不同溶劑提取葡萄酒中白藜蘆醇及其糖苷異構體

王 宓,趙 然,劉 琳,任曉宇,鎖 然

(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071001)

不同溶劑提取葡萄酒中白藜蘆醇及其糖苷異構體

王 宓,趙 然,劉 琳,任曉宇,鎖 然

(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071001)

利用白藜蘆醇及其糖苷異構體幾乎不溶于水,易溶于有機溶劑的性質,比較了乙酸乙酯、氯仿、乙醚,乙酸乙酯與正己烷、二氯甲烷混合溶液及雙水相體系對葡萄酒中白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取效果,得到了最佳的提取溶劑。結果表明:乙酸乙酯對目標化合物的提取效果優于其他有機溶劑,對白藜蘆醇苷的提取率可達90%以上,對白藜蘆醇的提取率低于80%。乙酸乙酯萃取操作簡單、提取率較高,切實可行。

白藜蘆醇,白藜蘆醇苷,提取,雙水相體系

白藜蘆醇是多酚類化合物,主要來源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物[1]。白藜蘆醇是一種生物性很強的天然多酚類物質,又稱為芪三酚,化學名為3,4′,5-三羥基芪,有順式和反式兩種類型,是腫瘤的化學預防劑,也是降低血小板聚集,預防和治療動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學預防劑[2-3]。目前國際上對白藜蘆醇的研究開發十分廣泛,富含白藜蘆醇的保健品、藥品和酒類的相關產品很多,白藜蘆醇的生物活性[4-5]在全球范圍內已經得到基本的認可。天然植物中的白藜蘆醇含量極低,一般不會高于0.5%,且反式白藜蘆醇比順式白藜蘆醇在穩定性上和生理活性上都要更好[6-7],因此研究白藜蘆醇的提取工藝具有著重要的意義。

目前,白藜蘆醇的檢測還沒有一個完整的標準,對白藜蘆醇的提取方法也各式各樣[8],張建超[9]等人用加熱回流法研究了虎杖中白藜蘆醇苷的提取分離工藝,其中水提工藝的最優條件為:10倍水量,回流提取三次,2 h/次;曾靜亞[10]等人研究了快速溶劑萃取提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷工藝的響應面優化,分析出最佳組合條件為:乙醇濃度51%,提取溫度96 ℃、提取時間16 min。

本文采取了溶劑提取法,比較了幾種不同有機溶劑和新型雙水相體系對葡萄酒中白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取效果,對提高白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

反式-白藜蘆醇苷純品(>98%)、反式-白藜蘆醇純品(>98%) 冠宇生物科技有限公司;甲醇、正己烷、硫酸銨、無水乙醇、正丙醇 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、氯化鈉 分析純,天津市進豐化工有限公司;碳酸鈉 分析純,天津市福晨化學試劑廠;磷酸氫二鉀 分析純,天津市光復科技發展有限公司;乙腈 色譜純,進口Burdick & Jackson高純試劑;葡萄酒 當地超市購買。

高效液相色譜儀,配2998DAD檢測器 美國Waters公司;色譜柱 BDS HYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);電子分析天平 美國sartorius公司;溶劑過濾器(1000 mL) 天津津藤實驗設備有限公司;SH2-111真空泵 上海知信實驗儀器技術有限公司;PHS-3C型pH計 奧豪斯儀器有限公司;旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 白藜蘆醇類化合物提取方法 用移液管取10 mL酒樣(加一定量的順式、反式-白藜蘆醇及順式、反式-白藜蘆醇苷標準混合液)于錐形瓶中,分別加入10 mL乙酸乙酯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯∶正己烷(50∶50、10∶90、90∶10)和乙酸乙酯∶二氯甲烷(50∶50、10∶90、90∶10),超聲提取25 min,功率90 Hz混勻[11-12],靜置20 min,用分液漏斗分層,取上層液后分別加入上述有機溶劑10 mL,重復一次,氮氣吹干,2 mL甲醇回溶,過有機膜,進液相分析,重復3次取平均值。

1.2.2 乙酸乙酯萃取方法 取兩份15 mL葡萄酒樣品于分液漏斗中,其中一份加2.0 g氯化鈉溶解,均加入20 mL的乙酸乙酯充分振蕩,靜置分層,分離出有機相過無水硫酸鈉,重復一次,50 ℃水浴真空蒸發至近干,加2.0 mL無水乙醇回溶,過有機膜,進液相分析,測定不同有機溶劑對目標化合物的提取率,比較在葡萄酒中加氯化鈉和不加氯化鈉的提取結果,計算兩種條件下對目標化合物的提取率。通過峰面積比較兩種方法對葡萄酒中順,反白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取結果,重復3次取平均值。

1.2.3 雙水相體系的選擇 取30 mL的水溶液于錐形瓶中,分別加入15 g氯化鈉、碳酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀,均分為三等份,分別加入10 mL甲醇、乙醇和正丙醇,振蕩混合,靜置,上層為有機相,下層為水相,重復3次取平均值。

分相效果由R=V上/(V上+V下)判定,當R的值和R0=V上0/(V上0+V下0)的值越接近時,其分相效果越好。其中V上0和V下0分別為分相前有機溶劑的體積和蒸餾水的體積,V上和V下分別為分相后上下相的體積。

1.2.4 乙酸乙酯和雙水相萃取結果對比

1.2.4.1 乙酸乙酯萃取 用移液管取10 mL酒樣(加一定量的順,反白藜蘆醇及苷標準混合液)于錐形瓶中,加2.0 g氯化鈉使其溶解,加10 mL乙酸乙酯,超聲提取25 min,靜置分層,取有機層。重復一次,旋蒸蒸干,2 mol甲醇和4 mol水回溶,過有機膜,進液相分析,重復3次取平均值。

1.2.4.2 雙水相體系萃取 取20 mL水,加7.0 g(NH4)2SO4振蕩溶解,加20 mL無水乙醇,使之分層,制成雙水相體系[13]。取10 mL酒樣,加20 mL雙水相體系,超聲提取25 min混勻,靜置,收集有機層。重復一次,合并上層液,旋轉蒸發至近干,用2 mL甲醇和4 mL水回溶,過有機膜,進HPLC分析,重復3次取平均值。

用乙酸乙酯和雙水相體系萃取葡萄酒中的白藜蘆醇及其糖苷異構體,比較兩種方法對目標化合物的提取效果。

1.2.5 HPLC條件 色譜柱:BDS HYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),進樣量5 μL,流量1.0 mL/min,檢測波長:300 nm,柱溫:35 ℃,流動相:A為10%的乙腈,B為純乙腈,梯度洗脫程序:0-20-25-30 min,0%B-20%B-55%B-0%B。

1.2.6 提取率的計算 公式如下：

R=(C×V)/M[12]

式中:R-白藜蘆醇提取率,mg/L;C-待測液中白藜蘆醇的濃度,mg/L;V-提取溶劑的體積,mL;M-樣品的體積,mL。

1.2.7 數據處理 采用Orgin 8.0進行數據的處理與分析。

2 結果與討論

2.1 不同有機溶劑提取比較

用不同的有機溶劑提取白藜蘆醇類化合物,計算不同有機溶劑對目標化合物的提取率,結果見圖1～圖4。

2.1.1 不同有機溶劑提取反式-白藜蘆醇及其糖苷異構體比較 葡萄酒中的反式白藜蘆醇及其糖苷異構體用不同溶劑進行處理,得到的含量各不相同,圖1為不同有機溶劑對反式-白藜蘆醇苷的提取率比較,圖2為不同有機溶劑對反式-白藜蘆醇的提取率比較。

圖1 不同有機溶劑對反式-白藜蘆醇苷的提取率Fig.1 Different organic solvents on the trans-piceid’s extraction rate

圖2 不同有機溶劑對反式-白藜蘆醇的提取率Fig.2 Different organic solvents on the trans-resveratrol’s extraction rate

表1 氯化鈉對白藜蘆醇及其糖苷異構體提取效果的影響Table 1 The effect of sodium chloride on the extraction of resveratrol and its glycosides

由圖1、圖2可知,不同有機溶劑對反式-白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取率不同。乙酸乙酯、乙酸乙酯∶正己烷(90∶10)較之其他有機溶劑對反式-白藜蘆醇及其糖苷異構體提取率最好,其中乙酸乙酯的提取效果最好,提取率可達3.60 mg/L和7.32 mg/L,而乙酸乙酯∶正己烷(10∶90)對反式-白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取率最低,僅有0.38 mg/L和0.37 mg/L。由此可見,乙酸乙酯的含量對提取葡萄酒中反式-白藜蘆醇及其糖苷異構體的影響很大。

2.1.2 不同有機溶劑提取順式-白藜蘆醇及其糖苷異構體比較 圖3為不同溶劑對順式-白藜蘆醇苷的提取率比較,圖4為不同有機溶劑對順式-白藜蘆醇的提取率比較。

表3 乙酸乙酯和雙水相體系提取白藜蘆醇及其糖苷的提取率比較(%)Table 3 The comparison of extraction rate of resveratrol and its glycosides from ethyl acetate and aqueous two phase systems(%)

圖3 不同有機溶劑對順式-白藜蘆醇苷的提取率Fig.3 Different organic solvents on the cis-piceid’s extraction rate

圖4 不同有機溶劑對順式-白藜蘆醇的提取率Fig.4 Different organic solvents of the cis-resveratrol’s extraction rate

乙酸乙酯萃取葡萄酒中反式-白藜蘆醇苷和順式-白藜蘆醇苷的提取率可以達到90%以上,對反式-白藜蘆醇和順式-白藜蘆醇的提取率低于80%。雙水相體系對白藜蘆醇及其糖苷異構體四種目標化合物的萃取率低于47%。

3 結論

比較了不同有機溶劑和硫酸銨乙醇水溶液的雙水相體系對葡萄酒中白藜蘆醇及其糖苷異構體提取結果,結果表明,乙酸乙酯對白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取率較高,在乙酸乙酯中加入NaCl可減少白藜蘆醇及其糖苷異構體的損失。用乙酸乙酯提取白藜蘆醇操作簡單,結果穩定,誤差小,提取率高,具有實際的應用價值。

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由圖3、圖4可知,不同有機溶劑對目標化合物的提取效果不同,其中乙酸乙酯對順式白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取效果尤為突出,提取率可達11.71 mg/L和9.55 mg/L。乙酸乙酯比乙醚和氯仿提取白藜蘆醇及其糖苷異構體含量高的原因可能是由于乙醚和氯仿在大于20 ℃的室溫下揮發性較大,化學性質極不穩定,遇光即變質,因此其溶劑損失和對環境的污染比乙酸乙酯嚴重,而乙酸乙酯比乙酸乙酯和二氯甲烷或者正己烷混合液提取白藜蘆醇及其糖苷異構體含量高的原因可能是在本實驗條件下乙酸乙酯比混合液穩定。

2.2 氯化鈉對乙酸乙酯萃取結果的影響

表1為氯化鈉對乙酸乙酯萃取葡萄酒中順、反白藜蘆醇苷其糖苷異構體的效果影響比較(峰面積表示)。

由表1可知,不加NaCl與加NaCl相比,峰面積會有一定幅度的下降,因此不加NaCl會造成部分目標化合物的損失。其原因可能為飽和氯化鈉溶液極性比水大,有利于有機相和水相的分離,即鹽析,抑制形成乳化層,有利于萃取。有些物質在有機相和水相中的分配比不太大時,可通過加入無機鹽氯化鈉,減少化合物在水相中的溶解度,以此來提高對白藜蘆醇及其糖苷異構體的萃取率。

2.3 雙水相體系的選擇

表2為不同雙水相體系的分相效果。

表2 不同雙水相體系的R值比較Table 2 R value of different aqueous two phase system

由表2可知,在磷酸氫二鉀、硫酸銨存在條件下,甲醇、乙醇、正丙醇溶液的分相效果比較好,可歸結高價鹽的雙水相體系比低價鹽的分相效果比較好。考慮到葡萄酒中存在乙醇,且白藜蘆醇及其糖苷異構體易溶于乙醇,故選乙醇作為雙水相體系的有機相較好;考慮到在酸性條件下,白藜蘆醇以分子態存在,比較穩定;在堿性條件下,白藜蘆醇容易變性失活[14],故選擇硫酸銨對乙醇溶液作為雙水相體系。

2.4 乙酸乙酯和雙水相萃取結果對比

表3為兩種方法對葡萄酒中白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取率比較。

由表3可知,乙酸乙酯對于葡萄酒中的白藜蘆醇及其糖苷異構體的提取率遠高于雙水相體系,用

Different solvents extraction of resveratrol and its glycosides in wine

WANG Mi,ZHAO Ran,LIU Lin,REN Xiao-yu,SUO Ran

(College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

Resveratrol and its glycoside isomer are almost insoluble in water but easily soluble for a majority of organic solvent. Comparison of ethyl acetate,chloroform,ethyl ether,the mixed solution of ethyl acetate,hexane and dichloromethane and aqueous two-phase system of wine in resveratrol and piceid were compared. The results showed that the ethyl acetate was superior to the other solvents in the extraction of the target compounds,the extraction rate of resveratrol glucoside could reach more than 90% and the resveratrol extraction rate lower than 80%. Ethyl acetate extraction operation was simple,high extraction rate and feasible.

resveratrol;piceid;extract;ATPS

2016-04-29

王宓(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail:1124855075@qq.com。

TS262.6

A

:1002-0306(2017)04-0087-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.008