轉移至水泥池中用淡水養殖,研究孔雀石綠(MG)及其代謝產物隱色孔雀石綠(LMG)在花鱸各組織中的分布與消除規律。采用超高效液相色譜串聯質譜法快速檢測MG、LMG在花鱸的背肌、魚皮、肝臟的含量,并用內標法來進行定量。結果表明,在消除期間,LMG的濃度始終高于MG的。MG、LMG在肝臟中的濃度最高。MG在花鱸3種組織中的最大濃度由高到低的順序為:肝臟(94.86±8.12) μg/kg>魚皮(19.35±1.88) μg/kg>背肌(7.47±0.45) μg/kg。MG在背肌、魚皮、肝臟中分別于168、960、2160 h時檢測不到。MG在3種組織中的半衰期長短的先后順序為:肝臟(7.22 d)=魚皮(7.22 d)>背肌(1.44 d)。LMG在花鱸3種組織中的最大濃度由高到低的順序為:肝臟(3607.13±189.56) μg/kg>背肌(103.65±14.97) μg/kg>魚皮(82.10±7.64) μg/kg。LMG在3種組織中的半衰期長短的先后順序為:背肌(28.88 d)=魚皮(28.88 d)>肝臟(14.44 d)。消除2544 h后,背肌、魚皮、肝臟中的LMG含量仍然高于檢測限。

殘留,孔雀石綠,隱色孔雀石綠,花鱸,組織分布

孔雀石綠(malachite green,MG)是水產養殖中禁用的一種三苯基甲烷類工業燃料[1-2],能有效地的防治外部真菌、原蟲感染等疾病[3]。孔雀石綠多用于水產動物的繁殖、消毒和運輸等環節[4]。但是MG和他的主要代謝產物隱色孔雀石綠(leucomalachite green,LMG)對人體具有致畸、致癌、致突變的“三致”作用[5-6]。現在MG禁止用于所有動物食品中,但是由于孔雀石綠抗菌效果好、價格低廉,在水產養殖中仍有違規使用的情況,例如2015年5～6月,國家食品藥品監督管理總局抽查水產品中發現鱸魚等體內MG超標。2015年上海市食藥監局第二季度食品安全監督抽檢中發現桂魚和黑魚體內MG超標,2016年1月廣東省食藥監局對全省大型餐飲服務單位銷售的水產品進行抽檢發現桂魚、黃骨魚、鯽魚等MG、LMG超標。這種違法使用禁止獸藥的情況導致社會不安等。

表1 孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氚代孔雀石綠、氚代隱色孔雀石綠質譜條件Table 1 MS parameters of MG,MG-D5,LMG,LMG-D5

注:*代表定量離子。

目前,MG在水產動物體內殘留消除規律的研究主要集中在鯽魚(Carassiusauratus)[7]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[8]、鰻鱺(A.anguilla)[9]、草魚(Ctenopha-ryngodonidellus)[10]、羅非魚(Oreochromisspp.)[11-12]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[13]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[14]、鯉(CyprinuscarpioLinnaeus)[14]、石斑魚(Epinephelusawoara)[15]、南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)[16-17]、斑點叉尾鮰(IetalurusPunetaus)[4]、雜交鱧(斑鱧Channamaculata♀×烏鱧Channaargus♂)[18]、鱖(Sinipercachuatsi)[19-20]等品種,但是在淡水養殖條件下,孔雀石綠在鱸魚(Lateolabraxmaculatus)體內的消除情況尚未報道。由于人民生活水平的提高,肉質鮮美的花鱸需要量正在增加。但是南方沿海網箱養殖的花鱸不僅種質退化和抗病力降低[21],而且在鹽度為30左右時,生長緩慢,運輸花鱸到內地銷售費用比較高,所以內陸多地正在進行淡水化養殖花鱸。因此,研究了MG和LMG在淡水花鱸體內的組織分布和代謝規律,為加強該藥物的監管及其風險評估提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花鱸 平均體重(100.0±20.0) g,購買于珠海市斗門鎮某養殖場,飼養于中國水產科學院南海水產研究所深圳實驗基地的室內水泥池中;甲酸、乙腈、乙酸銨 為色譜純,美國Thermo Fisher公司;實驗用水 MiliQ超純水;標準品孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氚代孔雀石綠(MG-D5)、氚代隱色孔雀石綠(LMG-D5) 均購自美國Sigma-Aldrich公司,其他試劑為分析純。

超高效液相色譜-串聯質譜儀 美國Waters公司;TDZ5-WS離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;超純水器 美國Millipore;研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司;TKA T25勻漿機 德國;固相萃取裝置 美國Supelco公司;CNW poly-Sery MCX混合型陽離子交換SPE小柱(60 mg/3 mL)。

1.2 實驗方法

1.2.1 養殖條件 養殖池(2.5 m×2.5 m×1.5 m)的水深控制在1.2 m。實驗前暫養一周[22],養殖用水是深圳實驗基地附近的的山泉水,并且用微流水來養殖。實驗期間(2015年08月至2016年01月),淡水溫度的范圍是17.5～25.8 ℃,正常充氣并每天2次投喂空白配合飼料。

1.2.2 色譜條件 進樣量:5.0 μL,柱溫:40 ℃,色譜柱:ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)反相色譜柱,流速:0.3 mL/min。梯度洗脫條件:A相為5 mmol/L乙酸銨+0.1%的甲酸(色譜純),B相為乙腈;0～0.5 min,10% B;0.5～1.5 min,10% B～90% B;1.5～2.5 min,90% B;2.5～3.0 min,90% B～10% B;3.0～5.0 min,10% B。

1.2.3 質譜條件 離子源:電噴霧電離正離子(ESI+)模式掃描;檢測方式:多反應監測(MRM)模式。母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

1.2.4 樣品采集 將花鱸置于含有0.15 mg/L的孔雀石綠溶液的塑料箱中藥浴1 h,然后放入不含孔雀石綠的水泥池中養殖,從放入不含藥的水泥池后即為0 h,每一時間點(0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72、120、168、264、456、720、960、1200、2160、2544 h)取背部肌肉、魚皮、肝臟置于-20 ℃冰箱中保存,直至樣品處理。實驗組分為三個平行的給藥組和一個空白對照組。

1.2.5 樣品預處理 樣品自然解凍后稱取2.0 g放入50 mL塑料離心管中,加入2 g酸性氧化鋁、15 mL的乙腈、100 μL 100 ng/mL混合內標即為氚代孔雀石綠、氚代隱色孔雀石綠溶液,通過1800 r/min、60 Hz研磨,4500 r/min離心10 min,將上清液移至50 mL的離心管中。向離心管中再加入15 mL乙腈,再研磨、離心,將上清液移至同一離心管中。用乙腈調溶液體積為35 mL,向提取液中加入3%的甲酸,振蕩、離心。先活化MCX柱[23],用5 mL提取液上樣,然后淋洗,最后用5%的氨水乙腈洗脫[24],洗脫液用氮氣吹干,溶解殘渣,過濾膜,上機檢測。

1.2.6 標準曲線的制備與回收率的測定 標準曲線的制備:MG和LMG的濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng/mL;繪制標準曲線,得到回歸方程和R2。通過添加MG、LMG標準液使不含MG、LMG的花鱸各組織(背肌、魚皮、肝臟)的含量為0.5、1、2.5 μg/kg,然后按照1.2.5預處理的方法求出含量。

1.2.7 數據處理 實驗所得數據采用Microsoft Excel 2010處理,繪制藥-時曲線,求出消除速率常數(β)和消除曲線方程,計算消除半衰期(t1/2)。

表3 MG、LMG在鱸魚各組織中的消除方程與消除參數Table 3 The equations of elimination curves and parameters of MG,LMG in tissues of perch

注:β為最終消除速率常數,t1/2為消除半衰期。

2 結果與分析

2.1 標準工作曲線

經測定,0.5～100 ng/mL范圍內MG、LMG線性良好。MG、LMG的線性方程分別為Y=1.78253X-1.63327,Y=0.41771X-8.09518,相關系數均大于0.9995。

2.2 方法回收率和精密度

取鱸魚各組織,分別添加3個濃度水平(見表2),每個濃度水平做5個重復。各組織的平均加標回收率為95.3%～107.8%,相對標準偏差2.6%～7.3%。

表2 MG、LMG在鱸魚各組織中的回收率(n=5)Table 2 Recovery of MG and LMG in perch tissues(n=5)

2.3 分布與消除規律

MG、LMG在魚肉中殘留量是最引起人們關注的,因為魚肉是最主要的可食部分,也是最重要的監控組織。從表4中可以看出,MG在背部肌肉中1 h時達到最大濃度即(7.47±0.45) μg/kg,LMG在背肌中0 h時就達到最大濃度即(103.65±14.97) μg/kg。MG的半衰期為1.44 d,LMG的半衰期為28.88 d(見表3)。魚皮是魚與外界接觸面最大的組織,魚皮能起到保護魚體,但是外界物質能通過滲透作用進入魚體。從表4中可以看出,MG在魚皮中0 h時達到最大濃度即(19.35±1.88) μg/kg,LMG在8 h時達到最大含量為(82.10±7.64) μg/kg。MG的半衰期為7.22 d,LMG的半衰期為28.88 d。肝臟在各個器官中是最主要的體內藥物積累和消除器官。從表4中可以看出,MG在肝臟中8 h時達到最大濃度即(94.86±8.12)μg/kg,LMG在肝臟中1 h時達到最大濃度即(3607.13±189.56) μg/kg,在各個組織中含量是最高的。MG的半衰期為7.22 d,LMG的半衰期為14.44 d。

由表4可知,在實驗過程中,MG、LMG在代謝消除過程中變化規律是不同的。MG在花鱸中濃度最高的組織是肝臟,含量高低的順序為肝臟>魚皮>背肌。LMG在花鱸中濃度高低的順序為肝臟>背肌>魚皮。肝臟中MG的含量是背肌的12.7倍,是魚皮的4.9倍。肝臟中LMG的最高含量是背肌的34.8倍,是魚皮的43.9倍。肝臟中MG、LMG濃度最高的原因:MG在體內的其中一種代謝途徑是它在細胞色素P450催化下生成初級和次級代謝產物[9],而肝臟作為排泄組織,含有很多這種P450的混合功能的氧化酶系統[25],因此肝臟不僅可以大量富集MG,而且可以把MG大量轉化為LMG。這說明鱸魚的肝臟在積累和消除MG過程中起著重要作用。

MG在鱸魚的組織中能快速轉化為LMG。在消除期間,LMG在鱸魚組織的含量始終高于MG。在0 h時,背肌中的LMG含量是MG的17.2倍,魚皮中的LMG含量是MG的3.6倍,肝臟中的LMG含量是孔雀石綠的44.5倍。譚志軍[26]等在海水養殖中用1.0 mg/L的MG連續浸泡花鱸6次,1次/d,2 h/次,結果表明,LMG在各組織中的含量高于MG的含量。這說明經不同藥浴濃度和藥浴時間,MG在鱸魚的組織中能快速轉化為LMG的能力的差異不顯著。楊賢慶[12]等用2 mg/L的MG浸泡1 h大規格的淡水羅非魚,在0 h時,LMG在肌肉中的含量低于MG,其他組織中的LMG在肌肉中的含量低于MG含量的2倍。李愛心[10]等用0.3 mg/L的MG藥浴1 h草魚,在1～12 h時,LMG在肌肉、血液中的含量低于MG。邱緒建[7]等用0.2 mg/L的MG藥浴1 h鯽魚,在1～12 h時,LMG在肌肉、血液中的含量低于MG。劉永濤[4]等用7 mg/L的MG藥浴5 min斑點叉尾鮰,在0.25 h時,LMG在血液中的含量低于MG,在0.25 h時,LMG在肌肉、皮膚中的含量低于MG的含量的2倍。劉書貴[20]等用1 mg/L的MG藥浴1 min鱖魚,在0 h時,LMG在肌肉、血液中的含量低于MG。萬譯文[19]等用5 mg/L的MG藥浴2 h鱖魚,在0.5 h,LMG在鰓中的含量低于MG,LMG在腹肌、皮膚中的含量低于MG的含量的2倍,LMG在背肌中的含量低于MG的含量的9倍。曲志娜[8]等用0.8 mg/L的MG藥浴1 h大菱鲆,在0 h時,LMG在肌肉中的含量低于MG的含量的4倍。陳培基[16]等用0.2 mg/L的MG藥浴2 h和0.40 mg/L的MG藥浴2.5 h南美白對蝦,在0 h時,LMG在蝦肉中的含量低于MG的含量的4倍。黃金田[13]等用2 mg/L的MG藥浴1 h中華絨螯蟹,在0 d時,LMG在蟹肉中的含量低于MG的含量的2倍。這可以說明,在已報道過的MG在水產品的消除過程中,MG在鱸魚的組織中轉化為LMG的能力是最強的。

表4 0.15 mg/L孔雀石綠藥浴鱸魚1 h后MG、LMG在各組織中的濃度Table 4 The concentration of MG and LMG in organizations of perch dipped in 0.15 mg/L MG for 1 h

注:ND代表低于檢測限。

鹽度也對水產的藥物代謝動力學有影響。通過比較花鱸在淡水養殖中MG的代謝規律與譚志軍[26]等在海水養殖中MG的代謝規律發現:MG、LMG在淡水鱸魚的肝臟、背肌的消除速率大部分慢于海水花鱸。Ishida[27]在對淡水虹鱒和海水虹鱒口服惡喹酸的實驗得出,24 h后惡喹酸在淡水虹鱒組織中的代謝速度慢于海水虹鱒。這兩者基本相似。

3 結論

采用超高效液相色譜串聯質譜法快速檢測MG、LMG在花鱸的背肌、魚皮、肝臟的含量,并用內標法來進行定量。結果表明,在消除期間,LMG的濃度始終高于MG。MG、LMG在肝臟中的濃度最高。MG在肝臟、魚皮、背肌中達到最高濃度的時間分別為8、0、1 h。MG在背肌、魚皮、肝臟中分別于168、960、2160 h時檢測不到。MG在3種組織中的半衰期的先后順序為肝臟=魚皮>背肌。LMG在花鱸3種組織中的濃度由高到低的順序為:肝臟>背肌>魚皮。LMG在肝臟、魚皮、背肌中達到最高濃度的時間分別為1、8、0 h。LMG在3種組織中的半衰期長短的先后順序為背肌=魚皮>肝臟。消除2544 h后,背肌、魚皮、肝臟中的LMG含量仍然高于檢測限。從實驗結果發現,取樣的時間最好包括0、1、8 h;重點檢測的部位為魚肉、魚皮。

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Tissue distribution and elimination of malachite green and leucomalachite green in perch(Lateolabraxmaculatus)

DING Jun-wei1,2,DENG Jian-chao1,YANG Xian-qing1，*,LI Lai-hao1,ZHAO Qing-zhi1,2,WU Yan-yan1,CHEN Sheng-jun1,LI Chun-sheng1

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Lab of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510300,China;2.Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

The distribution and depletion rules of MG and its metabolite LMG in organizations of perch were investigated,that were dipped in the concentration of 0.15 mg/mL MG for 1 h,and that reared in tanks containing(0)indoor. Skin,back muscle and liver of perch were analyzed by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry carrying out qualitative and quantitative analysis of target analytes. The concentration of LMG was much higher than that of MG during the experiment. The concentration of MG and LMG in liver was highest. The result of MG concentrations in back muscle,skin,liver of perch showed that the order of 3 kinds of tissues concentration levels of MG from high to low were respectively liver(94.86±8.12) μg/kg,skin(19.35±1.88) μg/kg,back muscle(7.47±0.45) μg/kg. MG was not detected in back muscle,skin,liver of perch at 168 h,960 h,2160 h. The order of 3 kinds of tissues half-time of MG from long to short were respectively liver(7.22 d),skin(7.22 d),back muscle(1.44 d). The order of 3 kinds of tissues concentration levels of LMG from high to low were respectively liver(3607.13±189.56) μg/kg,back muscle(103.65±14.97) μg/kg,skin(82.10±7.64) μg/kg. The order of 3 kinds of tissues half-time of LMG from short to long were respectively liver(14.44 d),skin(28.88 d),back muscle(28.88 d). Even after 2544 h of elimination,LMG in back muscle,skin,liver even could be detected.

residues;malachite green;leucomalachite green;perch;tissue distribution

2016-08-09

丁軍偉(1986-)，男，碩士研究生，研究方向：水產品加工與質量安全，E-mail:ShouDingJW@163.com。

*通訊作者:楊賢慶(1963-)，男，本科，研究員，研究方向：水產品加工與質量安全，E-mail：yxqgd@163.com。

國家科技支撐項目(2015BAD17B03-1，2015BAK36B06)；國家農產品質量安全風險評估項目(GJFP201501201)；廣東省海洋漁業科技與產業發展專項(A201501C02)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(2015YD02)。

TS254.4

A

:1002-0306(2017)04-0132-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.017