內(nèi)蒙古不同種源山杏杏仁中苦杏仁苷含量差異分析

段國(guó)珍,白淑蘭,葉冬梅,林 濤,薛海峰,平貴臣,白玉娥，*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

內(nèi)蒙古不同種源山杏杏仁中苦杏仁苷含量差異分析

段國(guó)珍1,白淑蘭1,葉冬梅1,林 濤1,薛海峰1,平貴臣2,白玉娥1，*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

采用高效液相色譜法(HPLC),對(duì)內(nèi)蒙古7個(gè)種源山杏杏仁中苦杏仁苷的含量進(jìn)行差異性分析。結(jié)果表明:不同種源山杏杏仁中苦杏仁苷的含量存在顯著差異(p<0.05);7個(gè)種源苦杏仁苷平均含量為5.43%,平均含量范圍為4.34%～6.25%;平均變異系數(shù)為0.07,扎魯特旗種源的變異系數(shù)較其它種源大;苦杏仁苷含量與經(jīng)緯度呈極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.806、0.722,與海拔呈極顯著正相關(guān)(0.896);聚類(lèi)分析將7個(gè)種源劃分為2類(lèi)。該研究結(jié)果為內(nèi)蒙古地區(qū)山杏的深加工以及利用提供理論依據(jù)。

內(nèi)蒙古,種源,杏仁,苦杏仁苷,差異分析

山杏(PrunusarmeniacaL varansuMaxim),為薔薇科(Rosaceae)植物,是一種重要生態(tài)經(jīng)濟(jì)型樹(shù)種,主要分布于我國(guó)東北三省、晉冀魯以及內(nèi)蒙古等省市自治區(qū)[1]。山杏干燥的成熟種子通常稱(chēng)為杏仁[2]。杏仁除了正常食用外,還有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用功效,常見(jiàn)的杏仁中約含有49.6%脂肪與27.0%的蛋白質(zhì)[3],以及約為2%～4.4%[4-7]的苦杏仁苷。其中苦杏仁苷是生氰苷的一種,廣泛存在于山杏、桃、李子、蘋(píng)果、山楂等植物種子中[8]。

目前苦杏仁苷已成為醫(yī)藥上常用的祛痰止咳劑、輔助性抗癌藥物[9],并具有明確的生理、藥理活性,如止咳平喘[10]、抗?jié)僛11]、調(diào)節(jié)免疫[12]、抗炎[13]等作用。苦杏仁苷的提取主要有水提法和乙醇提取法,但通常采用乙醇回流提取,提取率較高,提取雜質(zhì)較少[14]。苦杏仁苷的檢測(cè)方法種類(lèi)較多,如高效液相色譜法(HPLC)、薄層掃描法、紫外分光光度法、銀量法、毛細(xì)管電泳色譜法等[15],其中HPLC法分離效率高,分析速度快,結(jié)果較準(zhǔn)確,現(xiàn)已成為有機(jī)物定性定量分析研究的主要方法[16]。

內(nèi)蒙古是我國(guó)北方山杏天然林的主要分布區(qū),該地區(qū)地域遼闊,生態(tài)環(huán)境多樣,山杏種質(zhì)資源豐富[17],杏仁中苦杏仁苷的含量也高于其他地方[9],但目前對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)山杏的研究大多為豐產(chǎn)、造林、優(yōu)良單株的選擇等,對(duì)杏仁的開(kāi)發(fā)利用多停留在大眾型小食品的開(kāi)發(fā)上,精加工產(chǎn)品甚少,而苦杏仁苷的開(kāi)發(fā)作為精加工的一個(gè)重要部分,具有很好的前景[18]。本文采用HPLC法[19]對(duì)內(nèi)蒙古7個(gè)種源山杏杏仁中苦杏仁苷含量進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)其進(jìn)行差異性分析,篩選山杏杏仁中苦杏仁苷含量較高的種源,并初步分析造成苦杏仁苷含量差異的原因,該研究可為內(nèi)蒙古山杏仁的產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)以及實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山杏果實(shí) 樣品于2015年7月采自?xún)?nèi)蒙古地區(qū)7個(gè)種源,每個(gè)種源選取5個(gè)群體,群體間距離不小于5 km2,每個(gè)群體隨機(jī)采摘10株山杏并利用GPS定點(diǎn),共采摘350株山杏單株,每株隨機(jī)采摘500 g果實(shí),去掉果肉編號(hào)將杏核帶回實(shí)驗(yàn)室,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?內(nèi)蒙古7個(gè)山杏種源生態(tài)環(huán)境因子見(jiàn)表1;苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):MUST-14092808) 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所;石油醚(沸程60～90 ℃) 分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;無(wú)水乙醇 分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲醇(色譜純) 天津康巢生物醫(yī)藥有限公司;水 為超純水。

日立L-7420高效液相色譜儀 日立(中國(guó))有限公司;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠(chǎng);UV-2800紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;DHG-9140A鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;0.45 μm系微孔濾膜 上海密粒膜分離有限公司;CP124S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

表1 內(nèi)蒙古7個(gè)山杏種源生態(tài)環(huán)境因子Table 1 Ecological environment factors of 7 Apricot provenances

1.2 苦杏仁苷的提取與測(cè)定

1.2.1 苦杏仁苷的提取 每株山杏隨機(jī)選擇50顆杏核敲開(kāi)取出杏仁,將杏仁用清水浸泡2 h,除雜,去皮,置于鼓風(fēng)干燥箱中,80 ℃烘干2 h,滅酶,研磨過(guò)20目篩[20]。稱(chēng)取杏仁粉末2 g,置于30 mL石油醚中浸泡24 h,進(jìn)行脫脂處理,將處理后的杏仁粉用100 mL 85%的乙醇于80 ℃下超聲(40 kHz)40 min,用0.45 μm的微濾膜過(guò)濾,濾液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 苦杏仁苷的測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱:E2414267(250 mm×4.6 mm,依利特SinoChrom ODS-BP反相鍵合色譜柱);流動(dòng)相:甲醇∶水=20∶80(v/v);流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm(紫外分光光度計(jì)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液在210 nm處峰值最高);進(jìn)樣量:20 μL。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取40 mg苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品移入10 mL容量瓶,超純水溶解定容,得到的4 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋配成濃度0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,保存?zhèn)溆谩⒉煌瑵舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)溶液與處理好的樣品溶液分別依次進(jìn)樣三次,記錄峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

所有的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及計(jì)算均使用Microsoft Excel 2013軟件,使用IBM SPSS Statistics 19.0 進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析,使用軟件Origin Pro 8繪制高效液相色譜圖,使用軟件CANOCO 4.5進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis,RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

按照1.2.2所述色譜條件將不同濃度對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定,將所得峰面積和濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析,回歸方程為y=1×107x-15836(R2=0.9987),式中x為濃度,y為峰面積,苦杏仁苷濃度在0.4～2.0 mg/mL范圍內(nèi),濃度與峰面積呈線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 不同種源山杏杏仁中苦杏仁苷含量

2.2.1 不同種源山杏杏仁中苦杏仁苷HPLC色譜圖 各樣品所得峰面積取平均值,根據(jù)回歸方程計(jì)算濃度,通過(guò)HPLC所測(cè)苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)樣品以及7個(gè)種源山杏杏仁苦杏仁苷含量的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1～圖8。

圖1 苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)樣品HPLC色譜圖Fig.1 The dimensional chromatogram of amygdalin standard samples

圖2 土默特左旗種源苦杏仁苷HPLC色譜圖Fig.2 The dimensional chromatogram in Tumotezuoqi

圖3 克什克騰旗種源苦杏仁苷HPLC色譜圖Fig.3 The dimensional chromatogram in Keshenketengqi

圖4 涼城縣種源苦杏仁苷HPLC色譜圖Fig.4 The dimensional chromatogram in Liangcheng

圖5 敖漢種源苦杏仁苷HPLC色譜圖Fig.5 The dimensional chromatogram in AoHan

圖6 阿魯科爾沁旗種源苦杏仁苷HPLC色譜圖Fig.6 The dimensional chromatogram in Alukeerqinqi

圖7 科左后旗種源苦杏仁苷HPLC色譜圖Fig.7 The dimensional chromatogram in Kezuohouqi

圖8 扎魯特旗種源苦杏仁苷HPLC色譜圖Fig.8 The dimensional chromatogram in Zhaluteqi

2.2.2 苦杏仁苷含量的方差分析及變異分析 表2為7個(gè)種源共35個(gè)群體山杏杏仁中在高效液相色譜下所測(cè)含量,由表2可知,每個(gè)種源內(nèi)山杏杏仁苦杏仁苷的含量較穩(wěn)定,無(wú)特異群體。

表2 不同種源5個(gè)群體山杏杏仁中苦杏仁苷含量Table 2 The amygdalin content of almond in 5 populations from different provenances

對(duì)內(nèi)蒙古7個(gè)種源山杏杏仁中苦杏仁苷含量進(jìn)行比較,由表3可知,在0.05的顯著水平下內(nèi)蒙古7個(gè)種源山杏杏仁中苦杏仁苷的含量在種源間存在顯著差異。

表3 內(nèi)蒙古不同種源杏仁苦杏仁苷含量方差分析Table 3 Variance analysis of almond amygdalin content among provenance in Inner Mongolia

注:*代表在顯著性水平為0.05上差異顯著。

對(duì)7個(gè)種源山杏杏仁中苦杏仁苷的含量進(jìn)行多重比較以及變異分析,由表4可知,內(nèi)蒙古7個(gè)種源山杏杏仁中苦杏仁苷含量存在顯著差異,平均含量為5.43%,范圍為4.34%～6.25%;其中,土默特左旗種源杏仁中苦杏仁苷含量最大,為6.25%,扎魯特旗種源苦杏仁苷含量最小,僅為4.34%,這與葛任新(5.19%)、董海榮[21](5.667%)所測(cè)結(jié)果相似。7個(gè)種源的種源間變異系數(shù)為0.07。扎魯特旗種源杏仁中苦杏仁苷含量的變異系數(shù)最大為0.12,說(shuō)明扎魯特旗種源杏仁苦杏仁苷含量相較其它種源不穩(wěn)定。苷作為不同植物的一種重要次生代謝物,影響含量因素較多,造成不同種源間苦杏仁苷含量存在差異的原因也有許多,Stoewsand猜測(cè)果核中氰化物含量可能受到品種和土壤含水量等因子的影響[22],即苦杏仁苷含量的差異可能是遺傳與環(huán)境共同作用所造成的,Woodrow[23]等對(duì)兩種土壤水分含量差異極大地區(qū)的桉樹(shù)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明水分脅迫間接影響到了苷含量的多少,但主要影響因子還是物種差異。內(nèi)蒙古地域遼闊,環(huán)境復(fù)雜,本項(xiàng)研究所選7個(gè)種源地分布地理跨度較大,環(huán)境條件多樣,山杏為了適應(yīng)其長(zhǎng)期生長(zhǎng)的復(fù)雜環(huán)境條件而形成特有的基因類(lèi)型,種質(zhì)的差異可能是造成不同種源苦杏仁中苦杏仁苷含量差異的主要因子。

表4 苦杏仁苷含量比較Table 4 Comparison of the amygdalin content

注:小寫(xiě)字母為同一列Duncan grounping表示值,不同字母表示相互間差異顯著,p<0.05。

2.3 苦杏仁苷含量與環(huán)境因子的相關(guān)分析

圖9表示苦杏仁苷含量與環(huán)境因子的RDA分析,分析結(jié)果顯示,苦杏仁苷含量與海拔、經(jīng)度、緯度、7月平均氣溫具有顯著相關(guān)性(p<0.05),其中,苦杏仁苷含量與海拔呈顯著正相關(guān)(r=0.896),與經(jīng)度、緯度、7月平均氣溫(r=0.806、0.722、0.673)呈顯著負(fù)相關(guān);苦杏仁苷含量與無(wú)霜期、年平均溫度、1月平均溫度以及年均降水量無(wú)明顯相關(guān)。苦杏仁苷屬于次生代謝產(chǎn)物,蘇文華等[24]報(bào)道環(huán)境與次生代謝產(chǎn)物存在一定的關(guān)系,隨著環(huán)境條件的惡化,植株生長(zhǎng)狀況減弱,次生代謝產(chǎn)物增加,但當(dāng)環(huán)境嚴(yán)重惡化時(shí),生長(zhǎng)和次生代謝受阻,代謝產(chǎn)物降低。如文中土默特左旗種源山杏杏仁中苦杏仁苷含量最高,可能因?yàn)橥聊刈笃旌０屋^高,日照強(qiáng)而長(zhǎng),晝夜溫差較大,土層較薄,環(huán)境相比其他種源惡劣,不利植物良好生長(zhǎng),次生代謝產(chǎn)物數(shù)量增加,進(jìn)而苦杏仁苷含量要高于其它種源。

圖9 苦杏仁苷含量與環(huán)境因子的相關(guān)分析Fig.9 The correlation analysis of the amygdalin content and the environment factors

2.4 聚類(lèi)分析

將7個(gè)種源根據(jù)苦杏仁苷含量進(jìn)行組間聯(lián)接聚類(lèi),在平方Euclidean距離M=10的時(shí)候,可將7個(gè)種源劃分為2類(lèi),第一類(lèi)包括4個(gè)種源,該類(lèi)山杏杏仁中的苦杏仁苷含量較高,地形多為山地,海拔較高;第二類(lèi)包括3個(gè)種源,該類(lèi)杏仁中的苦杏仁苷含量較低,屬于內(nèi)蒙古東部地區(qū),海拔較低,多為沙地。

圖10 苦杏仁苷含量聚類(lèi)分析Fig.10 The cluster analysis of the amygdalin content

3 結(jié)論

分析測(cè)定了內(nèi)蒙古7個(gè)種源苦杏仁中苦杏仁苷的含量,7個(gè)種源間苦杏仁苷含量差異顯著,含量范圍為4.34%～6.25%,土默特左旗種源山杏杏仁苦杏仁苷含量最高為6.25%;苦杏仁苷含量與海拔、經(jīng)度、緯度以及7月平均溫度有顯著相關(guān),即在內(nèi)蒙古地區(qū)由西向東、地勢(shì)逐漸降低,苦杏仁苷含量減少;聚類(lèi)分析將7個(gè)種源分為兩類(lèi),第一類(lèi)包括4個(gè)種源,分別為涼城縣、克什克騰旗、土默特左旗與敖漢旗,該類(lèi)海拔較高,在內(nèi)蒙古中西部,杏仁中苦杏仁苷含量較高;第二類(lèi)包括3個(gè)種源,分別為扎魯特旗、科左后旗、阿魯科爾沁旗,該類(lèi)杏仁中苦杏仁苷含量較低,屬于內(nèi)蒙古東部地區(qū),海拔較低。不同種源山杏杏仁中苦杏仁苷含量的差異是遺傳與環(huán)境共同作用所造成,所以深入研究遺傳與環(huán)境對(duì)苦杏仁苷含量的作用機(jī)制是非常有價(jià)值的,可為內(nèi)蒙古山杏杏仁的充分利用提供實(shí)踐基礎(chǔ)。

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Analysis on differences of the bitter almond amygdalin content between different provenances in Inner Mongolia

DUAN Guo-zhen1,BAI Shu-lan1,YE Dong-mei1,LIN Tao1,XUE Hai-feng1,PING Gui-chen2,BAI Yu-e1,*

(1.Forestry College of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010019,China;2.College of Science Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010019,China)

The amygdalin content in almond from seven provenances in Inner Mongolia were analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC).The results showed that the amygdalin content of bitter almond from different provenances had significant differences(p<0.05). The average amygdalin content among provenances was 5.43%,content range for 4.34%～6.25%. The average coefficient of variation was 0.07. Jarud Banner had the higher coefficient of variation than other sources. Amygdalin content had significantly negative correlation with latitude and longitude(0.806，0.722),and significantly positive correlation with altitude(0.896). Cluster analysis divided seven provenances into 2 classes,clustering results were consistent with the correlation results. The results of the study provide a theoretical basis for the deep processing and medicinal value of apricot in Inner Mongolia.

Inner Mongolia;provenance;almond;amygdalin;analysis on differences

2016-08-09

段國(guó)珍(1990-)，女，博士研究生，研究方向：林木生物技術(shù)，E-mail：18848110959@163.com。

*通訊作者:白玉娥(1968-)，女，博士，教授，研究方向：林木生物技術(shù)，E-mail：bye666@163.com。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃(2013BAD14B02)；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(NDPYTD2013-7)；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(201502053)。

TS255.6

A

:1002-0306(2017)04-0111-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.013