海產品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單增李斯特菌三重熒光定量PCR檢測方法的建立

李 濤,王 艷,張繼倫,*,王糧子,劉代新

(1.上海震旦學院公共衛生與護理學院,上海 201908;2.上海出入境檢驗檢疫局,上海 200135;3.江蘇同科醫藥科技有限公司,江蘇蘇州 215000)

海產品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單增李斯特菌三重熒光定量PCR檢測方法的建立

李 濤1,王 艷2,張繼倫2,*,王糧子2,劉代新3

(1.上海震旦學院公共衛生與護理學院,上海 201908;2.上海出入境檢驗檢疫局,上海 200135;3.江蘇同科醫藥科技有限公司,江蘇蘇州 215000)

目的:建立一種同時定量檢測霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌的三重PCR方法。方法:依據霍亂弧菌CTX遺傳單元中zot毒力基因;副溶血性弧菌TDH中tl基因;單增李斯特菌hly基因,設計特異性引物探針,建立和評價了檢測試劑盒性能。結果:霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌濃度在102～105cfu/mL標準曲線線性相關系數分別為0.9998、0.999、0.9963。三種致病菌105cfu/mL與103cfu/mL兩種檢測濃度對數值,批內變異系數分別為0.40%、0.83%、0.49%與0.75%、0.81%、0.64%;0.76%、1.03%、0.62%與1.06%、0.72%、1.26%;0.62%、0.51%、0.81%和1.38%、0.76%、2.34%;批間變異系數分別為0.58%與0.76%;0.83%與1.01%;0.66%與1.58%。檢測靈敏度分別為:23、16、35 cfu/mL。結論:本文所建立的檢測試劑盒適合于海產品等產品中三種致病菌的快速篩檢。

霍亂弧菌,副溶血性弧菌,單增李斯特菌,多重熒光定量PCR

霍亂弧菌(Vibriocholerae)、副溶血性弧菌(VibrioParahaemolyticus)、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,下文簡稱為單增李斯特菌)是公認具有高致病性的細菌,這些致病菌可能來源于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產品,多個國家均把這三種菌列入法定檢測項目[1-5]。

表2 霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單增李斯特菌特異性引物探針信息Table 2 The specific primers and probes of Vibrio cholera,Vibrio Parahaemolyticus and Listeria monocytogenes

三種致病菌經典和標準的檢測方法是:選擇性增菌,分離培養,生化鑒定,血清分型等,該方法受操作者經驗和培養基質量影響大,檢測所需時間長,無法滿足食品及原料快篩的要求。隨著分子生物學技術的快速發展,PCR技術已經廣泛應用于病毒和細菌致病基因檢測和溯源中。江迎鴻,段強德,蔣蔚等采用普通PCR方法[6-9],陳麗,李宏,胡興娟選擇實時熒光PCR[10-13]對霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單增李斯特菌進行單獨和不同組合檢測的研究,結果表明PCR技術與傳統培養方法比較具有快速、準確的特點,而多重熒光定量PCR技術能在同一PCR反應體系中實現對多種病原體的同步檢測,為食源性微生物檢定提供了高效、靈敏、特異、準確的方法。本研究基于熒光PCR技術,選用三重熒光標記,能夠實現三菌同時聯合檢測,另本研究選用特異毒力基因作為目標基因能夠實現特異毒力菌株的針對性篩檢,同時配有梯度標準品能夠實現檢驗結果的定量化,為實現海產品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌及單增李斯特菌的快速聯合檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗過程中使用的霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單增李斯特菌等13株標準菌株 均來自中國藥品生物制品檢定研究院,具體信息請見表1;蛋白胨、酵母浸提物 購自英國OXOID公司;Premix Ex Taq(Probe qPCR) 購自大連寶生生物工程有限公司;細菌DNA提取試劑盒(DP302)及海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324) 購自天根生化科技有限公司;其余試劑 為進口或國產分析純。

表1 標準菌株信息Table 1 Information of standard bacteria strains

ABI 7500型熒光定量PCR儀 購自美國 ABI 公司;高速冷凍離心機(SORVALL Stratos) 購自Thermo Scientific公司;SHP 250型生化培養箱、THZ-312型臺式恒溫振蕩培養器 購自上海精宏實驗設備有限公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺、BSC-1300IIB2型生物安全柜 購自上海博訊醫療生物儀器股份有限公司。

1.2 引物與探針

霍亂毒素(cholera toxin,CT)是霍亂弧菌主要致病因素,CTX遺傳單元中zot毒力基因相對保守,并廣泛存在于O1群流行株和O139群菌株中[14],選用zot基因作為霍亂弧菌的特異序列。選用副溶血性弧菌通用型特異性基因tl基因為特異靶基因。選用hly基因序列作為單增李斯特菌特異靶基因進行引物探針設計[15]。表2中特異性引物探針委托上海英俊生物技術有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA模板的制備 各取過夜培養的霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌菌液1 mL,選用天根生化科技有限公司細菌DNA提取試劑盒(DP302)提取基因組;實驗用海產品組織基因利用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324)進行提取,提取方法按照說明書進行。

1.3.2 三重熒光PCR反應體系 熒光PCR反應體系為50 μL,反應體系組成:Premix Ex Taq(2×),25 μL;引物Vp-F(10 μmol/L)1 μL;Vp-R(10 μmol/L)1 μL;VC-R(10 μmol/L)1 μL;VC-F(10 μmol/L)1 μL;Lm-F(10 μmol/L)1 μL;Lm-R(10 μmol/L)1 μL;探針Vp-P(10 μmol/L)0.5 μL;VC-P(10 μmol/L)0.5 μL;Lm-P(10 μmol/L)0.5 μL;ddH2O,12.5 μL,DNA probe,5 μL。反應程序為:95 ℃預變性10 min;進入循環,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,共反應45個循環。

1.3.3 標準品的制備 取在37 ℃過夜培養的副溶血性弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特菌培養液各1 mL,按照10倍梯度進行稀釋并平板活菌計數,每個濃度3個平行實驗,取平均值計算原液中的細菌濃度。

將經活菌計數的副溶血性弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特菌菌液,分別進行10倍梯度稀釋,選取102～105cfu/mL四個濃度梯度級別各1 mL菌液,分別利用1.3.1中的方法進行核酸提取。將提取后的副溶血性弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特菌DNA,依據同級別濃度梯度分別進行等體積混合得系列標準品A(105cfu/mL)、B(104cfu/mL)、C(103cfu/mL)、D(102cfu/mL)。

1.3.4 標準曲線的建立 以1.3.3制備的標準品為模板,在最佳條件下用熒光定量PCR儀同時擴增,反應結束后以Ct值為X軸,以起始模板對應的菌液濃度對數值為Y軸繪制標準曲線。

1.3.5 特異性實驗 表1中霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌作為目標菌,混合其余十個常見菌作為對照菌,菌液濃度約為103cfu/mL,加入菌液量100 μL。提取出DNA作為模版進行擴增檢測,判斷試劑盒的特異性。

1.3.6 精密度(重復性)實驗 分別選用兩個濃度梯度的霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌DNA,進行精密度評價(各10次重復),分別計算濃度對數值的批內變異系數和批間變異系數。

1.3.7 檢測下限實驗 將經逐級10倍梯度稀釋的菌液分別取1 mL按照1.3.1中的方法進行DNA提取,并進行20次熒光PCR檢測,以其中17次反應曲線典型S型且Ct值大于40的最低濃度確定為檢測下限。

1.3.8 人工模擬樣本檢測 將完成計數的霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌菌液混合后進行適當稀釋,使每種菌液濃度均達到107cfu/mL以上,并進行梯度稀釋,作107、106、105、104、103、102cfu/mL濃度梯度,將以上濃度菌液混合液1 mL分別加入到10 g不含以上三種菌的三文魚肉及青口貝肉中混合均勻,利用天根生物海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324)對以上模擬樣品進行基因組提取并測試。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

圖1 標準品中不同濃度霍亂弧菌擴增曲線Fig.1 The amplification curves of Vibrio cholerae with different concentration in standard substance

圖2 標準品中不同濃度副溶血性弧菌擴增曲線Fig.2 The amplification curves of Vibrio Parahaemolyticus with different concentration in standard substance

圖3 標準品中不同濃度單增李斯特菌擴增曲線Fig.3 The amplification curves of Listeria monocytogenes with different concentration in standard substance

圖4 霍亂弧菌標準曲線Fig.4 The standard curve of Vibrio cholerae

圖5 副溶血性弧菌標準曲線Fig.5 The standard curve of Vibrio Parahaemolyticus

圖6 單增李斯特菌標準曲線Fig.6 The standard curve of Listeria monocytogenes

以1.3.3制備的標準品為模版進行定量檢測,以循環數為X軸,以相對熒光強度為Y軸,獲得標準曲線(圖1～圖3)。反應結束后以Ct值為X軸,以起始模板濃度對數值為Y軸繪制標準曲線(圖4～圖6),所測得的霍亂弧菌標準曲線方程為:y=-0.2732x+10.746,相關系數R2為0.9998;副溶血性弧菌標準曲線方程為:y=-0.2738x+10.886,相關系數R2為0.999;單增李斯特菌標準曲線方程為:y=-0.2589x+10.242,相關系數R2為0.9963。將待測樣品擴增得到的Ct值(X值)代入公式,即得到待測樣本的濃度(cfu/mL)。

由圖1～圖6可知,構建的副溶血性弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特菌DNA三聯檢測標準品可以得到較好的擴增曲線和標準曲線,并且線性關系良好,可以實現準確定量。

表3 霍亂弧菌精密度實驗結果Table 3 The results of precision experiment of Vibrio cholera

注:霍亂弧菌105cfu/mL與103cfu/mL濃度對數值,批間變異系數分別為0.58%和0.76%。

2.2 特異性實驗

按照1.3.5特異性實驗的方法進行檢測,如圖7所示,經過多重熒光PCR檢測,在添加有標準菌株混合樣中,副溶血性弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特菌均出現明顯的擴增曲線,顯示為陽性。添加其它干擾菌均無明顯擴增,結果為陰性。實驗結果表明:本研究建立的多重熒光定量檢測方法對副溶血性弧菌、霍亂弧菌、單增李斯特菌有較好的特異性,與其他相關細菌無交叉反應。

圖7 多重熒光定量PCR檢測標準菌株特異性的擴增結果Fig.7 The amplification results of multiple real-time PCR method to detect standard bacteria strains

2.3 精密度實驗

按照1.3.6的實驗方法,按照1.3.2的試劑用量,采用3個批號試劑,每批不少于20次(依據下表3～表5,每批檢測數10×2個)檢驗量。結果如表3～表5所示。霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌分別選擇105cfu/mL及103cfu/mL兩種濃度進行實驗,結果標明,霍亂弧菌兩個濃度對數值的批內變異系數分別為0.40%、0.83%、0.49%與0.75%、0.81%、0.64%,批間變異系數為0.58%與0.76%;副溶血性弧菌兩個濃度對數值的批內變異系數分別為0.76%、1.03%、0.62%和1.06%、0.72%、1.26%,批間變異系數為0.83%和1.01%;單增李斯特菌兩個濃度對數值的批內變異系數分別為0.62%、0.51%、0.81%和1.38%、0.76%、2.34%,批間變異系數為0.66%和1.58%。變異系數均小于5%,說明該方法的重復性良好。

表4 副溶血性弧菌精密度實驗結果Table 4 The results of precision experiment of Vibrio Parahaemolyticus

注:副溶血性弧菌105cfu/mL與103cfu/mL濃度對數值,批間變異系數分別為0.83%和1.01%。

表5 單增李斯特菌精密度實驗結果Table 5 The results of precision experiment of Listeria monocytogenes

注:單增李斯特菌105cfu/mL與103cfu/mL濃度對數值,批間變異系數分別為0.66%和1.58%。

2.4 檢測下限實驗

按照1.3.7檢測限實驗的方法進行檢測,分別對霍亂弧菌2.3×103、2.3×102、2.3×101cfu/mL濃度進行檢測;對副溶血性弧菌1.6×103、1.6×102、1.6×101cfu/mL濃度進行檢測;對單增李斯特菌3.3×103、3.3×102、3.3×101cfu/mL濃度進行檢測。結果表明:霍亂弧菌檢測下限濃度為23 cfu/mL;副溶血性弧菌檢測下限濃度為16 cfu/mL;單增李斯特菌為33 cfu/mL，以上表明本研究建立的方法有較好的檢測靈敏度。

圖8 三文魚肉中不同濃度霍亂弧菌擴增曲線Fig.8 The amplification curves of Vibrio cholerae with different concentration in salmon meat

2.5 人工模擬樣本檢測結果

圖8～圖13結果表明:人工模擬樣本三文魚肉和青口貝肉中,霍亂弧菌、副溶血性弧菌及單增李斯特在230、160、330 cfu/g均能檢出,在此濃度以下均未檢出。本研究建立的方法在實際應用中,具有較好的靈敏度,能夠實現以上三菌的聯合檢驗。

圖9 青口貝肉中不同濃度霍亂弧菌擴增曲線Fig.9 The amplification curves of Vibrio cholerae with different concentration in mussel meat

圖10 三文魚肉中不同濃度副溶血性弧菌擴增曲線Fig.10 The amplification curves of Vibrio Parahaemolyticus with different concentration in salmon meat

圖11 青口貝肉中不同濃度副溶血性弧菌擴增曲線Fig.11 The amplification curves of Vibrio Parahaemolyticus with different concentration in mussel meat

圖12 三文魚肉中不同濃度單增李斯特菌擴增曲線Fig.12 The amplification curves of Listeria monocytogenes with different concentration in salmon meat

圖13 青口貝肉中不同濃度單增李斯特菌擴增曲線Fig.13 The amplification curves of Listeria monocytogenes with different concentration in mussel meat

3 結論

本研究建立了一種霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單增李斯特菌三菌聯檢的熒光定量PCR檢測方法。增菌培養8～16 h,DNA提取1.5 h,加樣和檢測約2.5 h,合計所需時間20 h以內,遠少于經典分離培養鑒定所需的一周時間。該方法具有特異性強、快速、高效、靈敏、可標準化的優點,實現了三種致病菌的同時檢測,檢出結果還包含公認致病基因信息,極大提高了檢測效率,較好滿足了食品及原料快速檢測的需要,該技術有望應用于食品及原料的快速篩檢。該方法與普通PCR法比較,檢測速度更快,數據更易保存分析,避免了普通PCR電泳過程氣溶膠污染,能有效降低假陽性,檢測結果更準確。熒光PCR檢測技術基于檢測目標菌特異片段,待檢樣中只要存在無論死活的目標菌,就會檢出,但因目前還無法提供定量、分型等信息,不能替代經典培養生化鑒定等標準方法,作為檢出致病菌確認依據。

[1]滕勇勇,王琪,吳雷,等. 致病性弧菌的生物學特性和致病因子研究進展[J]. 熱帶醫學雜志,2014,14(10):1396-1398.

[2]Liu D.Identification,subtyping and virulence determination ofListeriamonocytogenes,an omprotant food-borne pathogen[J]. Journal of Medical Microbiology,2006,55(6):645-659.

[3]Marija Z,Konrad J D,Wolfgang K.Practical relevance of methodologies for detecting and tracing ofListeriamonocytogenesin ready to eat foods and manufacture environments[J]. Food Science and Technology,2011,44(2):351-362.

[4]Chstterjee S,Ghosh K,Raychoudhuri A,et al. Phenotypic and genotypic traits and epidemiological implication ofVibrioCholeraeO1 and O139 strains in India during 2003[J].J Med Microbiol,2007,56(6):828-832.

[5]中華人民共和國衛生部疾病預防控制司. 霍亂防治手冊[M].第六版.北京:人民衛生出版社,2012.

[6]Jio R,Si H P,Yeon SY.Simultaneous detection of Listeria species isolated from meat processed food s using multiplex PCR[J].Food Control,2013,32(2):659-664.

[7]江迎鴻,譚貴良,陳亞波,等. 多重PCR方法檢測食品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單核細胞增生李斯特氏菌[J]. 廣東農業科學,2011(11):135-137.

[8]段強德,王錄軍,付宏岐，等.多重PCR快速檢測食品中單核細胞增生性李斯特菌檢測分析[J]. 山西農業科學,2015,61(3):38-40.

[9]蔣蔚,易力,陳永軍，等.水產品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和創傷弧菌多重PCR檢測方法的建立[J].中國動物傳染病學報,2016,24(1):44-51.

[10]陳麗,張紅河,曹海芬，等.熒光聚合酶鏈反應檢測副溶血弧菌TLH與TDH[J].檢驗醫學;2007,22(4):450-454

[11]Fykse E M,Nilsen T,Nielsen A D,et al.Real-time PCR and NASBA for rapid and sensitive detection ofvibriocholerain ballast water[J].Mar Pollut Bull,2012,64(2):200-206.

[12]李宏,楊大偉,劉云國,等. 多重熒光定量PCR同時檢測霍亂弧菌、副溶血性弧菌和創傷弧菌的方法研究[J]. 中國衛生檢驗雜志,2011,21(5):1180-1182.

[13]胡興娟,沈飚,余輝，等. 多重熒光定量PCR法檢測海產品中副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌[J].中國食品衛生雜志,2016,28(4):440-444.

[14]Edwards KA,March JC.GM(1)-Functionalized Liposomes in a Microtiter Plate Assay for Cholera Toxin inVibrioCholeraeCulture Samples[J]. Anal Biochem,2007,368(1):39-48.

[15]王環宇,李亞鵬,楊軍,等. 食品中單核細胞增生性李斯特氏菌PCR快速檢測方法[J]. 中國食品衛生雜志,2004,16:10-13.

Establishment of triple real-time PCR detection method forVibriocholera,VibrioParahaemolyticusandListeriamonocytogenesin marine food products

LI Tao1,WANG Yan2,ZHANG Ji-lun2,*,WANG Liang-zi2,LIU Dai-xin3

(1.College of Public Health and Nursing,Shanghai Aurora Vocational College,Shanghai 201908,China;2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200135,China;3.Jangsu Toneker Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.,Jangsu 215000,China)

Objective:In order to establish a effective method to detectVibriocholera,VibrioParahaemolyticusandListeriamonocytogenesby triple real-time PCR. Methods:Specific primers and probes were designed,which based on the zot toxin gene of CTX inVibriocholera,tlgene of TDH inVibrioParahaemolyticusandhlygene ofListeriamonocytogenes. What is more,the performance of the test kit was established and evaluated. Results:The correlation coefficients of standard curve linears forVibriocholera,VibrioParahaemolyticusandListeriamonocytogeneswere 0.9998,0.999 and 0.9963. The intra-assay coefficient variables of the three pathpgens at 105cfu/mL and 103cfu/mL concentration logarithm were 0.40%,0.83%,0.49% and 0.75%,0.81%,0.64%;0.76%,1.03%,0.62% and 1.06%,0.72%,1.26%;0.62%,0.51%,0.81% and 1.38%,0.76%,2.34%;inter-assay coefficient variables were 0.58% and 0.76%,0.83% and 1.01%,0.66% and 1.58%. The sensitivity indicated that the lowest accurate quantitative concentrations ofVibriocholerae,Vibrioparahaemolyticus,Listeriamonocytogeneswere 23,16,35 cfu/mL. Conclusion:A rapid detection method for testing the three pathogens of aquatic products was established.

Vibriocholerae;VibrioParahaemolyticus;Listeriamonocytogenes;multiplex real-time PCR

2016-09-19

李濤(1985-),女,碩士,講師,研究方向:食品病原菌檢測,E-mail:litao09@126.com。

*通訊作者:張繼倫(1964-),男,博士,主任技師,研究方向:病原菌檢測,E-mail:jilunzhang@126.com。

上海市科委技術標準課題(13DZ05022702);上海市晨光計劃(13CGB25)。

TS254.7

A

:1002-0306(2017)04-0081-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.007