大鼠蛛網膜下腔出血后海馬區磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2表達與細胞自噬的關系

安朝旺， 劉 瑤， 任藝藝， 李建民， 孫竹梅， 趙雅寧

細胞外調節蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)是有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族成員之一，活化后經多級激酶的級聯反應把細胞外刺激信號向細胞內傳遞，引起下游轉錄因子活化，從而調控細胞的存活與死亡。多種中樞神經疾病(如腦卒中、腦創傷、阿爾茨海默病等)的患者腦內均可檢測到激活的ERK1/2(即磷酸化ERK1/2)，是神經細胞存活的調控靶點之一[1-3]。

自噬是細胞通過溶酶體途徑對功能受損的白質和細胞器進行識別、降解和修復的現象，對維持細胞內環境的平衡起到不可忽視的作用，決定了細胞的轉歸——恢復、修復、損傷、加重或死亡[4]。自噬被證實廣泛存在于缺血、缺氧性腦血管疾病中。本課題組前期的研究也發現，蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)的病理過程中伴隨自噬的發生，提高自噬程度可降低SAH后早期腦損傷(early brain injury, EBI)的神經細胞死亡率，促進神經功能恢復[5]。本研究建立大鼠SAH模型，應用高、低劑量的ERK1/2抑制劑(U0126)進行干預，觀察海馬區p-ERK1/2、自噬關鍵因子Beclin-1和微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3-Ⅱ)的表達以及神經細胞的存活情況等，探討SAH后ERK1/2激活與神經細胞自噬的關系，為SAH后EBI的早期救治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級雄性SD大鼠144只，體質量350～450 g[北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK(京)2009-003]。p-ERK1/2兔多克隆抗體(美國BD公司)；LC3-Ⅱ兔多克隆抗體(日本MBL公司)；Beclin-1兔多克隆抗體(美國Affinit公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型制作 將120只大鼠分為假手術組(Sham組)、蛛網膜下腔出血組(SAH組)、低劑量U0126組(LU0126組)、高劑量U0126組(HU0126組)。每組又根據造模成功后6，24，72 h分別分為3個亞組。模型制作過程中，SAH組死亡7只，1只模型不符合標準被剔除；LU0126組和HU0126組分別死亡6只，各有2只模型不符合標準被剔除。死亡和剔除大鼠共24只，均依次補齊，最終每組30只大鼠納入統計學分析。采用經典的自體血二次枕大池注血法(向枕大池注射自體動脈血0.3 mL，2次注血間隔48 h)制備SAH大鼠模型[6]。Sham組向枕大池注入0.3 mL等滲生理鹽水2次，余操作均與SAH組一致。LU0126組和HU0126組分別于造模前30 min側腦室注射U0126(分別為每只5，10 g/L)，再制備SAH模型。模型判定標準：(1)第2次枕大池注血時，在穿刺部位可見少量血性腦脊液滲出，說明穿刺針位置準確；(2)剝離腦組織時，肉眼可見腦底基底池部位有顯眼的血性液體散在分布，或光鏡下見蛛網膜下腔有明顯血性液體(圖1)。

A：Sham組；B：SAH組,蛛網膜下腔有明顯血性液體.圖1 SAH動物模型的判定(H-E染色 ×200)Fig 1 Determination of SAH animal model(H-E ×200)

1.2.2水迷宮實驗測試行為學表現 參照文獻[7]的方法進行水迷宮實驗。將受試大鼠按順時針方向依次由第一、二、三、四象限頭面向水迷宮桶池壁放入水中，迷宮系統追蹤并記錄造模成功72 h后的大鼠90 s內找到并成功爬上平臺的時間，即逃避潛伏期，以大鼠停留平臺10 s以上為記錄標準。同時，觀察并記錄大鼠穿越原平臺的次數，即撤去水中隱匿平臺后，依次從第一、二、三象限入水點將造模成功72 h后的大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠穿越原平臺的次數。

1.2.3腦組織海馬區形態結構觀察 各組于各時間點分別取5只大鼠，常規麻醉后處死；4%多聚甲醛灌注固定后，留取視交叉平面至大腦橫裂腦組織。經石蠟包埋、冠狀切片(片厚5 μm)后，進行H-E染色。用帶有測微尺的光學顯微鏡(40×10)計數海馬區存活神經元的數量，每只動物取5張海馬CA1區切片，每張切片選取4個不重復的視野，即每組有100個視野。采用Motic-6.0圖像采集及分析系統計算每個視野的存活神經元數(有明顯細胞膜、細胞核、核仁為存活神經細胞)。

神經元存活率=存活的神經元數/神經元總數

1.2.4免疫組織化學法和Western-blot檢測海馬區p-ERK1/2，Beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白表達

1.2.4.1免疫組織化學法 標本采集同1.2.3，切片常規脫蠟至去離子水、滴加復合消化液、37 ℃溫箱孵育20 min，PBS洗滌3 次，每次5 min；3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶15 min，PBS洗滌3次；滴加兔抗鼠p-ERK1/2,Beclin-1和LC3-Ⅱ多克隆抗體(1∶200，1∶250，1∶250)，4 ℃過夜；37 ℃復溫45 min，PBS洗滌，滴加生物素化二抗；37 ℃孵育40 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精輕度復染、脫水透明、封片。每張切片在海馬CA1區隨機選取3～5個視野，光學顯微鏡(40×10)下觀察免疫陽性產物細胞的定位情況。結果判斷以胞核呈棕黃色為陽性結果。

1.2.4.2Western-blot法 各組于各時間點分別取5只大鼠，按規定的時間點處死后，快速斷頭取腦，用冰箱中預冷的器械在冰上分離出雙側海馬組織，稱量0.6 g，加入裂解液，冰浴中勻漿，4 ℃離心5 min，3 000 r/min。取上清，考馬斯亮藍法蛋白質定量，樣品制備，轉膜、加入抗體(p-ERK1/2為1∶1 000，Beclin-1和LC3-Ⅱ為1∶1 500，β-actin為1∶2 000)、室溫孵育2～3 h，加入二抗、封閉，ECL顯色。Bio-Rad系統測定吸光度，以目的條帶與內參照β-actin的平均吸光度的比值表示蛋白水平。

各因子的灰度值=目的因子灰度值/內參的平均灰度值

2 結 果

2.1水迷宮檢測結果 與Sham組比較，SAH組大鼠在造模成功72 h后的逃避潛伏期明顯延長、穿臺次數明顯減少(P<0.05)；與SAH組比較，LU0126和HU0126組大鼠相應時間點的逃避潛伏期明顯延長、穿臺次數明顯減少(P<0.05)；與LU0126組比較，HU0126組大鼠相應時間點的逃避潛伏期明顯延長、穿臺次數明顯減少(P<0.05)(表1,圖2)。

2.2H-E染色結果 Sham組海馬區神經細胞排列整齊、細胞形態結構正常，神經元胞體較大，胞核大而圓，核仁清晰。SAH組于造模成功6 h時海馬區可見神經細胞變性水腫，細胞輪廓模糊；24 h時可見死亡神經細胞，表現為細胞出現核溶解、核碎裂或核消失、結構不清，神經元結構松散，呈三角形，細胞核固縮，出現胞核消散征象；72 h時腦組織構造被破壞，核膜碎裂、核仁消散。與Sham組比較，SAH組各時間點神經元存活比率均明顯降低(均為P<0.05)；LU0126和HU0126組神經細胞形態結構損傷進一步加重，視野中存活神經細胞數量降低，與SAH組比較，各時間點神經元存活比率均明顯降低(均為P<0.05)；與LU0126組比較，HU0126組各時間點神經細胞存活比率均明顯降低(均為P<0.05，表2，圖3)。

表1各組大鼠水迷宮潛伏期和穿臺次數的比較

Tab1Comparison of the incubation period and the number of times in the water-maze test in rats of each group

分 組t潛伏期/sn穿臺次數Sham組21.12±0.1411.67±2.40SAH組60.14±1.34☆7.88±2.08☆LU0126組72.88±8.62★5.95±1.78★HU0126組84.98±1.56★◇3.27±1.52★◇

n=10. Sham：假手術；SAH：蛛網膜下腔出血； LU0126：蛛網膜下腔出血+低劑量ERK1/2抑制劑；HU0126：蛛網膜下腔出血+高劑量ERK1/2抑制劑. 與Sham組比較，☆：P<0.05；與SAH組比較，★：P<0.05；與LU0126組比較，◇：P<0.05.

表2各組大鼠海馬CA1區存活神經細胞率比較

Tab 2 Comparison of neural cell survival rate in hippocampual CA1 region of each group %

n=15. Sham：假手術；SAH：蛛網膜下腔出血；LU0126：蛛網膜下腔出血+低劑量ERK1/2抑制劑；HU0126：蛛網膜下腔出血+高劑量ERK1/2抑制劑. 與Sham組比較，☆：P<0.05；與SAH組比較，★：P<0.05；與LU0126組比較，◇：P<0.05.

A：Sham組；B：SAH組；C：LU0126組；D：HU0126組.圖2 各組大鼠在72 h水迷宮實驗的運動軌跡Fig 2 The trajectories of rats in each group in 72 h water maze test

A：Sham組細胞形態結構正常； B：SAH組核膜碎裂、核仁消散； C：LU0126組存活神經細胞減少； D：HU0126組與LU0126組比較，神經細胞存活率降低；箭頭指向死亡神經細胞.圖3 各組大鼠72 h海馬CA1區神經元形態結構變化(H-E ×400)Fig 3 Morphological changes of neurons in hippocampal CA1 region of 72 h rats in each group (H-E ×400)

2.3免疫組織化學染色情況 p-ERK1/2，Beclin-1及LC3-Ⅱ陽性表達主要位于細胞核，陽性細胞的胞核可見細小的棕黃色顆粒(圖4)。

2.4Western-blot測定p-ERK1/2、Beclin-1及LC3-Ⅱ的蛋白表達

2.4.1p-ERK1/2的蛋白表達 與Sham組比較，SAH組各時間點p-ERK1/2均明顯增加(均為P<0.05)；LU0126和HU0126組各時間點p-ERK1/2，Beclin-1及LC3-Ⅱ均明顯降低(均為P<0.05)；與LU0126組比較，HU0126組各時間點p-ERK1/2均降低(P<0.05，表3,圖5)。

2.4.2Beclin-1的蛋白表達 與Sham組比較，SAH組各時間點Beclin-1水平上調(P<0.05)；與SAH組比較，LU0126和HU0126組各時間點Beclin-1均持續減少(P<0.05)；與LU0126組比較，HU0126組各時間點Beclin-1無明顯變化(P>0.05，表3，圖5)。

A1～D1：分別為Sham，SAH，LU0126，HU0126組海馬區磷酸化ERK1/2的表達；A2～D2：分別為Sham，SAH，LU0126，HU0126組海馬區Beclin-1組的表達；A3～D3：分別為Sham，SAH，LU0126，HU0126組海馬區LC3-Ⅱ表達. 箭頭指向陽性表達細胞.圖4 免疫組織化學法檢測大鼠海馬CA1區磷酸化ERK1/2,Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達( ×400)Fig 4 The expressions of phosphorylated ERK1/2, Beclin-1 and LC3-Ⅱ in hippocampus CA1 region were detected by immunohistochemistry( ×400)

圖5 Western-blot分析海馬區神經元中p-ERK1/2，Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達Fig 5 The expression of p-ERK1/2, Beclin-1 and LC3-Ⅱ in the neuron of hippocampus by Western-blot

2.4.3LC3-Ⅱ的蛋白表達 與Sham組比較，SAH組各時間點LC3-Ⅱ水平上調(P<0.05)；與SAH組比較，LU0126和HU0126組各時間點LC3-Ⅱ均持續減少(P<0.05)；與LU0126組比較，HU0126組各時間點LC3-Ⅱ無明顯變化(P>0.05，表3，圖5)。

3 討 論

ERK1/2信號是連接細胞外信號與膜受體、轉錄因子和各基因調節的關鍵信號通路之一，目前在多種神經系統疾病中均證實存在 ERK1/2的活性改變。研究認為，ERK1/2激活可增加神經細胞耐受缺血、缺氧應激損傷的能力，對神經細胞有保護作用[8-9]。例如Zhao等在糖尿病大鼠腦缺血模型中發現，ERK1/2的活性降低伴隨DNA依賴蛋白激酶Ku70表達持續減少及神經細胞死亡增多現象[10]。Gatti等研究發現，促黑色素細胞激素對SAH大鼠有保護作用，可減輕血管痙攣，且這種作用與調節ERK1/2的活性有關[11]。本研究中，U0126呈劑量依賴性增加神經細胞死亡率，加重動物學習記憶障礙，說明SAH后ERK1/2的活化對神經細胞具有保護作用。

自噬是真核細胞中產生的一種細胞防御機制，適度自噬激活能夠引領細胞結構重建、維持細胞正常生長發育，達到穩定細胞內環境的作用，降低神經細胞死亡的發生，是細胞的第3種死亡方式[12-13]。Lee等在SAH大鼠模型中發現，EBI 階段會有自噬水平的上調，且在24 h上調最為明顯[14]。本實驗前期研究也發現，SAH的病理過程中伴隨自噬的發生，進一步誘導自噬可減少SAH后EBI的神經細胞凋亡，改善神經功能損傷[15]，但SAH后自噬發生的具體機制尚未明確。LC3及Beclin-1是檢測自噬必不可少的指標，因此本實驗選用LC3-Ⅱ和Beclin-1作為檢測自噬水平的指標。本研究結果顯示，SAH后加入U0126可導致自噬蛋白分子Beclin-1及LC3-Ⅱ表達顯著降低，神經細胞存活率也顯著降低，提示 SAH 早期ERK1/2活化可調控自噬的激活。于春艷等發現，氧化應激通過ERK信號途徑誘導HeLa細胞發生自噬，被激活的細胞自噬可抑制VK3誘導HeLa細胞凋亡[16]。研究認為，ERK1/2信號激活可通過與雷帕霉素靶蛋白、磷酸化糖原合成酶激酶3β交互作用誘導自噬[17]；亦可通過調控Bcl-2家族蛋白表達來調節細胞的自噬發生程度[18]。李冉等在小鼠SAH模型中觀察到代謝型谷氨酸受體1選擇性拮抗劑可降低海馬區Beclin-1及LC3-Ⅱ表達，且這種變化過程中伴隨ERK1/2活性的改變，從側面提示SAH后ERK1/2信號激活與神經細胞自噬有關[19]。本研究結果與此一致，但尚未直接驗證ERK1/2信號通路與自噬的關系。U0126是ERK信號通路的特異性阻斷劑，可以有效抑制ERK的磷酸化過程，且在加入U0126 24 h左右，抑制ERK信號通路對神經細胞凋亡影響的作用最大[20]。本研究發現，SAH模型大鼠加入不同劑量的U0126可降低Beclin-1及LC3-Ⅱ表達，提示通過ERK1/2的激活調控自噬介導神經元存活，但劑量不同的U0126對自噬影響不大，猜測ERK1/2的濃度對自噬影響不大。因此，筆者認為，SAH后神經細胞自噬可能是ERK1/2信號通路依賴性的。通過調節自噬水平可能是 ERK1/2對SAH后的神經細胞保護機制之一。

表3各組大鼠海馬區p-ERK1/2，Beclin-1及LC3-Ⅱ的表達量比較

Tab3Comparison of the expression of p-ERK1/2, Beclin-1 and LC3-Ⅱ in hippocampus CA1 region of rats in each group

分 組6h24h72hSham組 p-ERK1/20.15±0.010.14±0.020.15±0.01 Beclin-10.09±0.010.10±0.020.09±0.01 LC3-Ⅱ0.06±0.010.07±0.010.07±0.01SAH組 p-ERK1/20.86±0.17☆1.06±0.16☆0.94±0.14☆ Beclin-10.77±0.22☆0.98±0.28☆0.68±0.24☆ LC3-Ⅱ0.62±0.19☆0.92±0.20☆0.52±0.18☆LU0126組 p-ERK1/20.54±0.12★0.66±0.14★0.52±0.15★ Beclin-10.42±0.18★0.58±0.16★0.39±0.18★ LC3-Ⅱ0.38±0.16★0.52±0.18★0.36±0.16★HU0126組 p-ERK1/20.36±0.13★◇0.40±0.13★◇0.34±0.14★◇ Beclin-10.38±0.17★0.52±0.15★0.33±0.16★ LC3-Ⅱ0.30±0.14★0.48±0.16★0.33±0.15★

n=15. Sham：假手術；SAH：蛛網膜下腔出血；LU0126：蛛網膜下腔出血+低劑量ERK1/2抑制劑；HU0126：蛛網膜下腔出血+高劑量ERK1/2抑制劑. 與Sham組比較，☆：P<0.05；與SAH組比較，★：P<0.05；與LU0126組比較，◇：P<0.05.

綜上所述，SAH后ERK1/2信號通路的激活可以調控自噬，增加神經細胞的存活率，這為臨床上開發更為有效且副作用更少的SAH治療藥物提供一定的理論依據。但ERK1/2信號通路的作用可能涉及其他復雜的分子機制，有待于進一步研究。

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