HSSPMEGCOMS聯用法分析紅棗發酵飲料易揮發性成分條件的優化

李 凱,焦 嬌,李樹萍,許曼筠,張 婕,李美萍,張生萬

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

李 凱,焦 嬌,李樹萍,許曼筠,張 婕,李美萍,張生萬*

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

以紅棗發酵飲料為研究對象,利用頂空固相微萃取和氣相色譜-嗅聞-質譜聯用法分析其易揮發性成分并對其進行了分析,對影響固相微萃取操作條件的萃取頭、萃取溫度、萃取時間、樣品用量、平衡時間和解吸時間進行系統的優化,旨在建立一種分析紅棗發酵飲料易揮發性成分的方法,并通過嗅聞檢測結合氣味活度值和香氣強度值確定紅棗發酵飲料的特征風味成分,采用草酸二乙酯做內標對特征風味成分進行了含量測定。結果表明:選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、Rtx-WAX色譜柱、樣品用量8.0 mL/20.0 mL樣品瓶、加鹽量3.00 g、萃取時間70 min、萃取溫度70 ℃、平衡時間20 min、解吸時間3 min,分析紅棗發酵飲料易揮發性成分,共檢出114種組分,確定結構96種,占總易揮發性成分總量的98.86%;氣味活度值及香氣強度值分析結果表明:乙酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、2-辛酮、2-十一酮、乙酸-2-苯乙酯、苯丙酸乙酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、苯甲醛和3-羥基-2-丁酮為紅棗發酵飲料的特征風味成分。

頂空固相微萃取(HS-SPME),氣相色譜-嗅聞-質譜(GC-O-MS),紅棗發酵飲料,條件優化,易揮發性成分

紅棗為鼠李科植物棗樹的果實[1],屬于藥食同源性食物,營養豐富,藥用價值高[2-4],人們對紅棗的功效成分[5-9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11]和調節內分泌系統[12]等作用做了大量研究,并為增加其附加值、延伸其產業鏈開發了多種酒、水飲料。其中,以紅棗為原料,經棗汁浸提、發酵后,科學調配而成的紅棗發酵飲料酸甜可口,是一類獨特健康的營養飲品[5]。風味是飲料產品主要的品質指標之一[13]。以紅棗為原料發酵而成的飲料能保持紅棗的特殊香氣,特征風味的組成和含量變化一定程度上決定飲料的品質。

目前對紅棗發酵飲料的研究集中在復配[14]、工藝[1,3,9]和生物活性[7,15-16]方面,許倩[14]等以花生、紅棗和糯米為原料制得復合型發酵保健飲料;汪長鋼[1]等對紅棗醋飲料生產工藝過程進行了研究;靳玉紅[7]等對紅棗乳酸發酵飲料的抗氧化活性進行了研究。對紅棗發酵飲料易揮發性成分的研究,僅有楊智[8]通過電子鼻對紅棗乳酸發酵飲料的特征香氣進行了分析,主要由苯類、氮氧化物、芳香胺類、烷烴、甲基類、硫化物、醇類、硫化氫類組成。但對紅棗發酵飲料特征風味成分檢測方法的研究鮮有報道。

本實驗以紅棗發酵飲料為研究對象,采用頂空固相微萃取氣相色譜-嗅聞-質譜(Headspace Solid Phase Micro-Extraction and Gas Chromatography-Olfactometry-Mass Spectrometry,HS-SPME-GC-O-MS)聯用法對其易揮發性成分及微萃取條件進行了系統的研究,并結合氣味活度值(odor activity value,OAV)和香氣強度值確定了該飲料特征風味成分及其對總體香味貢獻程度,為紅棗發酵飲料易揮發性成分的研究提供分析方法和檢測手段,并為紅棗發酵飲料的特征風味研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗發酵飲料 山西省萬里紅酒業有限公司提供;NaCl 分析純,天津市光復科技發展有限公司;C7～C40正構烷烴 色譜純,上海安譜科學儀器有限公司;內標溶液 稱取0.0148 g草酸二乙酯,加入10 mL紅棗發酵飲料,搖勻即為內標溶液。

50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS固相微萃取頭及萃取手柄 美國Supelco公司;7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿易有限公司;ODP3嗅聞儀 德國Gestel公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HS-SPME的分離富集方法 移取8.0 mL紅棗發酵飲料置于20 mL頂空瓶中,加入3.00 g NaCl,用帶有橡膠隔墊的瓶蓋密封,置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中,在70 ℃下攪拌平衡20 min,然后將50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空瓶中距液面1 cm處,萃取70 min,待GC-O-MS分析。

1.2.2 GC-O-MS分析條件 GC條件:進樣口溫度250 ℃;載氣He,流速1.5 mL/min;Rtx-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);解吸時間3 min;程序升溫條件:初溫35 ℃,保持6 min,10 ℃/min升至112 ℃,保持2 min,6 ℃/min升至160 ℃,10 ℃/min升至230 ℃,保持5 min。

MS條件:電子電離源(elector ionization,EI);電子電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質量掃描范圍m/z 33～500;質譜庫為NIST 05;掃描模式為全掃描。

嗅聞方法:ODP3嗅聞儀的傳輸線溫度250 ℃,補充氣為N2,接口溫度為200 ℃。

1.2.3 定性與定量分析 按1.2.2中氣相色譜-嗅聞-質譜聯用分析條件,將按1.2.1 HS-SPME分離富集方法萃取后的萃取頭插入GC進樣口,解吸3 min,進行色譜掃描。

1.2.3.1 定性分析 按1.2.2分析條件對紅棗發酵飲料進行測定。定性分析通過對質譜解析結果與標準質譜庫(NIST 05)進行對照,并在相同色譜條件下,通過對C7～C40正構烷烴的色譜掃描,按文獻方法[17]計算得到各化合物的RI值,并與相應文獻值對照,同時,經評價員嗅聞[18]描述的化合物香味特征與文獻報道結果對比,驗證其定性結果。

1.2.3.2 定量分析 對色譜測定的各組分采用面積歸一化法進行相對百分含量分析,并按1.2.2中GC-O-MS分析條件,另外準確移取8 mL樣品,加入0.05 mL內標溶液,對紅棗發酵飲料中的主體香氣成分的含量采用內標法[19]進行定量分析。

1.2.4 香氣成分的評價

1.2.4.1 氣味活度值的計算 根據內標法對紅棗發酵飲料主體香氣成分進行的定量分析結果和各化合物在水中的嗅覺閾值,按下式計算OAV[20-21]：

OAV=C/OT

式中:C是根據內標法計算出的該化合物的質量濃度(μg/L);OT是該化合物在水中的嗅覺閾值(μg/L)。

1.2.4.2 香氣強度測定方法 由3位評價員在嗅聞儀檢測口記錄得到香氣成分的保留時間、香味特征和強度,強度分為0、1、2、3、4 五個等級,0表示無、1表示微弱、2表示中等、3表示較明顯、4表示非常明顯,并盡可能地對所感覺到的香味進行描述,與文獻報道的化合物香氣特征進行對比。

1.2.5 優化實驗

1.2.5.1 單因素實驗 以色譜分離所得峰個數和總峰面積為主要考察指標,確定實驗所用萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS)、樣品用量(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL)、萃取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、萃取時間(40、50、60、70、80 min)、平衡時間(10、20、30、40、50 min)、解吸時間(2、3、4、5、6 min)條件。采用控制變量法,在其他因素條件如1.2.1中所述情況下,考察某一單因素對萃取效果的影響。

1.2.5.2 正交實驗 設計如表1所示的四因素三水平的正交實驗,最終確定HS-SPME-GC-O-MS分析紅棗發酵飲料中易揮發性成分的萃取條件。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiments

1.3 數據分析

按1.2實驗方法進行實驗,對所得到的相應的總離子流色譜圖進行解析,統計其峰個數和總峰面積,上述數據經Excel軟件進行統計分析,同時結合香氣強度值和氣味活度值評價紅棗發酵飲料特征風味成分。

2 結果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件的選擇

2.1.1 萃取頭的選擇 按1.2的實驗方法,對不同固相微萃取頭吸附紅棗發酵飲料中易揮發性成分的能力進行測定,測定結果見圖1。

圖1 不同萃取頭對萃取效果的影響Fig.1 The effect of different SPME fiber types on the extraction

由圖1可知,在其他萃取條件一致的前提下,不同萃取頭對紅棗發酵飲料中易揮發性成分的吸附能力存在較大差異。其中,50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附得到的易揮發性成分峰個數和總峰面積明顯大于其他3種萃取頭。故本實驗選擇該萃取頭進行分離富集。

2.1.2 萃取溫度的選擇 按1.2的實驗方法,在其它條件不變的情況下,考察萃取溫度對萃取效果的影響。其結果見圖2。

圖2 不同萃取溫度對萃取效果的影響Fig.2 The effect of different extraction temperature on the extraction effect

從圖2中可以看出,隨著萃取溫度的升高,峰個數及總峰面積均呈上升趨勢,直至60 ℃時峰個數及總峰面積達到最大,溫度繼續升高,峰個數無明顯增加,總峰面積卻略有下降。萃取溫度對萃取頭吸附揮發性物質的種類和含量影響較大。溫度逐漸升高的過程中,有效峰個數明顯增加。在60 ℃時達到最大值,且繼續升高溫度,峰個數沒有明顯增加。這是由于溫度的增加能促進揮發性物質的擴散,縮短平衡時間,使一些低溫下不易揮發的物質揮發出來。繼續升高溫度,達到萃取頭的最大吸附量,萃取頭上的揮發性物質達到平衡,故峰個數沒有多大改變。峰面積略有所下降,可能是大分子不易揮發的物質吸附在萃取頭上,小分子物質的量有所減少,呈現總峰面積下降的趨勢。故萃取溫度選60 ℃。

2.1.3 萃取時間的選擇 按1.2的實驗方法,在其它條件不變的情況下,考察萃取時間對萃取效果的影響。其結果見圖3。

圖3 不同萃取時間對萃取效果的影響Fig.3 The effect of different extraction time on the extraction effect

隨著萃取時間的延長,峰個數及總峰面積均有所增加。萃取達到平衡的時間受很多因素的影響,如分配系數、擴散速度、萃取頭膜厚度等[22]。在其他條件不變的前提下,固相微萃取纖維頭在頂空瓶內達到吸附與解吸的動態平衡時有最大吸附量。隨著萃取時間的延長,萃取頭吸附的物質濃度增加,不易揮發的大分子物質的濃度也在增大,使得在萃取頭上吸附的小分子物質有所減少,導致總峰面積有所下降。從圖3可知,隨著萃取時間的延長,峰個數及總峰面積均有所增加,萃取時間達到70 min時,峰個數及總峰面積最大,故選萃取時間為70 min。

2.1.4 樣品用量的選擇 按1.2的實驗方法,在其它條件不變的情況下,考察樣品用量對萃取效果的影響。其結果見圖4。

圖4 不同樣品用量對萃取效果的影響Fig.4 The effect of different sample amount on the extraction effect

樣品用量的多少會影響頂空瓶中氣相和液相的體積比,影響香氣物質在兩相的分配比,影響HS-SPME的萃取結果[23]。從圖4可知,樣品用量少時,不易揮發的物質難以檢測到,但樣品用量太多時,色譜峰的分離度降低,峰數目降低,同時也不利于萃取操作,故樣品用量選8.0 mL。

表3 正交實驗對峰個數和總峰面積影響極差分析Table 3 Range analysis of peak number and total peak area

2.1.5 平衡時間的選擇 按1.2的實驗方法,在其它條件不變的情況下,考察平衡時間對萃取效果的影響。其結果見圖5。

圖5 不同平衡時間對萃取效果的影響Fig.5 The effect of different equilibrium time on the extraction effect

從圖5可知,在該萃取條件下,平衡時間為20 min時,峰個數及總峰面積達到最大,表明樣品中的揮發性物質被萃取頭吸附已達到飽和,故平衡時間選為20 min。

2.1.6 解吸時間的選擇 按1.2的實驗方法,在其它條件不變的情況下,分別考察解吸時間對萃取效果的影響。其結果見圖6。

圖6 不同解吸時間對萃取效果的影響Fig.6 The effect of different desorption time on the extraction effect

揮發性物質吸附到萃取頭后,解吸的時間影響揮發性物質能否完全解吸下來,另一方面萃取頭在GC進樣口250 ℃停留的時間影響HS-SPME萃取頭的使用壽命[23]。高溫有利于揮發性物質解吸,但也可能會使萃取纖維頭上的一些物質分解,故需選擇合適的解吸時間。從圖6可知,解吸時間為3 min時總峰個數達到最大,總峰面積也較大。故解吸時間選3 min。

2.1.7 正交實驗 因解吸時間、平衡時間對萃取效果影響不太明顯,萃取頭種類、樣品用量、萃取時間及萃取溫度對萃取效果有較大影響,所以在單因素實驗的基礎上,設計了如表1所示的四因素三水平的正交實驗。正交實驗結果與分析見表2、表3。

表2 正交實驗設計及結果Table 2 The results of orthogonal experiments

由表3極差值可知,以檢出峰個數為考察指標時,極差的大小順序為A>C>D>B,即各因素對萃取效果影響的大小為:萃取頭種類>萃取溫度>萃取時間>樣品用量,較優組合為A1B3C3D3。當考慮對揮發物吸附量的影響時,則選取總峰面積為考察指標,各因素對其影響的大小順序為A>D>B>C,即各因素對萃取效果影響的大小為:萃取頭種類>萃取時間>樣品用量>萃取溫度,較優組合為A1B3C3D3。經驗證實驗,最終確定最優組合為A1B3C3D3,即選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,取樣品用量8.0 mL、萃取時間70 min,萃取溫度70 ℃。最終確定的最優組合與正交表中第3組實驗結果進行比較驗證,最優組合得到120個色譜峰,總峰面積為3.04×109,最終確定最優組合效果更好。

2.2 紅棗發酵飲料易揮發成分分析

對待測紅棗發酵飲料,按實驗方法進行測定,其總離子流色譜圖如圖7所示,解析結果見表4。

圖7 紅棗發酵飲料揮發性成分總離子流色譜圖Fig.7 Total ion current chromatogram of Chinese jujube fermented beverages

表4 HS-SPME-GC-MS分析紅棗發酵飲料易揮發性成分結果Table 4 HS-SPME-GC-MS analysis of the results of volatile components of Chinese jujube fermented beverage

續表

續表

注:MS.化合物通過質譜檢測;RI.化合物通過查閱文獻報道的保留指數比對確認;Odor.化合物通過聞香確認。

從圖7和表4可知,紅棗發酵飲料揮發性成分共分離得到114種化合物,確定結構96種,占紅棗發酵飲料揮發性成分總量的98.86%。其中醇類化合物11種(含量5.79%)、酮類化合物22種(含量16.99%)、酸類化合物24種(含量46.64%)、酯類化合物17種(含量14.37%),醛類化合物8種(含量7.20%)、酚類化合物6種(含量6.53%)以及其他類化合物7種(含量2.48%)。酸類化合物在紅棗香氣成分中含量最大,這與鄧紅[24]研究的清澗紅棗香氣成分的結果是相吻合的。2,4-二叔丁基苯酚是食品中常用的抗氧化劑[25],丙酸能抑制霉菌的生長[26]。這些物質的存在有助于紅棗發酵飲料的穩定性。這些易揮發成分中相對含量在1%以上的是辛酸(11.51%)、2-壬酮(9.37%)、乙酸乙酯(9.30%)、n-癸酸(7.99%)、乙基麥芽酚(5.13%)、己酸(4.30%)、2-庚酮(2.52%)、糠醛(2.52%)、反-2-辛烯醛(2.31%)、己酸乙酯(2.30%)、乙醇(2.24%)、壬酸(2.11%)、2-十一酮(1.35%)、苯乙基苯甲醇(1.32%)、7-辛烯酸(1.26%)、9-癸烯酸(1.07%)、3-甲基丁醇(1.02%)、2-辛酮(1.00%)。

2.3 紅棗發酵飲料特征風味分析

根據嗅聞實測香氣,與文獻[26-37]中相應化合物的描述進行對比,并利用各成分香氣特征與其強度繪制紅棗發酵飲料主要香氣分布雷達圖(圖8),同時用香氣強度值和氣味活度值(OAV)確定了紅棗發酵飲料的特征香氣成分及其貢獻程度,其結果見表5。

圖8 紅棗發酵飲料主要香氣分布雷達圖Fig.8 The radar diagram of Chinese jujube fermented beverages main aroma

從圖8各物質的香氣強度可知,紅棗發酵飲料的香氣主要由水果味、奶香味和濃香型酒曲味組成,檸檬香的6-甲基-5-庚烯-2-酮、巧克力味的乙基麥芽酚和花香味的苯甲醛對整體香氣有補充、協調氣味的作用。酮類揮發性化合物一般呈現奶油味和果香味[25],3-羥基-2-丁酮賦予紅棗發酵飲料奶油香味;檸檬香的6-甲基-5-庚烯-2-酮對飲料的香氣有一定的調節作用。醛類化合物的風味閾值較低,對香味的形成有重要作用[25]。乙基麥芽酚是優良的香味增效劑,具有用量少,香味濃且持久的特點[34]。另外,酸臭味的丙酸、戊酸、己酸和庚酸,香氣強度低,對主體香氣影響不大。

由表5和圖8可知,通過嗅聞得到的紅棗發酵飲料易揮發性成分,其香氣強度值和氣味活度值基本相符,相互補充。乙酸乙酯、己酸乙酯、2-十一酮在紅棗發酵飲料中的含量較高,OAV均大于500,帶有典型的水果香味。OAV>1的有10 種,說明對紅棗發酵飲料香氣有一定程度的貢獻[39]。其中,香氣強度值最大的物質有:水蜜桃味的戊酸乙酯、濃香酒曲味的己酸乙酯、水果香味的2-壬酮和棗香味的苯丙酸乙酯。OAV值最大的是乙酸乙酯,具有淡淡的甜味。對紅棗發酵飲料的香氣貢獻最大。紅棗發酵飲料中的含量最多的是乙酸。乙酸是食醋的主要成分,是釀造醋的醋香特征成分[40]。醋香味乙酸強度不大,對整體香氣影響不大。OAV<1的有5種,分別是丙酸、戊酸、壬酸、癸酸和月桂酸,說明其對紅棗發酵飲料的香味基本無影響。

酯類化合物是紅棗發酵飲料特征風味成分中主要的組成成分。這與夏亞男[37]研究紅棗白蘭地特征香氣成分的結果是一致的,表明酯類是紅棗特征風味的主要構成成分。另外,呈現棗香味的苯丙酸乙酯和乙酸-2-苯乙酯是紅棗發酵飲料的特有香氣成分,對整體的香氣成分起到補充的作用。

表5 紅棗發酵飲料香氣成分聞香特點及OAV值Table 5 The aroma characters and OAV of Chinese jujube fermented beverages

3 結論

利用頂空固相微萃取和氣相-嗅聞-質譜聯用法分析紅棗發酵飲料易揮發性成分,對影響固相微萃取的操作條件進行系統的優化,建立了一種紅棗發酵飲料易揮發性成分的分析方法,確定的最佳固相微萃取和色譜條件:Rtx-Wax色譜柱、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、樣品用量8.0 mL/20.0 mL樣品瓶、萃取時間70 min、萃取溫度70 ℃、平衡時間20 min、解吸3 min的HS-SPME-GC-O-MS分析紅棗發酵飲料中易揮發性成分的方法。共檢測到114種化合物,確定結構的96種,占易揮發成分總面積的98.86%。

采用OAV結合香氣強度值對紅棗發酵飲料的風味成分進行了分析,通過實驗可知,紅棗發酵飲料的特征風味成分為乙酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、2-辛酮、2-十一酮、乙酸-2-苯乙酯、苯丙酸乙酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、苯甲醛和3-羥基-2-丁酮。另外,呈現棗香味的苯丙酸乙酯和乙酸-2-苯乙酯是紅棗發酵飲料的特有風味成分,對整體的香氣成分起到補充的作用。該研究結果為紅棗發酵飲料香氣特征風味及其開發利用提供了一定的理論依據。

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Optimization of volatile compounds in Chinese jujube fermented beverages by headspace solid phase micro-extraction and gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry

LI Kai,JIAO Jiao,LI Shu-ping,XU Man-jun,ZHANG Jie,LI Mei-ping,ZHANG Sheng-wan*

(College of Life Sciences,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

The volatile compounds in Chinese jujube fermented bverages were analyzed by HS-SPME and GC-O-MS. Affecting the operation of HS-SPME experimental conditions of extraction head,extraction temperature,extraction time,sample amount,equilibrium time and desorption time were optimized,it is in order to establish a method of analysis of volatile components in Chinese jujube fermented beverages,and the contribution of the main components to the overall aroma of Chinese jujube fermented beverages was evaluated by odor activity value(OAV)combined with aroma intensity value with diethyl oxalate as internal standard substances. The results indicated that the optimal extraction performance analyzing Chinese jujube fermented beverages volatile components was 50/30 μm poly two vinyl benzene/carbon molecular sieve/poly two methyl siloxane(DVB/CAR/PDMS)solid-phase micro extraction head,Rtx-WAX column,8.0 mL of sample add salt at 3 g with extracting at 70 ℃ for 70 minutes,20 minutes equilibrium time and 3 minutes desorption time. The results showed that through the analysis of HS-SPME-GC-O-MS,a total of 114 compounds were isolated,and the structure of 96 in them were identified,accounting for 98.86% of the total volatile substances Evaluation of OAV and aroma intensity values showed that ethyl acetate,pentanoic acid ethyl ester,ethyl hexanoate,2-Nonanone,2-Undecanone,2-phenyl ethyl acetate,Benzoic acid ethyl ester,6-methyl-5-hepten-2-one,benzaldehyde and 3-Hydroxy-2-butanone was the main aroma components of Chinese jujube fermented beverages.

solid-phase micro-extraction(HS-SPME);gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry(GC-O-MS);Chinese jujube fermentd beverage;optimization;volatile compounds

2016-09-02

李凱(1991-)，男，碩士研究生，研究方向:食品化學，E-mail：308218025@qq.com。

*通訊作者:張生萬(1955-)，男，大學本科，教授，研究方向:食品化學、化學計量學，E-mail：zswan@sxu.edu.cn。

2014新興產業領軍人才創業項目資助。

TS275.5

A

:1002-0306(2017)04-0054-09

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.002