載紫杉醇聚合物膠束的制備工藝優化

魏淑明, 范清英, 宋 煜

紫杉醇(paclitaxel,PTX)是首個從天然植物中分離出來的抗癌藥，在臨床上廣泛應用于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等[1-3]。但由于PTX在水中的溶解度極低(<1 μg/mL)[4]，導致其口服吸收差，且PTX在體內不能專一作用于腫瘤細胞，對正常細胞也有殺傷毒性。目前國內上市應用的均為注射劑，常用制劑Taxol?采用聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇助溶，增加溶解度的同時也帶來了毒性、高敏性等不良反應[5]，從而使臨床治療受到限制。近年新上市的PTX新制劑，較傳統注射劑Taxol?雖能降低或去除過敏反應、減小藥物毒副作用，但在提高腫瘤靶向性及耐受劑量方面仍表現不足。因此，制備合適的載體，增加PTX的溶解度，改善靶向性，降低給藥系統的毒性，是需要解決的問題。

普通納米藥物載體可以在一定程度上提高藥物的水溶性，并通過EPR效應靶向于腫瘤細胞，但在實際應用中到達靶位的效果并不理想。若能結合腫瘤特異性靶向策略，則藥物靶向腫瘤的能力能進一步提高。透明質酸(hyaluronic acid，HA)是一種對腫瘤細胞具有高親和性的天然高分子材料，可以與癌細胞細胞膜上的受體如CD44蛋白結合，因而HA及其衍生物被廣泛用于抗腫瘤藥的靶向遞送體系的研究中，在增加藥物溶解度及提高靶向性上具明顯優勢[6]。甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)為甘草的主要成分，具有抗病毒、促進細胞凋亡等多種的藥理學活性[7]，同時，Negishi等證實肝實質細胞膜組分中含有大量GA特異結合位點[8]，使得GA及其衍生物具有肝靶向性[9]。可以推測，以HA與GA兩者結合的GA(HSG)偶聯物載體若能順利包載PTX制納米膠束制劑，在體內遞送中可以利用EPR效應的被動靶向、腫瘤細胞CD44受體和GA受體發揮協同主動靶向等多種靶向機制來增加PTX在腫瘤部位尤其是肝的靶向蓄積作用，從而提高治療指數，減少不良反應。筆者以HSG偶聯物為載體材料，制備載PTX的PTX/HSG聚合物膠束，優化HSG偶聯物對PTX的載藥能力，并考察其穩定性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 HSG偶聯物(實驗室自制)；透析袋(批號：151220，上海市綠鳥科技發展有限公司)；PTX原料藥(批號：902-1308001，福建南方制藥股份有限公司)；PTX標準品(批號：100382-201603，純度99.9%，中國食品藥品檢定研究院)；水為蒸餾水；其它試劑均為分析純。

1.1.2儀器 超聲波細胞粉碎機(JY92-2D，寧波市芝生物科技股份有限公司)；激光粒徑測定儀(NICOMPTM380ZLS，美國Santa Barbara公司)；高效液相色譜儀(LC-20AT，日本島津公司)；雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司)；透射電子顯微鏡(H7650，日本日立公司)。

1.2方法

1.2.1包封率和載藥量的測定

1.2.1.1檢測波長的確定 精密稱取適量PTX標準品，甲醇溶解、配制溶液，按照《中國藥典》2015年版附錄中紫外分光光度法，以甲醇為空白溶液，在200～500 nm波長范圍內進行紫外掃描，確定檢測波長。

1.2.1.2色譜條件 色譜柱：Diamonsil?Platisil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(75∶25，V/V)；流速：1 mL/min；檢測波長：227 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.2.1.3標準曲線制備 精密稱取PTX 10 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，得200 μg/mL的儲備液。逐步稀釋配制濃度分別為20，10，5，2，1，0.5 μg/mL的PTX溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣，按1.2.1.2項色譜條件下測定，記錄峰面積A。以峰面積(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程。

1.2.1.4回收率 配制高、中、低(20，5，0.5 μg/mL)3種濃度的PTX標準溶液，加入偶聯物，按1.2.1.2項色譜條件測定并計算回收率。

1.2.1.5精密度 配制高、中、低濃度(分別為20，5，0.5 μg/mL)的PTX標準溶液，在同1天內連續進樣5次及連續5 d進樣測定并計算日內精密度、日間精密度。

1.2.1.6供試品溶液的制備及包封率和載藥量測定 將PTX/HSG聚合物膠束溶液3 000 r/min離心15 min，得上清液過濾，取濾液100 μL置10 mL容量瓶中用甲醇稀釋至刻度，過0.45 μm濾膜，取續濾液按1.2.1.2項色譜條件測定并計算載入膠束中的PTX量。按以下公式計算包封率(encapsulation efficiency,EE)、載藥量(drug loading,DL):

1.2.2載藥工藝考察

1.2.2.1載藥方法篩選

1.2.2.1.1直接溶解法 精密稱取18 mg的HSG偶聯物于西林瓶中，加蒸餾水3 mL溶解，加入PTX藥物粉末10 mg，在磁力攪拌器上劇烈攪拌15 min，然后于冰浴下探頭超聲30 min后用蒸餾水透析過夜。透析袋中倒出膠束溶液，3 000 r/min離心15 min，上清液過0.8 μm濾膜過濾，即得PTX/HSG聚合物膠束溶液。

1.2.2.1.2乳化法 精密稱取18 mg的HSG偶聯物于西林瓶中，加蒸餾水3 mL溶解，逐滴滴加濃度為25 mg/mL的PTX的二氯甲烷溶液400 μL于上述載體溶液中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌15 min，然后于冰浴下探頭超聲30 min后室溫敞口攪拌過夜，膠束溶液3 000 r/min離心15 min，上清液過0.8 μm濾膜過濾，即得PTX/HSG聚合物膠束溶液。

1.2.2.1.3透析法 精密稱取18 mg的HSG偶聯物于西林瓶中，加蒸餾水3 mL溶解，逐滴滴加濃度為25 mg/mL的PTX的乙醇溶液400 μL于上述載體溶液中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌15 min。然后于冰浴下探頭超聲30 min后用蒸餾水透析過夜。透析袋中倒出膠束溶液，3 000 r/min離心15 min，上清液過0.8 μm濾膜，即得PTX/HSG聚合物膠束溶液。

1.2.2.2藥載比的篩選 通過1.2.2.1項實驗，在得出最適合的載藥方法的情況下，暫設載體濃度為6 mg/mL,超聲時間為30 min,考察HSG∶PTX (w/w)比例分別1.8∶1，1.6∶1，1.3∶1，1∶1時HSG偶聯物的載藥情況，篩選出最佳藥載比。

1.2.2.3載體濃度的影響 固定其他變量，考察不同載體濃度(4，6，8 mg/mL)對HSG偶聯物増溶PTX的影響。

1.2.2.4超聲時間的影響 固定其他變量，考察不同超聲時間(20，30，40，50 min)對HSG偶聯物載藥能力的影響。

1.2.2.5優化條件的驗證 按照優化后的處方工藝制備3批PTX/HSG載藥膠束,以包封率、粒徑等為指標驗證載藥工藝。

1.2.3形態學研究 取載藥膠束溶液，滴至覆有碳支持膜的銅網上，停留2 min，以濾紙吸去多余溶液，滴加2%的磷鎢酸溶液負染2 min，自然干燥，透射電鏡(transmission electron micros cope,TEM)觀察PTX/HSG載藥膠束粒徑大小及粒子形態。

1.2.4穩定性的考察 將PTX/HSG聚合物膠束溶液置4 ℃冰箱儲存，10 d內測定其粒徑、載藥量與包封率，以包封率、粒徑等為指標判斷PTX/HSG聚合物膠束是否發生聚集。

2 結 果

2.1PTX檢測波長的確定 通過紫外分光光度計波長掃描可得，PTX的最大吸收波長為227 nm，由此確定PTX醇的色譜檢測波長為227 nm。

2.2標準曲線及線性范圍 對不同濃度(C)的PTX溶液所得的峰面積(A)進行線性回歸，得到回歸標準曲線A=38 676C-1 387.5(r=0.999 9)，結果表明，在0.5～20.0 μg/mL范圍內線性良好，符合定量檢測要求。

2.3回收率及精密度 高、中、低3個濃度水平的PTX樣品的回收率與精密度良好，符合含量測定方法學要求(表1)。

2.4載藥工藝的考察

2.4.1載藥方法篩選 通過直溶法與乳化法制備的PTX/HSG膠束包封率低且粒徑大，使用透析法制備的載藥膠束具有較高的包封率而且粒徑與多分散指數(polydispersity index，PI)小,因此透析法是更適合HSG偶聯物載藥的方法(表2)。

表1回收率與精密度實驗結果

Tab1Recovery and precision of the experimental results

ρ理論值(μg·mL-1)平均回收率%日內精密度RSD%日間精密度RSD%0.5100.4±1.61.61.8599.9±0.80.80.92099.9±0.20.20.2

n=3. RSD：相對標準偏差.

表2 不同載藥方法對載藥膠束粒徑及包封率等的影響

n=3. PI：多分散指數；Zeta：Zeta電位.

2.4.2藥載比的篩選 藥載比PTX∶HSG由1∶1.8增至1∶1.3時，PTX投入量越多，載藥膠束的載藥量及包封率逐漸提高，而載藥膠束粒徑變化卻不明顯。但當藥載比達1∶1時，載藥量雖然仍在提高但包封率卻在下降，而且此時的粒徑也明顯變大，說明HSG膠束對PTX的載藥能力已經達到飽和。而藥載比為1∶1.3時，載藥膠束有較高的載藥量與包封率。因此，綜合以上數據可以得出：藥載比PTX∶HSG=1∶1.3為最佳藥載比(表3)。

2.4.3載體濃度的影響 載體濃度大小影響聚合物膠束的載藥量、包封率及粒徑。當載體濃度為6 mg/mL時，載藥膠束的載藥量及包封率顯著優于其它濃度，且粒徑較小,故選擇6 mg/mL作為載藥工藝中載體的濃度(表4)。

表3 不同藥載比對載藥膠束粒徑及包封率等的影響

n=3. PTX:紫杉醇； HSG：透明質酸-甘草次酸； PI：多分散指數； Zeta：Zeta電位.

表4 不同載體濃度對載藥膠束粒徑及包封率等的影響

n=3. HSG：透明質酸-甘草次酸； PI：多分散指數； Zeta：Zeta電位.

2.4.4載藥超聲時間的影響 超聲時間的長短對載藥膠束的載藥量與包封率影響并不大，但卻能影響載藥膠束的粒徑。超聲時間太短(20 min)，載藥粒徑偏大。而超聲時間達30 min，至此過后延長超聲時間，粒徑不再有太大變化。綜合上述結果且為節省時間，最終選擇載藥超聲時間為30 min(表5)。

2.4.5優化條件的驗證 按照篩選出的最佳載藥工藝制備3批PTX/HSG載藥膠束(表6)，平均載藥量為(38.63±0.42)%，平均包封率為(83.19±1.23)%，平均粒徑為(192.2±0.5)nm，重現性良好。

表5 不同載藥超聲時間對載藥膠束粒徑及包封率等的影響

n=3. PI：多分散指數；Zeta：Zeta電位.

表6 優化條件的驗證結果

PI：多分散指數；Zeta：Zeta電位.

2.5形態學研究 TEM圖可以看出，PTX/HSG載藥膠束呈近球形，粒徑在190 nm左右，粒徑分布較均勻(圖1)。

TEM：透取電鏡.圖1 PTX/HSG膠束TEM圖Fig 1 TEM image of PTX/HSG micelles

2.6穩定性的考察 PTX/HSG聚合物膠束10 d內粒徑略有增加，載藥量與包封率有所降低，但未發生明顯變化(表7),說明10 d內PTX/HSG聚合物膠束避光4 ℃條件下在水溶液中較穩定，膠束并未發生聚集。

3 討 論

包封率和載藥量是評價聚合物膠束制備工藝的重要指標。測定包封率的關鍵就是將被包封藥物與游離藥物分離，常用的有超濾法、透析法和反透析法等[10-11]。本研究采用離心(3 000 r/min,15 min)過膜(0.8 μm微孔濾膜)的方法來分離游離PTX。由于聚合物膠束將疏水性藥物包封于其疏水內核，在測定包封藥物時必須將藥物完全釋放出來。根據PTX和HSG載體的溶解特性，本研究采用甲醇作為破乳劑。

表7 PTX/HSG膠束的儲存穩定性

PTX:紫杉醇； HSG：透明質酸-甘草次酸; PI：多分散指數；Zeta：Zeta電位； PI：多分散指數.

聚合物膠束的載藥方法有很多，在實際應用過程中，應當根據藥物以及聚合物的理化性質，以及制備膠束的特點等因素選擇合適的制備方法。因為其他的制備方法如化學結合法與靜電作用對載體及藥物的要求比較多，這也大大限制了這兩種方法的應用，故本研究在載藥方法的篩選中只考慮物理法。

聚合物膠束在4 ℃的環境中短期儲存較穩定，推測若長期在水性環境中保存，可能發生藥物聚集、融合、藥物滲漏等，導致藥物穩定性變差、貯存期短，不能滿足臨床使用對藥物制劑穩定性的要求，而將聚合物膠束制成凍干粉可有效解決此類問題，今后課題組將對凍干工藝進行研究。

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