抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu生物安全性初步研究

李抒縵， 許雄程， 鐘 泉， 陳 超， 駱 凱

引導骨組織再生術(guided bone regeneration，GBR)是指以膜材料作為屏障，阻止骨缺損周圍軟組織長入，為骨組織再生提供空間[1-3]。鈦網具有一定的機械性能，可持續為嚴重骨缺損部位提供穩定的骨生長空間，因而廣泛應用于臨床[4-7]。研究發現，由于鈦網等植入物表面吸附蛋白的存在，容易導致口腔致病菌黏附到植入物表面，引發局部感染，影響骨再生[8-9]。因此，在GBR治療時使用本身具有抑菌活性的材料具有重要的臨床意義。近年來，銅離子因其獨特的抗菌性能，常被用于制備具有抗菌活性的植入物材料[10]。研究表明，利用3D打印技術中的選擇性激光熔化技術(selective laser melting,SLM)制備含銅鈦合金材料Ti6Al4V-6Cu具有較強的抗菌性能[11]。本研究擬在其前期研究工作基礎上，通過體內、外實驗初步探討Ti6Al4V-6Cu的生物安全性，為將來利用3D打印制備具有抗菌性能的個性化鈦網應用于GBR提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1樣品 Ti6Al4V-6Cu由中科院海西研究院先進制造技術集成研究所利用SLM技術制備，規格為10 mm×10 mm×3 mm，主要成分:鋁:5.5～6.5 wt.%；釩:3.5～4.5 wt.%；銅:5.5～6.0 wt.%；碳:0～0.08 wt.%；鐵:0～0.25 wt.%；氧:0～0.31 wt.%；氮:0～0.05 wt.%；氫:0～0.12 wt.%；鈦:依據合金配平。

A：7～8為Ti6Al4V-6Cu；9～10為Ti6Al4V；B：體式顯微鏡下觀察結果.圖1 Ti6Al4V-6Cu肉眼及鏡下觀察Fig 1 The characterization of Ti6Al4V-6Cu

1.1.2細胞和動物 MC3T3-E1細胞(中國科學院上海生命科學研究院)；健康Wistar大鼠(南京軍區福州總醫院比較醫學科)；健康成年新西蘭大耳兔(南京軍區福州總醫院比較醫學科)。

1.1.3試劑 DMEM培養液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，美國Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(上海碧云天生物技術研究所)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；二甲基亞砜(美國Invitrogen公司)；MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，美國Sigma公司]；蘇木精(國藥集團化學試劑有限公司)；伊紅[中國醫藥(集團)上海化學試劑公司]；其他如丙酮、多聚甲醛、乙醇、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、二甲苯、氯仿、異丙醇、甲醛、冰醋酸、NaCl、KCl等為國產分析純試劑(分析純AR，汕頭市西隴化工有限公司)。

1.1.4儀器 HEAL FORCE超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；生物安全柜(力申科學儀器有限公司)；細胞培養箱(德國Heraeus公司)；全自動酶標儀(美國iMARK公司)；電熱恒溫水槽(DK-8D，上海精宏實驗設備有限公司)；倒置相差顯微鏡(廣州光學儀器廠)；倒置相差熒光顯微鏡(帶攝影系統)(日本Olympus公司)；電子天平(德國Sartorius公司公司)；臺式離心機(Labofuge 400R，德國Heraeus)；生物組織包埋機(宏業醫用儀器有限公司)；石蠟組織切片機(德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1材料浸提液的制備 參照文獻[12]方法，Ti6Al4V-6Cu材料經丙酮、無水乙醇、75%乙醇、三級水逐級超聲清洗、烘干、高溫高壓消毒。按材料表面積和浸提液介質3 cm2/mL的比例加入DMEM低糖培養液，取等體積DMEM低糖培養液作空白對照，置于細胞培養箱(37 ℃、體積分數為0.05的CO2)中浸提72 h備用。

1.2.2體外細胞毒性實驗 參照文獻[13]方法，將MC3T3-E1細胞懸液以每孔5×103個接種于96孔培養板(n=6)，細胞培養箱(37 ℃、體積分數為0.05的CO2)中培養。將材料浸提液按照100%，50%，25%，1%的濃度與DMEM低糖培養液進行配比，并使各濃度均含10%胎牛血清。陽性對照組為苯酚濃度6.4 g/mL的含10%胎牛血清的DMEM低糖培養液；陰性對照組為含10%胎牛血清的空白對照浸提液。24 h后細胞生長至近匯合。棄原培養液，各組加入96孔培養板中(200 μL/孔)，置于細胞培養箱中繼續培養。分別于培養后第1,3,5天采用MTT比色法檢測細胞的增殖能力，即取各組細胞各6孔，每孔加入200 μL新鮮配制5 g/L的MTT，37 ℃孵育4 h后小心吸棄各孔內培養液，每孔加入200 μL二甲基亞砜，低速震蕩10 min，酶標儀檢測各孔492 nm處光密度值(optical density，OD)。重復實驗3次。計算細胞相對增殖率(relative growth rate，RGR)：

RGR=(ODsample-ODblank)/(ODnegative-ODblank)×100%

其中，ODsample為實驗組；ODnegative為陽性對照組；ODblank為陰性對照組即空白對照浸提液組。細胞增殖百分率與毒性分級的對應關系為：增殖率≥100%為0級，75%～99%為1級，50%～74%為2級，25%～49%為3級，1%～24%為4級，0%為5級。0，1級反應為無毒性反應。

1.2.3短期全身毒性實驗 參照文獻[14]方法，選取130～150 g的健康Wistar大鼠20只，雌雄各半，隨機分為2組：實驗組以濃度為100%材料浸提液按5 mL/kg體質量的劑量對大鼠進行灌胃；用相同劑量的空白對照浸提液對對照組大鼠進行灌胃。每天灌胃1次，連續1周。灌胃結束后，相同環境下繼續常規飼養1周，每天觀察大鼠體征并稱體質量。同時計算各動物每周體質量相對增長率[體質量相對增長率(%)=體質量增長量/原始體質量×100%]。2周后，處死大鼠，解剖觀察大鼠心、肝、脾、肺、腎等重要臟器有無充血、出血、水腫或其他變化，并取肝、腎進行常規組織病理切片觀察。

1.2.4急性溶血實驗 參照文獻[16]，選取體質量 2.5～3 kg 健康成年新西蘭大耳兔耳緣靜脈采血8 mL，加入肝素鈉抗凝，用10 mL生理鹽水稀釋備用。實驗組按表面積與浸提液體積比為1.25 cm2/10 mL的標準，將待測樣品與適量生理鹽水混合，每組各3管。陰性對照組每管加10 mL生理鹽水，共3管；陽性對照組每管加10 mL超純水，共3管。37 ℃水浴30 min。每管加稀釋血0.2 mL，輕輕混勻后置于37 ℃水浴60 min。取各試管內液體3 000 r/min 離心 5 min，吸取上清200 μL于酶標儀檢測各組于492 nm 處OD。實驗重復3次。按下列公式計算溶血率：

1.3統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統計學處理，檢測結果采用單因素方差分析，以P<0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1體外細胞毒性試驗

2.1.1MC3T3-E1細胞生長情況觀察 MC3T3-E1細胞體外培養1 d時，鏡下可見實驗組、陽性對照組和陰性對照組中細胞的狀態已有明顯區別。不同浸提液濃度實驗組和陰性對照組中細胞幾乎全部貼壁，而陽性對照組中細胞大部分未貼壁。培養5 d時，鏡下觀察不同浸提液濃度實驗組和陰性對照組中的細胞，未發現明顯區別。浸提液各組和陰性對照組細胞數量均明顯增加，細胞伸展良好，呈橢圓形或梭形，細胞質飽滿，具有良好的折光性，還可見圓形的正在分裂的細胞；陽性對照組中大部分細胞未貼壁，細胞正常形態消失，可見部分細胞崩解，核固縮，細胞縮成小圓形漂浮在培養液中(圖2)。

2.1.2MTT檢測結果 細胞在培養1,3,5 d時，各不同浸提液濃度實驗組和陰性對照組比較，差別均無統計學意義(P>0.05)；不同浸提液濃度實驗組和陰性對照組OD值均明顯高于陽性對照組(P<0.05,圖3)。細胞毒性分級標準和評定結果見表2。根據公式計算出各組的RGR值，對照表1評定出各組的細胞毒性等級結果顯示各實驗組評定結果為合格(表2)。

A：100%材料浸提液組；B：陰性對照組；C：陽性對照組.圖2 培養5 d各組細胞的形態學觀察( ×40)Fig 2 The morphological observation of each group of cells cultured( ×40)

表1 細胞毒性分級標準和評定結果

2.2短期全身毒性試驗

2.2.1大鼠生長狀況觀察 實驗過程中，2組大鼠飲食均正常，生長狀態良好，行動反應敏捷，皮毛光亮，體質量增量正常，無暈厥、死亡等中毒反應。2組大鼠體質量相對增長率比較，差別無統計學意義(P>0.05，表3)。

表2 體外培養不同時間點各組細胞相對增值率及細胞毒性等級比較

RGR：細胞相對增殖率.

圖3 體外培養1,3,5 d各組細胞MTT檢測結果Fig 3 The parameters of MTT test of each group of cells cultured in vitro

Tab3The relative growth rate of weight of two groups of rats

分 組體質量相對增長率/%第1周第2周實驗組25.24±1.6816.87±2.50對照組18.04±6.5816.50±3.83

2.2.2大鼠肝、腎組織病理學觀察 2組大鼠處死后立即取出肝臟和腎臟進行肉眼觀察，可見2組大鼠的肝臟、腎臟顏色、大小無明星差異，無水腫和出血等異常病變；H-E染色后鏡下觀察肝臟和腎臟的組織切片，實驗組和對照組無顯著差異，未發現肝、腎細胞出現溶解、萎縮、變性、壞死等病理性變化(圖4,5)。

A:實驗組； B:對照組.圖4 大鼠肝臟組織學觀察 (H-E染色 ×40)Fig 4 The histological observation of livers of rats(H-E staining ×40)

A:實驗組；B:對照組.圖5 大鼠腎臟組織學觀察(H-E染色 ×40)Fig 5 The histological observation of kidneys of rats (H-E staining ×40)

2.3溶血試驗 實驗組即抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu的體外溶血率為2.50%，符合YY/T 0127.1-1993規定的溶血率<5%的標準，證明該材料無溶血反應(表4)。

3 討 論

近年來，生物醫用材料的研發日益成為材料學研究的熱點。由于生物醫用材料最終將植入人體內，因此對生物材料的生物安全性檢測顯得尤為重要。

表4 各組試管吸光度值檢測結果

體外細胞毒性試驗是醫療器械生物安全性評價中一項重要的評價項目，是國內外醫療器械生物學評價系列測試項目中的首選項目[16-17]。體外細胞毒性試驗方法有多種，包括：瓊脂覆蓋法、濾過法、同位素標記法、流式細胞術和色度法如四偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)等[18]。其中MTT法由于檢測時間較短，操作簡便，檢測成本低，無需復雜、昂貴的檢測設備等特點，成為近年來應用較為廣泛的細胞毒性評價方法。

將Ti6Al4V-6Cu樣品置于浸提介質(培養液)中一定時間后，材料中的元素會釋放到浸提介質中，利用該浸提液與受試細胞相互作用檢測細胞毒性。材料浸提液對細胞增殖的影響，可反映出金屬材料是否對細胞具有毒性[12,19]。本研究鏡下觀察結果顯示：不同濃度材料浸提液組中MC3T3-E1細胞在1 d時就已貼壁生長，但尚未完全伸展。培養3～5 d時細胞完全伸展，胞體呈圓形或橢圓形，細胞質飽滿，有良好的折光性，生長旺盛，可見圓形的分裂細胞，細胞數量與陰性對照組試驗結果相同。統計結果顯示：MC3T3-E1細胞在1%,25%,50%及100%四個不同濃度的抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu浸提液中培養1～5 d后，細胞相對增殖率與陰性對照組比較，差別無統計學意義。上述結果表明，利用SLM技術制備的抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu無細胞毒性。

GBR中所使用的屏障膜需要在口腔內存留一定的時期，因此需要對植入材料進行全身毒性實驗以評價材料的生物安全性。本研究選擇將制備的材料浸提液通過灌胃方法對鈦合金Ti6Al4V-6Cu的短期全身毒性進行評價。結果表明，與對照組比較，采用Ti6Al4V-6Cu浸提液對大鼠灌胃，大鼠生長狀態良好，體質量增量正常，飲食正常，活動靈敏反應迅速，無中毒癥狀出現。2組大鼠的肝臟和腎臟組織學染色后未見明顯的病理性變化。該結果提示，Ti6Al4V-6Cu無短期細胞毒性。

GBR中使用的屏障膜材料在植入后包繞在血液中，并在植入期內持續與血液相互作用。因此，植入材料的組成成分、結構和理化性質對血液的影響至關重要[20-21]。血液相容性試驗是針對與循環血液接觸的醫療器械而進行的一系列生物學評價，用于評價醫療器械和血液的相互作用[22]。正常情況下紅細胞與血漿等滲，出入紅細胞內的水分維持平衡；當血漿滲透壓低于紅細胞內滲透壓時，過量的水分進入紅細胞，造成紅細胞膨脹甚至破裂，血紅蛋白逸出進入血漿即表現為溶血。造成溶血的原因有機械力如壓力、流變、生物毒素以及各種生化方面的因素[23]。溶血可導致重要臟器血栓形成，進而對這些臟器造成繼發損害。作為血液相容性試驗中的一個重要評價指標，凡是與循環血液接觸的醫療器械都有必要進行溶血實驗。本實驗采用體外間接法檢測抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu材料浸提液的溶血作用。結果顯示，新型抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu溶血率為2.50%，符合國家標準(溶血率<5%)，提示Ti6Al4V-6Cu具有較佳的血液相容性。

本研究通過體外細胞毒性試驗、短期全身毒性實驗和溶血實驗對抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu的生物安全性進行了初步評價，結果初步證實SLM技術制備的抗菌鈦合金Ti6Al4V-6Cu具有良好的生物安全性，后續還將對該材料的生物相容性做進一步的研究，以利于材料最終應用于臨床。

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