HPLCICPMS在線聯用分析食品中無機硒和硒氨基酸的形態

熊 珺,覃毅磊,龔 亮,賴毅東

(1.廣東省東莞市質量監督檢測中心,廣東東莞 523808;2.廣東省東莞市食品藥品檢驗所,廣東東莞 523109)

熊 珺1,覃毅磊2,龔 亮1,賴毅東1

(1.廣東省東莞市質量監督檢測中心,廣東東莞 523808;2.廣東省東莞市食品藥品檢驗所,廣東東莞 523109)

以亞硒酸鹽(Se(Ⅳ))、硒酸鹽(Se(Ⅵ))、硒胱氨酸(SeCys2)、硒蛋氨酸(SeMet)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代乙硫氨酸(SeEt)為硒形態的目標分析物,采用Dionex IonPac AS11色譜柱(250 mm×4.0 mm)為分離柱,通過優化流動相的pH、濃度、甲醇含量、流速和色譜柱的柱溫等因素對六種目標硒形態分離及不同提取方法對目標分析物提取效率的影響,建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)在線聯用同時測定食品中無機硒和硒氨基酸的分析方法。MeSeCys、SeMet、SeEt、Se(Ⅳ)、SeCys2和Se(Ⅵ)的檢出限分別為0.25、0.20、0.35、0.15、0.30、0.15 μg Se/L;MeSeCys和SeCys2的線性范圍為2.0～2500 μg Se/L,Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)線性范圍為1.2～1200 μg Se/L,SeMet和SeEt的線性范圍分別是1.5～1500 μg Se/L和2.2～2200 μg Se/L,各硒形態的線性相關系數均不少于0.9997。將該方法應用于食品中硒形態的分析,其加標回收的回收率為80.8%～106.7%,相對標準偏差(RSDs,n=3)為4.7%～9.6%。方法具有操作簡單、方便快速、靈敏度高和環境友好等優點,可滿足食品中硒形態定量分析。

無機硒,硒氨基酸,高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜,食品

硒是人體所必需的一種微量元素[1-4],具有豐富、復雜的化學形態,可分為無機硒和有機硒兩大類。無機硒包括硒酸、亞硒酸和其它無機形態,有機硒包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等大分子硒和硒代胱氨酸(Selenocystine)、硒代蛋氨酸(Selenomethinonine)、硒甲基硒代半胱氨酸(Se-methylselenocysteine)、硒甲基硒代蛋氨酸(Se-methylselenomethionine)等小分子硒化物[5]。硒的生理活性、生物可利用性以及毒性與其形態密切相關。研究表明,硒氨基酸可抗癌[6-8];硒半胱氨酸可參與蛋白質的合成;硒蛋氨酸可代替蛋氨酸被結合于蛋白中[9]。食品中含有豐富的蛋白質、維生素、礦物質等營養成分,是人們生存的必需品,也是攝硒主要渠道,因此,硒的形態分析引起了人們極大的興趣,建立靈敏、快速、準確的測定食品中硒形態的分析方法,對研究硒的毒性和生物活性對人體的影響有重要的意義。

氣相色譜[10-12]、液相色譜[13-17]和毛細管電泳[18-20]作為高效的分離技術,常用于硒的形態分析。與氣/液相色譜相比,毛細管電泳因靈敏度限制了其在實際樣品中的應用;與液相色譜相比,氣相色譜僅適合于易揮發、熱穩定的化合物分離,而硒氨基酸為極性化合物,必須進行柱前衍生以提高其揮發性以便后續GC分析;相對而言,液相色譜具備氣相色譜分離效率高、操作簡單、分析速度快等優點的同時,還彌補了氣相色譜的不足,分析對象廣,其與具有高靈敏度、寬線性范圍等優點的電感耦合等離子體質譜結合,已成為元素形態分析有效手段之一。目前HPLC-ICP-MS聯用技術用于硒的形態分析最常用色譜柱為C8和C18,為了提高分離效果,需在流動相中添加全氟羧酸如三氟乙酸、七氟丁酸等離子對試劑[15-17],此外流動相pH還需調至2.0～2.5范圍,但是在此分離條件下長期使用會縮短色譜柱的壽命。鑒于此,本實驗將首次采用Dionex IonPac AS11色譜柱為分離柱,以高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用的分離/分析手段,系統的研究影響硒各形態的提取及分離因素,進而建立硒形態分析檢測的方法,為客觀評價食品的質量提供了科學方法,對進一步改善和提高產品的質量,改進生產工藝,提供研究途徑和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Agilent 7700x型電感耦合等離子體質譜儀 美國Agilent公司,采用He碰撞池模式,并調節碰撞氣He的流量,以消除40Ar38Ar+與38Ar40Ca+對78Se+的質譜干擾;Dionex IonPac AS11 色譜柱(250 mm×4. 0 mm)、SG2-ELK 型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Mars 6型微波消解儀 美國CEM公司;EH35A電熱板 北京萊泊泰科儀器有限公司;SHA-B恒溫水浴搖床 常州澳華儀器有限公司;CT14RD離心機 上海天美生化儀器設備工程有限公司;Milli-Q超純水機 美國Millipore公司;ICP-MS儀器 通過玻璃同心霧化器與HPLC在線聯用。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 大蒜、蘑菇、卷心菜購置于當地大型超市,樣品放置于60 ℃真空干燥箱中7 d,研磨成粉末后,過100目篩,裝入潔凈的盛樣袋內,密封,并儲存在冷凍室里待用。

1.2.2 標準儲備液的配制 分別稱取一定量的硒胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒蛋氨酸和硒代乙硫氨酸于10 mL棕色容量瓶中,以超純水定容至刻度,配制濃度為1 mg/L的SeCys2、MeSeCys、SeMet和SeEt標準儲備液,避光冷藏保存。

1.2.3 樣品處理

1.2.3.1 總硒 稱取1.2.1勻質樣品0.25 g置于100 mL PTFE-TFE材質的消解罐中,依次加入5 mL濃硝酸和2 mL雙氧水,再將消解罐放入微波消解儀,按照表1的條件進行微波消解。消解程序結束后,冷卻至室溫,打開消解罐,將消解罐轉至電熱板蒸酸,至1 mL左右,然后將消解液轉移至25 mL的容量瓶中,并用超純水洗滌消解罐及蓋子,合并洗滌液,定容后搖勻,樣品液經0.22 μm水性濾膜過濾后,按1.2.4.1的實驗條件檢測。每個樣品做3次平行,同時做空白實驗。

表1 微波消解儀工作參數Table 1 Parameters of microwave digestion

1.2.3.2 有機硒 稱取經1.2.1處理后勻質樣品2.0 g于50 mL離心管,依次加入40 mg 蛋白酶K和20 mL 超純水,超聲30 min,然后放于37 ℃恒溫水浴搖床上振蕩4 h,12000 r/min轉速下離心,收集上層液過0.22 μm濾膜后,按1.2.4.2的儀器條件進HPLC-ICP-MS分離檢測。每個樣品做3 次平行,同時做空白實驗。

1.2.4 儀器參數

1.2.4.1 ICP-MS儀器參數 開啟ICP-MS,預熱20 min穩定后,對儀器進行調諧,并使儀器各項參數達到最佳狀態,具體儀器參數如下:射頻(RF)功率為1550 W,采樣錐為鎳錐,采樣深度為8 mm,分析模式為[He]碰撞反應池,氦氣流量為4.5 mL/min,等離子體氣流量為15 L/min,載氣流量為1.2 L/min,輔助氣流量為0.10 L/min,霧化室溫度為2 ℃,樣品提升泵速率為0.3 r/s,樣品分析泵速率為0.1 r/s,同時監測78Se,82Se信號。

1.2.4.2 HPLC-ICP-MS儀器參數 HPLC色譜條件:流動相為7.5 mmol/L磷酸氫二銨溶液(pH11.0),流速為0.6 mL/min,柱溫為25 ℃;ICP-MS參數同1.2.4.1,采集數據參數:采集模式為跳峰(Peak-hopping),滯留時間為100 ms,以峰面積定量。

1.2.5 數據處理 方法的精密度以相對標準偏差(RSD)表示,實驗數據用Origin 8.0軟件進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 HPLC-ICP-MS實驗條件優化

2.1.1 色譜峰的定性和定量 自然界硒(Se)共有6種同位素,即74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se,各自的自然豐度分別為0.89%、9.37%、7.63%、23.77%、49.61%和8.73%;雖然80Se的自然豐度最高,但40Ar40Ar+的干擾也最大。通過查閱文獻,實驗中選擇同時監測78Se、82Se色譜信號,鑒于78Se和82Se自然豐度比為2.71,以在同一保留時間下78Se和82Se色譜峰的峰面積比接近其自然豐度比2.71作為是否為硒某一形態的判定依據;同時根據每個硒形態標準溶液的保留時間,判斷各物質的出峰順序依次為MeSeCys、SeMet、SeEt、Se(IV)、SeCys2和Se(VI)。考慮到78Se比82Se色譜信號靈敏,故實驗中以78Se色譜峰的峰面積作為定量依據。

2.1.2 流動相pH對不同形態硒的保留行為的影響 由于元素不同的形態具有不同的pKa值,流動相的pH會影響目標分析物的帶電荷情況,且是影響各形態分離的最主要因素,因此實驗中首先考察了流動相pH在10.0～11.5范圍內對不同形態無機硒和硒氨基酸的保留行為,實驗結果如圖1所示。可以看出,在流動相為99%的10 mmol/L磷酸氫二銨和1%甲醇,0.8 mL/min流速,柱溫25 ℃的分離條件下,六種目標硒形態分析物的保留時間隨流動相pH的增大均有不同程度縮短,當流動相的pH升至11.0,Se(Ⅳ)、SeCys2和Se(Ⅵ)的峰形明顯改善;當流動相的pH繼續增至11.5時,MeSeCys和SeMet不能基線分離;兼顧分析效率和分析時間,后續實驗中選擇流動相pH為11.0。

圖1 流動相pH對目標分析物分離的影響Fig.1 Effect of pH on retention time of analytes

2.1.3 流動相中添加甲醇對目標分析物保留行為的影響 為了獲得良好的峰形及提高分離效率,考察了流動相中甲醇含量(0%、1%、2%、3%、4%(v/v))對目標硒形態保留行為的影響。從圖2可以看出,在0.8 mL/min流速,柱溫25 ℃的分離條件下,隨著流動相10 mmol/L磷酸氫二銨(pH11.0)含量從100%遞減至96%,甲醇的含量從0%增大至4%時,Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)和四種硒氨基酸的容量因子(k)并無發生明顯變化,且各目標分析物的峰形也無顯著改變。因此,流動相無需添加甲醇。

圖2 甲醇含量對待測物分離的影響Fig.2 Effect of amount of methanol on retention behaviors of selenium species

2.1.4 流速對目標分析物保留行為的影響 實驗考察了流動相流速從0.45 mL/min遞增至1.10 mL/min對各目標分析物保留行為的影響。雖然流速的增加可使各目標硒形態的保留時間有所提前,但是從圖3看出,當流速提升至0.70 mL/min時,由于前兩個物質MeSeCys和SeMet因保留時間太接近并未能達到完全基線分離。因此,選擇0.60 mL/min為最佳流速進行后續實驗。

圖3 流速對待測物分離的影響Fig.3 Effect of flow rate on retention behaviors of selenium species

2.1.5 柱溫對目標分析物保留行為的影響 考察了柱溫在15～50 ℃范圍內對六種目標硒形態分離的影響。結果表明,在所考察的溫度范圍內,柱溫對目標硒形態的保留影響不明顯。因此,為實驗方便,選擇在室溫25 ℃下進行。

2.1.6 流動相磷酸氫二銨的濃度對不同形態硒的保留行為作用的研究 圖4是流動相磷酸氫二銨的濃度在2.5～12.5 mmol/L范圍內對無機硒和硒氨基酸的保留行為的影響。可以看出,在25 min的分析時間中,MeSeCys、SeMet和SeEt的容量因子隨流動相磷酸氫二銨的濃度從2.5 mmol/L增至12.5 mmol/L而逐漸緩慢減少;Se(VI)的容量因子先隨磷酸氫二銨的濃度從2.5 mmol/L增至5.0 mmol/L而無明顯變化,當繼續增大磷酸氫二銨的濃度至12.5 mmol/L,其容量因子顯著逐步降低;當磷酸氫二銨的濃度在2.5～7.5 mmol/L范圍內,SeCys2和Se(VI)的容量因子并無變化,當磷酸氫二銨的濃度繼續升高,其容量因子反而明顯下降。此外,各目標分析物的保留時間均隨磷酸氫二銨濃度的增大而減少。因此,兼顧分離效率和分析時間,實驗中選取流動相磷酸氫二銨的濃度為7.5 mmol/L。

圖4 磷酸氫二銨的濃度對待測物分離效率的影響Fig.4 Effect of concentration of diammonium phosphate on retention behaviors of selenium species

表2 不同提取方法的提取效率Table 2 The efficiencies of different extraction methods

注:an.d.:未檢出。

表3 HPLC-ICP-MS方法的分析性能Table 3 Analytical performance for selenium species by HPLC-ICP-MS

備注:aSeEt和MeSeCys濃度為5 μg Se/L,SeCys2濃度為4 μg Se/L,SeMet濃度為3μg Se/L,Se(vI)和Se(Iv)濃度為2 μg Se/L;by:峰面積;cx:MeSeCys的濃度。

2.2 方法的提取效率

提取效率的高低直接影響了后續測定結果的準確性。為了確保樣品的提取效率及在提取過程中硒形態不發生轉變,以蘑菇和大蒜為例,比較了不同的提取方法如水提取、酸提取(0.1 mol/L HCl)和酶提取等對六種硒形態(Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet、SeCys2、MeSeCys和SeEt)的提取效率。從表2可以看出,采用水提取法對六種硒形態的提取效率僅為53.6%～64.1%;酸提取法對六種硒形態的提取效率為54.4%～68.4%;采用酶提取法,提取效率(85.2%～86.3%)有明顯改善,因此,在后續樣品分析中以酶提取法提取樣品。

2.3 方法的線性關系與檢出限

以Dionex IonPac AS11 色譜柱為分離柱,在室溫25 ℃、7.5 mmol/L磷酸氫二銨(pH11.0)為流動相和0.6 mL/min流速下,六種目標硒形態的色譜分離圖如圖5所示。以三倍信噪比所對應的分析物濃度為方法的檢出限,MeSeCys、SeMet、SeEt、Se(IV)、SeCys2和Se(Ⅵ)的檢出限分別為0.25、0.20、0.35、0.15、0.30、0.15 μg Se/L,相對標準偏差(RSDs,n=7)為4.9%～9.3%,表3同時給出了方法的線性范圍和線性相關系數,可以看出,各硒形態的線性相關系數均不低于0.9997,MeSeCys和SeCys2動態線性范圍是2.0～2500 μg Se/L,SeMet動態線性范圍是1.5～1500 μg Se/L,SeEt動態線性范圍是2.2～2200 μg Se/L,Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)動態線性范圍是1.2～1200 μg Se/L。

表4 方法的回收率Table 4 Results of recovery for selenium species in food samples by HPLC-ICP-MS

圖5 硒各形態色譜分離圖Fig.5 Chromatogram of selenium species under the optimized conditions

2.4 方法的回收率

以勻質后的大蒜、卷心菜、蘑菇添加標準溶液的方法進行加標回收率的測定,MeSeCys、SeMet、SeEt、Se(Ⅳ)、SeCys2和Se(Ⅵ)均分別添加50、100、150 μg/kg 3個水平,按照所建方法進行樣品處理和測定,實驗結果見表4。可以看出,大蒜、卷心菜、蘑菇中6種硒的形態加標回收率為80.8%～106.7%,相對標準偏差為4.7%～9.6%,足以滿足實際樣品檢測的要求。

2.5 樣品分析

采用本方法對市售大蒜、卷心菜和蘑菇進行檢測,其中,大蒜僅檢出SeMeCys,其含量為90.5 μg/kg;卷心菜中只檢出SeMet,其含量為16.9 μg/kg;蘑菇檢出Se(Ⅳ)、SeMet和SeCys2三種硒形態,其含量分別為130.9、77.3、96.4 μg/kg,可見,本文所建立的方法滿足食品中硒形態的分析。

3 結論

首次采用Dionex IonPac AS11 色譜柱為分離柱,通過對影響硒形態分離及提取的諸因素進行詳細考察和優化,建立了HPLC-ICP-MS同時測定食品中無機硒和硒氨基酸等六種硒形態的新方法。方法具有操作簡單方便、快速高效、靈敏度高和環境友好等優點,并成功地應用于食品中大蒜、蘑菇和卷心菜中無機硒和硒代氨基酸的形態分析，并進行了加標回收實驗,加標回收率為80.8%～106.7%,相對標準偏差(n=3)為4.7%～9.6%。本方法為食品中硒的形態分析提供了一種簡易的檢測方法,同時也為客觀評價食品的質量提供了科學依據。

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Simultaneous quantification of the speciation of inorganic selenium and Se amino acids in food by high performance liquid chromatography combined with inductively coupled plasma mass spectrometry

XIONG Jun1,QIN Yi-lei2,GONG Liang1,LAI Yi-dong1

(1.Guangdong Dongguan Quality Supervision Testing Center,Dongguan 523808,China2.Guangdong Dongguan Institutes for Food and Drug Control,Dongguan 523109,China)

inorganic selenium;Se amino acids;high performance liquid chromatography combined with inductively coupled plasma mass spectrometry(HPLC-ICPMS);food

2016-07-25

熊珺(1978-)，女，博士，高工，主要從事痕量化合物檢測技術方面的研究，E-mail:xj@gddqt.com。

廣東省質量技術監督局科技項目(2013ZS01)。

TS207.3

A

:1002-0306(2017)04-0067-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.004