分光光度法測(cè)定龜苓膏中總黃酮含量不確定度評(píng)定

莫啟進(jìn),卓梅芳,朱海軍

(1.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院,廣西梧州 543002;2.梧州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所,廣西梧州 543002)

分光光度法測(cè)定龜苓膏中總黃酮含量不確定度評(píng)定

莫啟進(jìn)1,卓梅芳1,朱海軍2

(1.梧州學(xué)院化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院,廣西梧州 543002;2.梧州市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所,廣西梧州 543002)

對(duì)分光光度法測(cè)定龜苓膏中總黃酮的含量進(jìn)行不確定度評(píng)定。依據(jù)CNAS-GL06《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》和JJF 1059-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的規(guī)定和實(shí)驗(yàn)方法,建立數(shù)學(xué)模型,對(duì)檢測(cè)過程中可能引入的不確定度因素包括標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品重復(fù)測(cè)定和儀器進(jìn)行分析和評(píng)定。結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引起的不確定度是不確定度的主要來源。

分光光度法,總黃酮,不確定度,龜苓膏

龜苓膏是以涼粉(淀粉、涼粉草提取液)、土茯苓(茯苓)、烏龜、蒲公英和金銀花為主要原料制作而成的一種嶺南傳統(tǒng)保健食品,主產(chǎn)于廣西梧州,具有清熱祛濕,旺血生肌,潤(rùn)腸通便,滋陰補(bǔ)腎等眾多藥用價(jià)值[1],深受兩廣、港澳臺(tái)及東南亞人民的青睞。龜苓膏含有豐富的黃酮類化合物[2],黃酮類化合物對(duì)人體具有緩解疲勞、降血脂降血糖、促進(jìn)毛細(xì)血管擴(kuò)張、抗菌消炎、抗癌、抗衰老、雌性激素樣作用等功效[3-6]。總黃酮作為龜苓膏主要的質(zhì)量控制指標(biāo),準(zhǔn)確測(cè)定其在龜苓膏中的含量,對(duì)保障龜苓膏的品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。蘆丁有典型的黃酮類結(jié)構(gòu),且廉價(jià)易購,較多文獻(xiàn)報(bào)道以蘆丁作為對(duì)照品用于測(cè)定涼粉草、土茯苓、蒲公英和金銀花中的總黃酮含量[7-11]。

不確定度是體現(xiàn)被測(cè)量值合理分散性,是與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù),是當(dāng)代誤差理論定量描述測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的重要指標(biāo)[12]。依據(jù)CNAS-GL06《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[12]和JJF 1059-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[13]的原理和方法,對(duì)采用分光光度法測(cè)定龜苓膏中總黃酮過程中不確定的來源進(jìn)行評(píng)定分析,以保證總黃酮含量測(cè)定方法的可靠性及測(cè)定結(jié)果的可信程度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原味梧州龜苓膏 廣西梧州雙錢實(shí)業(yè)有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑 均為分析純;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 批號(hào):100080-201408,含量測(cè)定用,純度為92.8%±0.5%,中國(guó)藥品生物制品檢定所;水 超純水。

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津;XA205DU 十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多;YP6002電子天平 常州衡正電子儀器有限公司;P300H超聲清洗器 德國(guó)Elmasonic;DZG-303A純水超純水系統(tǒng) 廣州品業(yè)儀器設(shè)備有限公司;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 相儀離心機(jī)儀器有限公司;所有用到的玻璃儀器 均為天波牌A級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)方法參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[14],對(duì)試樣中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取于120 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.49 mg,置于10 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液適量,超聲溶解,加60%乙醇至刻度,搖勻,精密量取5.0 mL置于25 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液至刻度線,搖勻,此為標(biāo)準(zhǔn)品母液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品母液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL置于25 mL容量瓶中,加入60%乙醇使容量瓶中溶液共10 mL,加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min,加10%硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min,加1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL,再加水至刻度線,搖勻,放置15 min,以相應(yīng)的試劑做空白,在510 nm下測(cè)定吸光度,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品前處理 取龜苓膏試樣適量攪拌成均勻的漿體,稱取試樣20.02 g(準(zhǔn)確至0.01 g)于燒杯中,用25 mL無水乙醇稀釋后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶,燒杯另用35 mL無水乙醇分多次清洗并轉(zhuǎn)移至該容量瓶中;超聲提取30 min,放冷,加水至刻度,搖勻,轉(zhuǎn)入離心試管,離心,取上清液作為供試品溶液。

1.2.3 樣品測(cè)定 精密量取1.2.2中的供試品溶液10.00 mL樣品溶液兩份,分別置于25 mL容量瓶中(處理步驟同1.2.1)。以空白溶液調(diào)零,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出樣品溶液中總黃酮的濃度。

1.3 龜苓膏樣品中總黃酮含量計(jì)算數(shù)學(xué)模型

龜苓膏樣品中總黃酮含量計(jì)算:

式中:X為試樣中總黃酮含量(mg/kg);Cx為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的被測(cè)液中總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);m為稱取的龜苓膏樣品質(zhì)量(g);V1為樣品提取液定容的總體積(mL);V2為從提取液V1中分取的體積(mL);V3為實(shí)驗(yàn)被測(cè)液最終定容的體積(mL)。

1.4 不確定度來源分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)學(xué)模型可知，影響總黃酮含量的不確定度的來源包括以下幾個(gè)方面:標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度Urel(1);樣品處理過程引入的不確定度Urel(2);標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度Urel(3);樣品重復(fù)測(cè)定引入的不確定度Urel(4);儀器引入的不確定度Urel(5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制引入的不確定度

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度包括標(biāo)準(zhǔn)品稱量、標(biāo)準(zhǔn)品純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制體積引入的不確定度。

2.1.2 蘆丁的純度引入的相對(duì)不確定度 蘆丁的純度為P(C27H30O16)=92.8%±0.5%,假設(shè)是矩形分布[12],相對(duì)不確定度為:

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制使用10 mL容量瓶、25 mL容量瓶、10 mL分度吸量管、5 mL單標(biāo)液移液管和10 mL單標(biāo)線移液管。由表1可得標(biāo)準(zhǔn)溶液配制體積引入的不確定為:

Urel(Vb)=[U(V1)2+U(V2)2+U(V4)2+U(V5)2+U(V6)2]1/2=[(8.94×10-4)2+(6.09×10-4)2+(2.07×10-3)2+(1.27×10-3)2+(8.94×10-4)2]1/2=2.80×10-3

2.1.4 合成標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)不確定度 計(jì)算式如下:

Urel(1)=[(7.70×10-3)2+(3.11×10-3)2+(2.80×10-3)2]1/2=8.76×10-3

2.2 樣品處理過程引入的不確定度

樣品處理過程引入的不確定度包括樣品稱量引入的不確定度;樣品溶液制備體積引入的不確定度;樣品經(jīng)產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移、離心等前處理引入的不確定度,可采用回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)其不確定度進(jìn)行評(píng)定。

表1 玻璃量具引入的不確定度Table 1 Uncertainties aroused from error in calibration of volumetric flask and pipettes

表3 龜苓膏中總黃酮測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of total flavonoids in guilinggao

2.2.2 樣品處理體積引入的不確定度 根據(jù)1.2.2和1.2.3對(duì)樣品進(jìn)行處理和測(cè)定。使用100 mL容量瓶,10 mL單標(biāo)線移液管,25 mL容量瓶,由表1中對(duì)應(yīng)玻璃器具引入的不確定度可得樣品處理體積引入的不確定度為:

Urel(Vy)=[U(V2)2+U(V3)2+U(V6)2]1/2=[(6.09×10-4)2+(5.47×10-4)2+(8.94×10-4)2]1/2=1.21×10-3

2.2.3 回收率實(shí)驗(yàn)引入的不確定度 稱取同一試樣6份,進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn),按照樣品測(cè)量過程進(jìn)行測(cè)定,6次回收率測(cè)定結(jié)果為100.69%、98.95%、99.86%、99.23%、97.25%、97.33%,平均值為98.89%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.37%。回收率實(shí)驗(yàn)相對(duì)不確定度為:

2.2.4 合成樣品處理及測(cè)定過程引入的不確定度為:

Urel(2)=[(2.88×10-4)2+(1.21×10-3)+(5.66×10-3)2]1/2=5.79×10-3。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程引入的相對(duì)不確定度

配制5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在510 nm波長(zhǎng)下,每個(gè)濃度測(cè)定3次吸光度,結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果Table 2 Date for preparing standard curve

以表2中濃度為橫坐標(biāo),吸光度平均值為縱坐標(biāo),以最小二乘法進(jìn)行擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)為:A=aC+b=13.903C-0.0191,r=0.9997。

將龜苓膏樣品分為樣品1與樣品2,每一樣品溶液重復(fù)測(cè)定三次吸光度,結(jié)果如表3所示。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線求Cx時(shí)引入的相對(duì)不確定度Urel(3)為:

擬合曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差:

=3.30×10-2

2.4 樣品重復(fù)測(cè)定引入的不確定度

按照同一實(shí)驗(yàn)方法對(duì)同一龜苓膏樣品進(jìn)行6次平行測(cè)定,測(cè)得結(jié)果分別為113.9、113.4、113.6、113.4、114.4、114.7 mg/kg,測(cè)定結(jié)果的平均值為113.9 mg/kg,測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.544 mg/kg,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.5 儀器引入的不確定度

分光光度計(jì)測(cè)定吸光度重現(xiàn)性引入的不確定度:對(duì)6份樣品溶液進(jìn)行吸光度測(cè)定,每份測(cè)定3次,得到18個(gè)吸光度數(shù)據(jù),測(cè)得含量平均值為0.2278 mg,各次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0019,則吸光度測(cè)量重現(xiàn)性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2(UV)=0.0019。儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將以上各分量不確定度結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表4。

表4 測(cè)量不確定度分量表Table 4 List of uncertainty components

由表4可得,相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

實(shí)驗(yàn)測(cè)得某一龜苓膏樣品中總黃酮的平均含量為99.75 mg/kg,則測(cè)量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:Urel(w)=99.75×3.48×10-2=3.47(mg/kg)

2.7 擴(kuò)展不確定度

在95%的置信區(qū)間下,擴(kuò)展不確定度包含因子k=2,則將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子即得測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為:U(w)=2×3.47 mg/kg=6.94 mg/kg。該龜苓膏樣品中總黃酮含量可表示為(99.75±6.94) mg/kg,k=2。

3 結(jié)論

龜苓膏中總黃酮含量的測(cè)量不確定度由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品重復(fù)測(cè)定及儀器五部分組成。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制是不確定的主要來源,標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合在不確定度合成中貢獻(xiàn)最大,而樣品處理、樣品重復(fù)測(cè)定、儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小。在實(shí)際檢測(cè)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制外標(biāo)法定量,加強(qiáng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過程控制,加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)操作訓(xùn)練,減少人為因素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)過程的影響,在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),增加實(shí)驗(yàn)點(diǎn)可降低分析結(jié)果的測(cè)量不確定度。

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Uncertainty evaluation for the determination of total flavonoids in guilinggao by spectrphotometry

MO Qi-jin1,ZHOU Mei-fang1,ZHU Hai-jun2

(1.College of Chemical Engineering and Resource Recycling,Wuzhou University,Wuzhou 543002,China;2. Wuzhou Institute of Product Quality Inspection,Wuzhou 543002,China)

The uncertainties evaluation of total flavonoids content in guilinggao was determined by spectrphotometry. Based on CNAS-GL06 guidance on evaluation the uncertainty in chemical analysis and JJF 1059-2012 evaluation of the uncertainty of deterrmination and expressin and the test method,a mathematical model was established to analyze and evaluate the possible uncertainties such as stock solution,sample treatment,standard curve fitting,measurement repeatability and instrument in the determination. The results showed that the major factors of uncertainty were the standard curve fitting and preparation of standard solution.

spectrphotometry;total flavonoids;uncertainty;guilinggao

2016-08-29

莫啟進(jìn)(1982-)，男，博士，工程師，研究方向：食品質(zhì)量檢測(cè)與安全評(píng)價(jià)，E-mail：qjmo@qq.com。

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科能14123006-25)。

TS207.3

A

:1002-0306(2017)04-0077-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.006