1例造血干細胞捐獻者HLA新等位基因A*33∶88家系調(diào)查及A*33∶88模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)分析

裴永峰，李恒聰,黃惠妮，吳國光(南寧中心血站輸血醫(yī)學(xué)研究所，南寧530007)

1例造血干細胞捐獻者HLA新等位基因A*33∶88家系調(diào)查及A*33∶88模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)分析

裴永峰，李恒聰,黃惠妮，吳國光
(南寧中心血站輸血醫(yī)學(xué)研究所，南寧530007)

目的 對1例造血干細胞捐獻者HLA新等位基因A*33:88進行家系調(diào)查，初步分析A*33:88模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)。方法 1例造血干細胞捐獻者(先證者)及其父母，抽取先證者及父母靜脈血5 mL，檢測先證者及其父母ABO、Rh紅細胞血型。取抗凝全血200 μL，提取DNA后采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-基于測序的分型技術(shù)(PCR-SBT)方法進行HLA分型(HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點分型)。采用SWISS-MODEL方法，以同源性最高的HLA-A*3α鏈為模板進行構(gòu)建，得到模擬的A*33:88蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)并進行分析。結(jié)果 先證者及其父母血型均為O型，Rh血型均為D/CcEe，符合遺傳規(guī)律。先證者HLA-A位點分別為A*11∶01、A*33∶88，先證者父親為A*33∶03、A*33∶03，先證者母親為A*11∶01、A*11∶01，A*33∶88和A*33∶03∶01的差異是在第3外顯子475位的G>A，密碼子135由GCG變?yōu)锳CG，編碼的氨基酸由丙氨酸(A)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(T)。A*33∶88模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)與A*33∶03∶01模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)相比，編碼氨基酸在135位由非極性疏水氨基酸(A)轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性親水氨基酸(T)，改變的氨基酸位于抗原肽結(jié)合區(qū)α-螺旋(132-178)位置，此位置為抗原(多肽)結(jié)合凹槽的側(cè)壁。結(jié)論 HLA新等位基因A*33:88 (HWS10022752)不由先證者母方突變所致，可能由父方產(chǎn)生突變所致，該突變能正常遺傳給后代。A*33:88的蛋白質(zhì)模擬三級空間結(jié)構(gòu)分析，顯示替代氨基酸位于抗原肽結(jié)合區(qū)α-螺旋上。

人類白細胞抗原；等位基因；人類白細胞抗原新等位基因；A*33:88；人類白細胞抗原基因

人類白細胞抗原 (HLA) 位于人類6號染色體短臂上，DNA片段長度約占人基因組1/3 000，是目前所知的人最復(fù)雜、多態(tài)性最高的遺傳系統(tǒng)，具有很高的人種、民族、地域差異以及同一HLA基因座有多種不同的等位基因。既往研究[1]認(rèn)為，HLA與人類的免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān)，在抗原的加工及呈遞、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。HLA編碼主要組織相容性復(fù)合體(MHC)基因，其中部分基因編碼細胞表面抗原，是免疫系統(tǒng)區(qū)分本身和異體物質(zhì)的基礎(chǔ)。目前，HLA配型技術(shù)已經(jīng)廣泛用于器官移植和骨髓移植中。截止到2016年7月，HLA數(shù)據(jù)庫已正式納入15 020個HLA等位基因，命名3 492個HLA-A位點的等位基因[2]。HLA新等位基因A*33∶88 (HWS10022752)在2014年4月獲得世界衛(wèi)生組織HLA因子命名委員會官方命名[3, 4]。研究新等位基因A*33∶88的序列，可為HLA基因相關(guān)研究和應(yīng)用提供信息，目前國內(nèi)尚未見關(guān)于A*33∶88的相關(guān)報道。我們分析了1例造血干細胞捐獻者的新等位基因A*33∶88，并對其進行家系調(diào)查，初步分析A*33∶88的模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 1例造血干細胞捐獻者(先證者)，為中國造血干細胞資料庫廣西分庫2014年入庫的志愿者，女，42歲，廣西馬山縣人，壯族；于1 048份HLA常規(guī)分型份標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)HLA-A位點分型結(jié)果異常，與雜合結(jié)果A*11∶01∶01G，A*33∶03∶01在第三外顯子的475位有1個堿基不匹配，用組特異性測序引物(GSSP)確定了突變發(fā)生的等位基因位于A*33，序列經(jīng)GenBank比對后，提交世界衛(wèi)生組織HLA因子命名委員會在2004年被正式命名為A*33:88[4]。其父65歲，壯族;其母62歲，壯族。

1.2 先證者及其父母ABO、Rh紅細胞血型檢測方法 于2016年8月23日抽取先證者及父母靜脈血5 mL，EDTA抗凝后備用。采用上海血液生物醫(yī)藥有限公司的抗A抗B血型定型試劑(20150509)和RhD(IgM)血型定型試劑(20151812)檢測先證者及其父母ABO、Rh紅細胞血型，所有操作均嚴(yán)格按照試劑說明書進行。

1.3 先證者及其父母HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點分型方法 ①標(biāo)本DNA提取 取先證者及其父母抗凝全血200 μL，嚴(yán)格按試劑說明書提取DNA (QIAamp DNA blood mini kit，荷蘭)，用Thermo SCIENTIFIC NANODROP 1000核酸蛋白測定儀確定DNA質(zhì)量，DNA濃度為50～100 ng/μL A260nm/280 nm為1.7～1.9，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測無DNA降解現(xiàn)象。②標(biāo)本HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點分型 采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-基于測序的分型技術(shù)(PCR-SBT)方法進行HLA常規(guī)實驗分型，采用Life TechnologiesTM公司的SeCore?Sequencing Kits測序分型試劑盒(美國)對先證者及其父母的HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點進行高分辨HLA基因分型。HLA-A、HLA-B位點經(jīng)PCR擴增、純化后，對第2、3、4外顯子進行雙向測序；HLA-DRB1位點經(jīng)PCR擴增、純化和稀釋后，只對第2外顯子進行雙向測序。測序儀為3730xl DNA Analyzer，所有實驗步驟均嚴(yán)格按試劑操作說明書、利用試劑配套序列分析軟件Utype6.0進行序列分析。實驗重復(fù)3次以驗證結(jié)果正確性。

1.4 A*33∶88的模擬的蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)分析方法 先證者樣本DNA經(jīng)測序驗證得到的堿基序列涵蓋了2、3、4這3個外顯子，經(jīng)編碼為氨基酸序列，使用SWISS-MODEL方法[5]，以同源性最高的HLA-A*3α鏈為模板進行構(gòu)建，得到模擬的新基因蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)并進行分析。

2 結(jié)果

2.1 先證者及其父母ABO、Rh紅細胞血型 先證者及其父母血型均為O型，Rh血型均為D/CcEe，先證者家系A(chǔ)BO、Rh紅細胞血型的檢測結(jié)果符合遺傳規(guī)律。

2.2 先證者及其父母HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點分型結(jié)果 先證者及其父母HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點分型結(jié)果顯示，先證者HLA-A*11∶01來自其母親，HLA-A*33來自其父親，但其父并沒有攜帶新等位基因HLA-A*33∶88，而是檢出了與之相近的A*33∶03∶01，兩者的差異是在第3外顯子475位的G>A，密碼子135由GCG變?yōu)锳CG，編碼的氨基酸由丙氨酸(A)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(T)。該家庭成員的HLA-A、B、DRB1位點4位高分辨分型結(jié)果見表1，單倍型分析結(jié)果見表2。

表1 先證者及其父母HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點分型結(jié)果

表2 先證者及其父母單倍型分型結(jié)果

2.3 A*33∶88模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu) 經(jīng)SWISS-MODEL方法得到A*33∶88模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)，見圖1。由圖1可見，與A*33∶03∶01相比，編碼氨基酸在135位由非極性疏水氨基酸(A)轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性親水氨基酸(T)，改變的氨基酸位于抗原肽結(jié)合區(qū)α-螺旋(132-178)位置，此位置為抗原(多肽)結(jié)合凹槽的側(cè)壁。

注：箭頭為與A*33∶03∶01相比發(fā)生改變的模擬蛋白三級空間結(jié)構(gòu)位置

圖1 HLA-A*33∶88模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)

3 討論

HLA 不同等位基因的區(qū)別主要在于高度多態(tài)性位點的堿基不同，導(dǎo)致MHC I類分子形成的多態(tài)性不同，MHC I類分子是組織細胞內(nèi)抗原肽的遞呈者。HLA-A位點是HLA-Ⅰ類基因中多態(tài)性較高的基因家族，其多態(tài)性主要表現(xiàn)在第2、3、4外顯子[6]，研究發(fā)現(xiàn)HLA-I類基因的第2、3、4外顯子分別編碼α鏈的α1、α2、α3結(jié)構(gòu)域，其中α1、α2 兩個結(jié)構(gòu)域位于分子的頂部，共同組成抗原肽結(jié)合區(qū)，是分子的可變區(qū)和抗原肽識別的部位[7]。抗原肽結(jié)合區(qū)分為α-螺旋和β-折疊兩部分，α-螺旋和 β-折疊共同構(gòu)成了一個能夠結(jié)合多肽抗原的槽狀結(jié)構(gòu)，稱為抗原(多肽)結(jié)合凹槽。α-螺旋形成凹槽的側(cè)壁，β-折疊形成凹槽的底面。其中，HLA-I類分子的α-螺旋由氨基酸45-85、132-178構(gòu)成，β-折疊由氨基酸3-13、20-38、92-103、109-127構(gòu)成。因此，α-螺旋和 β-折疊結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸的替換可能會影響到抗原結(jié)合的部位。

HLA的多態(tài)性是由基因控制的，也是由堿基變化所形成的，變化的成因有堿基突變、基因重組、順序轉(zhuǎn)換等，文獻資料表明，目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新HLA等位基因多屬于堿基突變[8]。本課題組采用目前HLA基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)PCR-SBT和GSSP的方法，報道了一個HLA的新等位基因A*33∶88，與其最相近的等位基因A*33∶03∶01的區(qū)別是A*33∶88的第3外顯子475位為A，而HLA-A*33∶01∶01第3外顯子的475位為G，推測A*33∶88是由HLA-A*33∶01∶01點突變而來，此突變導(dǎo)致編碼的氨基酸由丙氨酸(G)轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸(A)，即為錯義突變[9]。

本文在對1例來源于造血干細胞捐獻者的先證者及其父母進行了紅細胞血型和HLA家系遺傳學(xué)的驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三人的血型均為O型，符合遺傳學(xué)規(guī)律；HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點分型結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，先證者HLA-B、DRB1位點的結(jié)果也完全符合遺傳學(xué)規(guī)律。但是HLA-A的分型結(jié)果顯示，先證者HLA-A*11∶01來自其母親，HLA-A*33來自其父親，但其父親并沒有攜帶新等位基因HLA-A*33∶88，說明該新等位基因是父親在遺傳給先證者時發(fā)生了改變。由于HLA的抗原血清學(xué)實驗需要分離細胞，故最少需要約20 mL全血，而本文先證者及其父母因個人原因，只同意每人最多采集5 mL全血，所以目前HLA-A*33∶88所對應(yīng)的血清學(xué)特異性及相應(yīng)的抗原的生物學(xué)特性還有待于進一步研究。

HLA-A*33∶88與HLA-A*33∶01∶01相比，其編碼氨基酸在135位發(fā)生了改變，氨基酸由非極性疏水氨基酸(丙氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)闃O性親水氨基酸(蘇氨酸)，氨基酸的極性和親水性都發(fā)生了改變，且此改變的氨基酸位于α-螺旋中(132-178)的位置。MHC I類分子與抗原肽相互作用的某些關(guān)鍵部位或次要部位的氨基酸改變，不僅可能影響MHC與多肽的特異結(jié)合,并且直接影響其后對抗原肽的遞呈[7]。此氨基酸的改變，是否會導(dǎo)致所對應(yīng)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的改變，從而影響相應(yīng)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，并影響MHC與多肽的特異結(jié)合以及影響其后對抗原肽的遞呈，有待遇進一步的結(jié)構(gòu)及功能學(xué)研究。

HLA各座位均存在為數(shù)眾多的復(fù)等位基因，這是HLA高度多態(tài)性的主要原因。HLA新等位基因的發(fā)現(xiàn)，可增加中國及世界HLA多態(tài)性數(shù)據(jù)，為骨髓及組織器官移植的患者尋找合適的供者提供參考依據(jù)，同時也為研究HLA與基本的相關(guān)性、動物的配偶選擇、法醫(yī)親子鑒定和個體識別、輸血醫(yī)學(xué)及人類群體遺傳學(xué)研究等提供了基本數(shù)據(jù)[10]，具有重要參考意義。本文報道的A*33∶88所屬的HLA-A*33家族在人群中等位基因較多，截止2016年7月，HLA-A*33家族共發(fā)現(xiàn)151個等位基因。北方漢族人群A*33的基因頻率約為3.40%，黑龍江人群約為7.87%，哈爾濱滿族人群約為2.80%，武漢人群約為5.00%，上海人群約為9.16%，南方漢族人群約為6.50%，臺灣人群約為11.10%，重慶漢族人群約為6.85%，美國黑人人群約為6.95%，高加索人群約為2.07%，日本人群約為7.70%，講壯族或侗族語言的壯族人群約為13.20%[11～15]。可見A*33在不同民族及不同地區(qū)人群中的分布不均衡，具有較明顯的地域差異，本文報道的A*33∶88先證者為廣西籍壯族，壯族人群A*33的基因頻率大于10.00%[15]，屬于比較高的頻率，這可能是由于廣西是中國壯族的發(fā)源地，由于地理位置和歷史進程的特殊性，經(jīng)歷了群體漂移，形成了壯族、漢族為主并有瑤族、苗族、侗族等多民族混居的分布特點，因而導(dǎo)致A*33的基因頻率具有本地區(qū)的獨特性。HLA-A*33∶88在廣西壯族人群中的發(fā)現(xiàn)豐富了HLA基因庫，擴大了HLA基因系統(tǒng)的遺傳多樣性，揭示了廣西地區(qū)HLA的分布特性，對研究該地區(qū)的人群來源、融合、變遷等提供數(shù)據(jù)參考。

研究[15]發(fā)現(xiàn)，壯族人群中A*33∶03-B*58∶01-DRB1*13∶02屬于頻率低于2%單體型，該單體型在遼寧人群(頻率1.16%)、浙江漢族(頻率1.74%)中也不是常見單體型[16,17]，而在黑龍江地區(qū)人群中(頻率12.70%)則是常見單體型[11]。在中國造血干細胞捐獻者資料庫廣西分庫志愿捐獻者中查詢A33-B58-DR13高分辨基本全是A*33∶03-B*58∶01-DRB1*13∶02，而本文中樣本卻是A*33∶88-B*58∶01-DRB1*13∶02，HLA-A*33∶03發(fā)生了改變。本實驗室人員隨后檢索了約4 000份廣西分庫高分辨入庫數(shù)據(jù)，未發(fā)現(xiàn)A*33∶88的其他個體，推測該基因在廣西人群中的頻率很低，這與作者已報道的其他HLA新等位基因類似[15]。但是在造血干細胞移植分型實驗時，若出現(xiàn)此類基因一定要進行復(fù)核以確保結(jié)果的正確，同時也增加了尋找供者的難度。近年來，HLA與疾病的相關(guān)性研究也很多，中國南方漢族人群中急性淋巴細胞白血病患者的A26、B56和DR9 顯著增高， A30、A33 和B58顯著降低[16]；急性髓性白血病患者的HLA-A*01和B*37 增高，A*33和B*51降低[17]。由此可見，HLA-A*33可能是以上疾病的保護基因。

綜上所述，HLA新等位基因A*33∶88 (HWS10022752)由先證者父方產(chǎn)生突變所致，該突變能正常遺傳給后代。先證者A*33∶88的模擬蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)分析表明，替代氨基酸位于抗原肽結(jié)合區(qū)α-螺旋上。

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Investigation for the heritage of a new HLA allele A*33:88 in a hematopoietic stem cell donor and analysis of its 3D model structure

PEIYongfeng,LIHengcong,HUANGHuini,WUGuoguang

( 1NanningInstituteofTransfusionMedicine,NanningBloodCenter,Nanning530007,China)

Objective To investigate the heritage of a novel human leukocyte antigen (HLA) allele A*33:88 in a hematopoietic stem cell donor and to analyze its 3D model structure of HLA molecule. Methods One hematopoietic stem cell donor (proband) and their parents were included, and then, 5 mL proband and parental venous blood was collected to detect their blood groups of ABO, Rh red blood cells. We took anticoagulated whole blood 200 μL to extract DNA. Subsequently, HLA typing (HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 site typing) was performed using polymerase chain reaction sequencing-based typing (PCR-SBT). The A*33:88 protein 3D structure was constructed by the SWISS-MODEL on the basis of taking the HLA-A*3α chain with the highest homology as the template to construct, after that, we analyzed the 3D structure of the protein.Results The proband and their parents′ blood groups were O-type, Rh blood group was D/CcEe, which was consistent with genetic law. The HLA-A genotype of the donor was A*11∶01 and A*33:88, the HLA-A genotype of the donor′s father was A*33∶03 and A*33∶03, the HLA-A genotype of the donor′s mother was A*11∶01 and A*11∶01. The difference between A*33:88 and A*33:03∶01 was in the third exon at position 475 G>A (codon 135 GCG>ACG), and Gla (A) was changed to Thr (T). We compared the 3D model structure between A*33∶88 and A*33∶03∶01. The encoded amino acid at residue 135 was changed from polar non-polar hydrophobic amino acid (A) to polar hydrophilic amino acid (T). The altered amino acid was located at the α-helix (132-178) position of the antigen peptide binding region, which was the side wall of the antigen polypeptide. Conclusions The new allele A*33:88 (HWS10022752) is generated from proband father′s mutation, which can be passed to his children. According to its 3D model structure, the amino acid substitution is located in α-helices of antigenic peptide-biding region.

human leukocyte antigen; alleles; novel allele of human leukocyte antigen; A*33:88; human leukocyte antigen gene

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科技研究計劃項目(Z2010198)；南寧市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(201003048C-3)。

裴永峰(1977-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，助理研究員，主要研究方向為輸血醫(yī)學(xué)。E-mail: 389441556@qq.com

吳國光(1943-)，男，博士后，研究員，主要研究方向為免疫血液學(xué)與輸血醫(yī)學(xué)。E-mail: guangwu@szonline.net

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.07.007

R392.2

A

1002-266X(2017)07-0023-04

2016-09-28)