玳玳果降脂提取物中大孔吸附樹脂有機殘留量的頂空氣相色譜分析研究

馬國萍， 陳 丹， 黃 群， 謝 平， 朱仙慕， 黃 嬌， 查珍珍

玳玳(CitrusaurantiumL.vardaidaiTanaka)屬蕓香科柑桔亞屬植物，為酸橙的變種，藥食同源。玳玳性微寒，味苦、酸，具有疏肝和胃、理氣止痛、行氣寬中、消食化痰之功效[1-2]。課題組前期研究表明，閩產玳玳果中含有黃酮、生物堿、揮發油等化學成分[3-5]，采用已獲國家發明專利授權的工藝制備的玳玳果黃酮有效部位玳玳果黃酮降脂提取物具有良好的降脂抗氧化作用，提取物總黃酮含量>80%；玳玳果黃酮降脂提取物的純化工藝運用了AB-8大孔吸附樹脂分離[6-10]。根據國家食品藥品監督管理局對大孔樹脂最新規定，凡在生產工藝中使用過大孔吸附樹脂的制劑或原料，應對其可能引入的單體(苯乙烯)、交聯劑(二苯乙烯)及致孔劑(烴類)等控制其殘留量。因此，為確保產品玳玳果降脂提取物的質量安全穩定，本研究擬建立玳玳果降脂提取物中檢測大孔吸附樹脂6種有機殘留物苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯、苯乙烯、正己烷的頂空氣相色譜法，并在已建立的色譜條件下，檢定3批玳玳果降脂提取物大孔樹脂的有機溶劑殘留量，為完善玳玳果降脂提取物質量控制方法奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 氣相色譜儀(Agilent 6890N)，氫火焰檢測器(FID，Agilent 6890N)，Agilent 6890N色譜工作站均為美國安捷倫科技公司。

1.1.2試藥 苯乙烯對照品(standard for GC，>99.5%,上海麥克林生化科技有限公司)；二乙烯苯對照品(≥99.5%，國藥集團化學試劑有限公司)；苯對照品(≥99.5%)、甲苯對照品(≥99.5%)、二甲苯對照品(≥99.5%)，均為上海聯試化工試劑有限公司；正己烷對照品(≥98.0%，國藥集團化學試劑有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，天津市致遠化學試劑有限公司)；雙蒸水(自制)；玳玳果降脂提取物(自制，批號20170324，20170325，20170326)。

1.2方法

1.2.1色譜條件與系統適用性試驗 頂空進樣系統程序升溫法；色譜柱DB-WAX石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID檢測器，溫度230 ℃，進樣口溫度210 ℃；程序升溫：柱溫在70 ℃維持8 min，再以10 ℃/min的升溫速率升至160 ℃，再以30 ℃/min的速率，繼續升溫至220 ℃，恒溫3 min；以氮氣為載氣，流速為3.0 mL/min；尾吹氣50 mL/min；空氣300 mL/min；氫氣30 mL/min；進樣量50 μL，不分流進樣；頂空平衡溫度90 ℃，平衡時間30 min。在上述色譜條件下，檢測苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷各成分是否分離完全。

1.2.2供試品溶液的制備 精密稱取玳玳果降脂提取物粉末約0.8 g，置20 mL頂空瓶中，精密加入2.0 mL DMF溶解，密封瓶口，搖勻，即得。

1.2.3混合對照品溶液的制備 精密稱定苯乙烯、二乙烯苯、苯、甲苯、二甲苯、正己烷對照品適量，分別放置于10 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液(苯8.297 mg/mL,甲苯58.715 mg/mL，二甲苯66.484 mg/mL，正己烷53.665 mg/mL，苯乙烯47.077 mg/mL，二乙烯苯114.448 mg/mL)。

分別精密吸取苯乙烯對照品儲備液3.0 mL，二乙烯苯對照品儲備液8.0 mL，苯對照品儲備液4.0 mL，甲苯對照品儲備液3.0 mL，二甲苯對照品儲備液2.5 mL，正己烷對照品儲備液6.5 mL，于50 mL量瓶中，加DMF稀釋至刻度，搖勻，再從中精密吸取290 μL，于25 mL量瓶中加DMF稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.4標準曲線制備及線性關系考察 精密量取混合對照品溶液185，300，600，900，1 200，1 500，1 800 μL，放置于5 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，并分別精密量取2.0 mL置于20 mL頂空瓶中，密封瓶口，搖勻，測定。以峰面積為縱坐標Y，質量濃度為橫坐標X(μg/mL)，進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.2.5檢測限(limit of detection, LOD)及定量限(limit of quantitation, LOQ)考察 將苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯、正己烷各對照品儲備液分別逐步稀釋，按照對照品溶液色譜圖中的各成分峰高折算，直到檢測峰高為基線噪聲的3 倍左右為止(即S/N=3)，計算各個成分的最低檢測限。當檢測峰高為基線噪聲的10 倍左右(即S/N=10)，計算各成分的最低定量限。

1.2.6精密度試驗 分別精密量取同一份混合對照品溶液2 mL，共6 份(每1 mL含正己烷0.598 μg，苯0.924 μg，甲苯4.904 μg，二甲苯4.627 μg，苯乙烯3.932 μg，二乙烯苯25.490 μg)，置于20 mL頂空進樣瓶中，密封瓶口，搖勻，按1.2.1項方法操作，測定，記錄各個有機殘留溶劑的峰面積，計算RSD。

1.2.7重復性試驗 分別精密稱取同一批(批號20170324)的玳玳果降脂提取物粉末約0.8 g，6 份，按1.2.2及1.2.1項方法操作，檢測各有機殘留組分，計算含量及RSD值。

1.2.8加樣回收率試驗 分別精密稱取同一批(批號20170324)已知含量的玳玳果降脂提取物粉末約0.4 g，共6 份，加入混合對照品溶液(每1 mL含正己烷1.809 μg；苯0.732 μg；甲苯4.781 μg；二甲苯4.237 μg；苯乙烯4.926 μg；二乙烯苯58.60 μg)2.0 mL，按1.2.2及1.2.1項方法操作，測定，記錄各有機殘留溶劑的峰面積，計算各有機溶劑的平均回收率。

1.2.9樣品測定 取3批玳玳果降脂提取物(批號20170324，20170325，20170326)，分別精密稱取玳玳果降脂提取物粉末約0.8 g，每批3 份，按1.2.2及1.2.1項方法操作，測定，計算各批大孔吸附樹脂有機殘留量。

2 結 果

2.1標準曲線的制備及線性關系考察 大孔吸附樹脂各殘留有機溶劑標準曲線回歸方程及線性范圍見表1，圖1。結果表明，大孔吸附樹脂各殘留有機溶劑在范圍內線性關系良好。

A:正己烷； B:苯； C:甲苯； D:二甲苯； E:苯乙烯； F:二乙烯苯.圖1 大孔吸附樹脂各殘留有機溶劑標準曲線圖Fig 1 Standard curves of residual organic solvents in macroporous adsorption resins

2.2LOD及LOQ考察 各個成分的最低LOD分別為苯6.26 ng(S/N=3.3)，甲苯14.74 ng(S/N=3.6)，二甲苯14.63 ng(S/N=2.5)，苯乙烯25.26 ng(S/N=3.8)，二乙烯苯190.61 ng(S/N=2.9)，正己烷93.44 ng(S/N=3.1)。

各成分的最低LOD分別為苯12.53 ng(S/N=11.6)，甲苯59.25 ng(S/N=12.8)，二甲苯58.37 ng(S/N=11.5)，苯乙烯50.25 ng(S/N=10.4)，二乙烯苯383.53 ng(S/N=9.4)，正己烷124.58 ng(S/N=10.2)。

2.3精密度試驗 同一份混合對照品溶液連續測定6次，測定各有機殘留溶劑的峰面積值的相對標準偏差RSD為4.21%～6.47%，均<10.0%，精密度符合要求(表2)。

2.4重復性試驗 以正己烷殘留組分量為檢測評價指標，測得其平均含量0.006 589%(RSD=2.52%，n=6)，方法重復性良好(表3)。

表1 殘留有機溶劑含量測定線性范圍及回歸方程

表2 各有機殘留組分精密度試驗峰面積結果

表3 有機殘留組分重復性試驗結果

2.5加樣回收率試驗 建立的玳玳果降脂提取物中大孔吸附樹脂6 種有機殘留物苯、甲苯、二甲苯、二乙烯苯、苯乙烯、正己烷含量測定方法，準確度良好。結果表明，各殘留有機溶劑加樣回收率均符合《中國藥典》(2015年版)四部對殘留溶劑測定法項下的規定，即RSD不大于10%的要求[11](表4)。

2.6樣品測定 3批玳玳果降脂提取物樣品中均檢測出正己烷成分，其質量分數分別為0.000 693%，0.000 671%和0.000 687%，均符合《中國藥典》(2015年版)四部殘留溶劑測定法項下正己烷殘留限度不得超過0.029%的規定[11]，未檢出苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等(表5，圖2)。

3 討 論

大孔吸附樹脂技術在中藥分離純化中起著重要的作用，樹脂表面和孔隙中未聚合的單體(苯乙烯)、交聯劑(二乙烯苯)及致孔劑(烴類)，在生產過程中被帶入藥品中會影響藥品和食品的安全性。ICH(藥品注冊的國際技術要求)規定溶劑殘留限度苯為不得超過0.000 2%，甲苯0.089%，二甲苯0.217%，正己烷0.029%，對苯乙烯、二乙烯苯未明確[12]。參考國家食品藥品監督管理局《大孔吸附樹脂分離純化中藥提取液的技術要求(暫行)》及補充說明，將殘留物的限度定為每克樣品含苯不得超過2 μg，含正己烷、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯均不得超過20 μg。

表4 加樣回收率試驗結果

表5 樣品測定結果

A:對照品溶液； B:空白溶液； C:樣品溶液. 1:正已烷； 2:苯； 3:甲苯； 4:二甲苯； 5:苯乙烯； 6:二乙烯苯； 7:N,N-二甲基甲酰胺.圖2 玳玳果降脂提取物樹脂殘留物氣相色譜圖Fig 2 Resin residue gas chromatogram

頂空氣相色譜法采用氣體直接進樣的方式，無需有機溶劑提取，從而避免了在直接液體或固體取樣時，復雜樣品基體成分一起被帶入分析系統的可能性，由此消除了由基體成分的帶入而對樣品中可揮發性成分分析所造成的影響和干擾，對色譜柱污染小，得到的譜圖簡單。實驗采用頂空氣相色譜法檢測玳玳果降脂提取物大孔吸附樹脂有機殘留物，結果表明，該提取物中均未檢出苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯等有機溶劑，檢測出的正己烷的殘留量不超過0.029%，均符合要求。因此，采用課題組已獲國家發明專利授權的方法以AB-8大孔吸附樹脂純化制備玳玳果降脂提取物工藝是安全的。

二甲苯、二乙烯苯是性質不穩定容易發生聚合的復雜混合物，在色譜圖中可表現有3,6個色譜峰，分別為其各自鄰、間、對位異構體的色譜峰。因無法得到其單一成分的對照品，所以在實驗中以其相應峰面積和定量，并以其中含量最大組分的LOD作為各自的LOD。大孔吸附樹脂殘留溶劑允許限度較低，實驗中配制的對照品溶液濃度較低，建立的玳玳果降脂提取物大孔吸附樹脂有機殘留量檢測方法在精密度試驗、重復性試驗及加樣回收率試驗等方法學考察結果，均符合《中國藥典》(2015年版)四部對殘留溶劑測定法項下的規定，即RSD不大于10%的要求。

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