兩種清熱解毒中成藥對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖影響的比較研究

陳 鵬，林慶賓，劉 宇，伏 勇

(福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院， 福建 福州 350112)

兩種清熱解毒中成藥對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖影響的比較研究

陳 鵬，林慶賓，劉 宇，伏 勇

(福建中醫(yī)藥大學(xué)骨傷學(xué)院， 福建 福州 350112)

目的探討兩種清熱解毒中成藥八寶丹、西黃丸對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖的影響。方法制備八寶丹、西黃丸水提物，干預(yù)骨肉瘤MG63細(xì)胞、用MTT法、平板克隆分別檢測(cè)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖、克隆形成能力。結(jié)果MTT法檢測(cè)高、中、低劑量組八寶丹對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖的抑制率分別為61.35%、40.25%、18.35%；高、中、低劑量組西黃丸對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖的抑制率分別為60.78%、40.60%、19.38%，組間同一濃度比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；各劑量組兩種中成藥均能抑制MG63細(xì)胞的克隆形成能力，但兩組間同濃度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論八寶丹、西黃丸均可抑制MG63細(xì)胞增殖和克隆形成能力，且兩種中成藥的抑制作用相比較無(wú)差異。

八寶丹；西黃丸；骨肉瘤；增殖；平板克隆

骨肉瘤好發(fā)于青少年，多發(fā)于四肢長(zhǎng)骨干骺端。該病病情進(jìn)展迅速，惡性程度高[1]。目前臨床上主要以輔助化療和外科根治性手術(shù)為主要治療方法，患者的生命得以延長(zhǎng)，但由于本病早期肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高，且骨肉瘤的增長(zhǎng)率較快，導(dǎo)致其生存率較低。因此，采取各種治療方法以抑制骨肉瘤的增殖促進(jìn)其凋亡可以達(dá)到降低死亡率的目的。

現(xiàn)代臨床上，八寶丹，西黃丸常用于乳腺癌、腸癌、肝癌、肺癌等疾病的治療中，可以減輕病人痛苦、改善臨床癥狀[2，3]。本研究以骨肉瘤MG63細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用MTT法及平板克隆方法，觀察八寶丹、西黃丸對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

八寶丹(廈門(mén)中藥廠有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：100603)；西黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，生產(chǎn)批號(hào)：13041014)；骨肉瘤MG63細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院研究院細(xì)胞庫(kù)提供)；RPMI-1640小牛血清(上海卡努生物科技有限公司)；DNM-9606酶標(biāo)儀(美國(guó)英思科)；HTC-500恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海三騰儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1溶液配制

①八寶丹水提物的制備配置前粉碎，研磨，用PBS溶解成每毫升藥液含10mg生藥，超聲波超聲30min后，高壓后存放于4℃冰箱內(nèi)備用。

②西黃丸水提物的制備方法同上。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

骨肉瘤MG63細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液貼壁生長(zhǎng)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每隔一天換液，按1∶3比例傳代。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)好的細(xì)胞稀釋成1.0×105個(gè)/ml，分種于96孔培養(yǎng)板，兩種藥物各設(shè)3個(gè)藥物濃度，一個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加100 μl骨肉瘤細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)生長(zhǎng)曲線的結(jié)果，在接種72小時(shí)后換含藥培養(yǎng)基，八寶丹濃度為2.5 mg/mL、5 mg/mL、7.5 mg/mL，西黃丸1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL，陰性對(duì)照組為加入0.1%DMSO和DMEM培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24小時(shí)后每孔加入5 mg/mL MTT各20 μl。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸去上清，加入150 μl的DMSO以溶解細(xì)胞內(nèi)形成的結(jié)晶。在酶標(biāo)儀上測(cè)定其在490 nm處的OD值。計(jì)算細(xì)胞在藥物作用下的生長(zhǎng)抑制率，即細(xì)胞毒性指數(shù)(CI)。CI(%)＝(1-實(shí)驗(yàn)組 OD值/陰性對(duì)照組 OD值) ×100%。

1.2.4平板克隆實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)液吹打均勻，接種于6孔板中，每孔加入500個(gè)細(xì)胞，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后藥物組分別加入不同濃度的藥物。每3 d更換一次培養(yǎng)液至細(xì)胞集落形成，終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，PBS液洗2次后，純甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，空氣干燥后，顯微鏡下計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)(≥50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆)，計(jì)算各組克隆形成率。克隆形成率＝克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以s表示，組間比較采用單向方差分析(One-Way ANOVA)(F檢驗(yàn))。顯著性水準(zhǔn)取α＝0.05。。

2 結(jié)果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

八寶丹高、中、低劑量組OD值分別為0.337±0.178、0.521±0.098、0.712±0.021，抑制率分別為 61.35%、40.25%、18.35%，其中高劑量組OD值與空白對(duì)照組(OD值＝0.872±0.024)比較有顯著性差異(P＜0.01)、中、低劑量組OD值與空白對(duì)照組比較有差異(P＜0.05)；西黃丸高、中、低劑量組 OD值分別為0.342±0.015、0.518±0.122、0.703±0.103，抑制率分別為60.78%、40.60%、19.38%，其中高劑量組OD值與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)、中、低劑量組OD值與空白對(duì)照組比較有差異(P＜0.05)；八寶丹、西黃丸各濃度組間比較無(wú)差異(P＞0.05)。

2.2 平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果

八寶丹、西黃丸各劑量組八寶丹高、中、低劑量組細(xì)胞克隆數(shù)分別為 101.7±3.335、122.7±6.751、152.5± 3.852，其中高劑量組細(xì)胞克隆數(shù)與空白對(duì)照組(細(xì)胞克隆數(shù)＝182.2±7.363)比較有顯著性差異(P＜0.01)，中、低劑量組細(xì)胞克隆數(shù)與空白對(duì)照組比較有差異(P＜0.05)；西黃丸高、中、低劑量組細(xì)胞克隆數(shù)分別為 106.2±1.351、120.6±4.225、148.3±8.267，其中高劑量組細(xì)胞克隆數(shù)與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，中、低劑量組細(xì)胞克隆數(shù)與空白對(duì)照組比較有差異(P＜0.05)，兩種藥物均能抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的克隆形成能力；兩組藥物各濃度組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

3 討論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為：骨肉瘤是正氣虧虛、邪毒內(nèi)侵凝聚而成。究其病機(jī)，主要是氣滯而導(dǎo)致血瘀內(nèi)停，至于濕熱、風(fēng)寒、痰濁均是促成氣滯血瘀的間接因素。在骨肉瘤的治療中應(yīng)注重活血化瘀、扶正固本、化痰散結(jié)、清熱解毒，八寶丹由天然牛黃、天然麝香、蛇膽、三七、珍珠粉等組成。西黃丸由牛黃、麝香、乳香(醋制)、沒(méi)藥(醋制)組成。二藥均具有清熱解毒、消腫止痛、削堅(jiān)化結(jié)之功效。吳豪等[4]研究發(fā)現(xiàn)八寶丹對(duì)荷瘤小鼠外周血、脾臟及骨髓中的MDSC比例有明顯降低作用。周忠等[5]研究發(fā)現(xiàn)八寶丹體外對(duì)骨肉瘤U-2OS細(xì)胞有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。金沈銳等[6]通過(guò)體內(nèi)體外兩方面實(shí)驗(yàn)，得出西黃丸可特異性地將腫瘤細(xì)胞阻滯在G2-M期，提示西黃丸可通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞周期來(lái)發(fā)揮抑瘤效應(yīng)。現(xiàn)代藥理研究表明，牛黃、三七等清熱解毒藥物具有較廣的抗菌譜，能抑制病毒、提高機(jī)體的非特異性免疫功能[7-8]；麝香具有抗菌、增強(qiáng)免疫及抗腫瘤等作用；制乳香、制沒(méi)藥等活血化瘀藥物可以改善結(jié)締組織代謝及微循環(huán)，抑制腫瘤細(xì)胞株的增值[9-10]。

本次研究發(fā)現(xiàn)，兩種抗腫瘤中成藥體外對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞產(chǎn)生影響，均能抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖及克隆形成能力，有一定的濃度依賴性。不僅符合中醫(yī)治療骨肉瘤的治則，體現(xiàn)了中醫(yī)治療腫瘤的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，亦具有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)為其佐證。然而，由于中藥復(fù)方抗腫瘤多靶點(diǎn)效應(yīng)，骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖受多種因素協(xié)同調(diào)控，如基因、細(xì)胞因子及信號(hào)通路等，因此，有必要進(jìn)一步研究?jī)煞N藥物在其他途徑是否同樣對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生影響。

[1] 周 忠，林建華.骨肉瘤中西醫(yī)結(jié)合治療研究進(jìn)展[J].甘肅中醫(yī).2009；19(3)：6-9

[2] 李洪倫，劉瑾瑜，等.八寶丹在惡性腫瘤治療中的應(yīng)用探索[J].2016；39(5)：383-385

[3] 徐秋萍，胡文靜，劉寶瑞.西黃丸抗腫瘤作用的研究現(xiàn)狀[J]. 2016；14(1)：32-35

[4] 吳 皓，李 鴻，祁 鑫，等.八寶丹對(duì)結(jié)腸癌荷瘤小鼠的血、脾和骨髓中的髓系抑制性細(xì)胞的影響[J].2014；29(2)：568-570

[5] 周 忠，林建華.八寶丹對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U-2OS的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2006，14(1)：93-95

[6] 金沈銳，祝彼得，秦旭華，等.西黃丸對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721及小鼠宮頸癌細(xì)胞 U14周期的影響[J].2007，18(11)：2782-2783

[7] 張宇靜，夏 晶，仇佳思，等.牛黃中膽汁酸的藥理作用及定量分析方法研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2016，43(2)：268-274.

本文編輯：羅 蘭

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ISSN.2095-8242.2017.12.2316.02

福建中醫(yī)藥大學(xué)校管科研課題項(xiàng)目(X2015003-平臺(tái)、X2015001-平臺(tái))。