共聚焦激光顯微內鏡聯合熒光靶向探針診斷消化道腫瘤及癌前病變的研究進展

賈逸文 綜述 劉海峰 審校

共聚焦激光顯微內鏡聯合熒光靶向探針診斷消化道腫瘤及癌前病變的研究進展

賈逸文 綜述 劉海峰 審校

激光共聚焦內鏡；分子影像；腫瘤；消化道

消化系統腫瘤是世界范圍內最常見的腫瘤病變，嚴重危害人類健康；提高早期腫瘤的診斷水平對于提高患者生存率、減輕社會經濟負擔有著深遠的意義[1,2]。目前國際研究表明，內鏡檢查是發現消化系統腫瘤的最有效途徑。然而，現有內鏡技術存在檢出率低，漏診率高等諸多問題。為解決這些問題，分子影像學為我們提供了新的思路[3]。熒光分子成像技術(fluorescence molecular imaging，FLI)可以在細胞和分子水平對活體內的生物過程進行研究，同時利用靶向探針與特定分子結合可實現實時、定量成像。隨著分子靶向探針技術的發展，它已被廣泛應用于細胞學、分子生物學、醫學等眾多領域[4-6]。該技術可與多種現代學科交叉，其應用的范圍正在不斷拓展，而與共聚焦激光顯微內鏡的聯合應用引起了人們的關注。

1 熒光分子成像技術與共聚焦激光顯微內鏡

熒光分子成像技術是近些年出現的新興分子影像技術。其成像原理是利用特異性的熒光分子探針標記特定的分子或細胞，從而得到這些物質的含量及分布情況，具有靈敏度高，特異度高，重復性好等優勢，尤其適用于研究胃腸道的病理、生理分子機制[7]。

共聚焦激光顯微內鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)作為一種新內鏡成像方式，已被廣大內鏡醫生所認同，使臨床醫生能夠在操作白光內鏡的同時對胃腸道黏膜進行放大觀察，對淺表病灶進行鑒別診斷，其放大倍數可以達到1000倍[8]。CLE通過靜脈注射和表面噴灑非特異性的熒光對比劑進行熒光成像，實時觀察消化道黏膜上皮細胞、腺體及血管等顯微結構[9,10]。目前可在臨床上使用的CLE設備有兩種類型：一種是將共聚焦探頭安裝在傳統白光內鏡前端的整合式內鏡(integrated confocal lasar endomicroscopy，iCLE)；另一種是將微探頭通過白光內鏡的活檢孔道遞送的探頭式內鏡(probe-based confocal lasar endomicroscopy，pCLE)[11,12]。CLE是把形態學和組織學相聯合的新型診斷工具，能清楚地顯示亞細胞結構，以達到“光學活檢”的目的。但是由于常規使用的熒光染料如熒光素鈉、鹽酸吖啶黃、四環素、甲酚紫均為非特異性染料，這些染料用于對比劑，只能對組織進行大致的觀察發現問題，無法特異性地發現病變組織(如不典型增生，上皮內瘤變或者惡性腫瘤等)進行有針對性的觀察。目前研究表明將熒光靶向探針和共聚焦激光顯微內鏡技術相結合可以特異性地發現病變，并能對病灶進行實時免疫組化(immunohistochemistry，IHC)[13-15]，達到對可疑病變快速而準確診斷的目的，對此國內外已經開展了相關研究。

2 對消化道疾病的診斷應用

近年來，CLE將消化道病變的內鏡診斷和病理組織學診斷有效地結合起來, 通過對比病灶和正常組織的圖像特征，進而診斷疾病，在將來有望取代耗時費力的傳統組織病理切片技術。

2.1 食管腫瘤及癌前病變 最新研究數據表明，近年來西方人群中食管腺癌 (EAC)的發病率顯著增加，且其預后不良，早期發現食管癌及癌前病變是改善預后的關鍵[16,17]。利用CLE聯合熒光靶向探針可以發現食管表面發生異型增生的黏膜。2013年Sturm等[18]應用噬菌體表面展示肽庫技術，篩選出能與食管異性增生黏膜特異性結合的短肽ASYNYDA，在可疑病變表面噴灑FITC標記短肽ASYNYDA ，對25個Barrett食管病人進行pCLE成像來檢測Barrett食管的異型增生，其敏感度和特異度分別能達到75%和97%。這是第一次證明了應用熒光標記的特異性短肽可以對人食管下端黏膜進行CLE成像，并可以在體診斷Barrett食管的異型增生，整個成像過程可在5 min內完成，在日常臨床診療中具有較高可行性。

人類表皮生長因子受體2(HER2)廣泛參與人類腫瘤的惡性進程，其中也包括EAC。通過對HER2受體進行靶向熒光成像對發現食管癌有良好效果。2015年S. Realdon等[19]通過研究證明，在外科誘導食管癌小鼠體內，食管癌組織中HER2信號的表達遠高于正常組織和Barrett食管組織。而后應用AlexaFluor488標記的抗HER2抗體，通過尾靜脈注射入4只經外科誘導80周后的小鼠(其中3只病理證實為食管腺癌，1只為Barrett食管)體內，并使用探頭式CLE(pCLE)進行成像。結果顯示其中3只食管腺癌小鼠HER2過度表達，而在小鼠的正常組織和Barrett食管組織中并沒有觀察到信號。實驗證實HER2過度表達是食管腺癌的特征性表現，應用CLE可以對食管腺癌小動物模型進行在體診斷，并且通過量化熒光信號的方法，可以指導活檢，提高了常規病理活檢操作的特異性。

2.2 胃腫瘤 胃癌是世界第2大腫瘤死亡相關疾病，每年有超過100萬人被診斷為新發胃癌[20]。早期診斷并治療可以顯著提高胃癌病人的生存率。早期胃癌的發生發展往往伴隨著某些細胞受體或成分的表達異常。表皮生長因子受體(EGFR)是表皮生長因子(EGF)進行信號傳導的受體，與腫瘤細胞的增殖分化、血管生成、侵襲轉移及細胞凋亡的抑制有關。研究表明在很多腫瘤組織中存在EGFR的高表達或表達異常。存活素(Survivin)是一種新近發現的分子量16.5 ku細胞內蛋白,屬于抗細胞凋亡蛋白家族，可以廣泛的抑制細胞凋亡，并促進有絲分裂。通過對組織表面的EGFR和Survivin的觀察可以發現胃癌病變。2012年Nakai Y等[21]通過表面噴灑及黏膜注射兩種方式，將FITC標記EGFR抗體及Survivin抗體注入正常豬食管和胃黏膜，并利用pCLE進行了靶向分子成像。研究表明通過CLE能夠觀察到豬的食管和胃黏膜存在EGFR和Survivin表達，結果由體外免疫組化所證實。在食管中EGFR和Survivin主要在局部角化的祖細胞中表達。而在胃中，EGFR主要在局部祖細胞區及上皮細胞表達，Survivin則表現出相似的結果，但在上皮細胞表達率更高。研究證明了通過FITC標記EGFR抗體及Survivin抗體對正常食管和胃黏膜進行在體成像的可行性，同時也為更好地了解胃腸道的病理生理學提供了一項新的方法。

用熒光標記的EGFR抗體探針檢測腫瘤組織，可篩選出EGFR過表達的患者，對這些患者進行靶向治療，可獲得較好療效。2012年，Hoetker MS等[22]利用FITC標記EGFR抗體(診斷性探針)，使用Optiscan FIVE1系統對胃癌移植瘤小鼠模型進行共聚焦成像，觀察結果得出，瘤體表面的信號強度明顯高于周圍的結締組織(P=0.0145)。同時又應用AlexaFluor488標記的西妥昔單克隆抗體進行成像，得到相似的結果(P=0.047)。該研究初步探討了靶向治療藥物用于分子成像的可行性，為分子靶向藥物療效早期預測提供了理論依據及技術支持，實現了診斷與治療同時進行，并有望成為未來個體化治療的參考標準。2013年，Li Z等[23]使用AlexaFluor488標記MG7抗體對23例人類胃癌標本進行了共聚焦成像。胃癌相關特異性抗原MG7-Ag是一種國內學者新發現的診斷標志物，在胃癌組織中高表達，而在正常胃黏膜組織不表達[24]。利用MG7抗體對相關抗原進行檢測，可以特異性的發現胃癌細胞。實驗結果表明，該方法可以鑒別胃癌組織與正常黏膜(P<0.001)，協助提高胃癌檢出率，并且可以篩選出MG7抗體陽性患者作為靶向治療的敏感患者，提高治療反應性。

2.3 結直腸腫瘤及癌前病變 結直腸癌(CRC)的發生發展是一個多步驟的過程，與基因的改變和環境因素相關。大部分的CRC可以通過檢查和切除息肉性病變來預防。盡管內鏡技術已取得了較大提升，但結腸癌的發病率依然很高，原因主要是由于常規內鏡檢查只能發現黏膜形態學上的改變，而缺乏分子特異性。如能對結直腸癌的癌前病變進行分子成像，可以在病變形態學改變之前發現病變，實現病變早期診斷的目的。2007年，Hsiung PL等[25]利用噬菌體表面展示肽庫技術，合成短肽VRPMPLQ作為靶向探針，并可以與人類結直腸腺癌細胞特異性結合。相對于抗體式的靶向探針，短肽探針具有抗原性低，無毒，結構簡單，易于制備等多種優勢。通過腸道表面噴灑共軛熒光素鈉標記的短肽VRPMPLQ，對結直腸腺瘤26例進行了內鏡檢查和pCLE成像，并對標本進行病理學檢查。通過比較病變部位熒光強度及隱窩形態，檢出結直腸組織上皮內瘤變的敏感性為81%，特異性為82%(α< 0.01)。實驗驗證了應用短肽分子成像診斷腸道上皮內瘤變的可行性，并評估腫瘤發展過程中的惡性程度，及檢測腫瘤進展中的生物標記物水平，為診斷結直腸癌前病變提供了新思路。

利用CLE技術可以對結腸癌組織進行特異性成像，使在體診斷結腸癌成為可能。2009年，Goetz M等[26]將FITC標記EGFR抗體分別注入高表達(SW480細胞系)和低表達(SW620細胞系)兩類人結腸癌荷瘤鼠模型體內，采用Optiscan FIVE1共聚焦成像系統對腫瘤組織進行成像，首次實現了結直腸癌的在體分子成像，證實了CLE可以實時區別不同移植瘤細胞的EGFR表達差異。之后又選取8例患者的上皮內瘤變組織及非瘤變組織，以FITC標記EGFR抗體進行表面噴灑。CLE成像結果顯示正常人類腸道黏膜和上皮內瘤變標本的平均熒光強度分別為0.25+/-0.16和2.12 +/-0.30，(P<0.002)，實驗結果之間存在明顯差異，為將來人類在體分子成像提供了理論支持。2013年，Liu J等[27]對37例結直腸腫瘤病人進行在體研究，對病變表面噴灑AlexaFluor488標記EGFR抗體，使用eCLE進行觀察。其中在19例結直腸癌中有18例表現出特異性的熒光信號(94.7%)，18例結直腸腺瘤中有12例表現出特異性的熒光信號(66.7%)。而以上病人的正常組織均未觀察到或只觀察到極微量的特異性的熒光信號。所有觀察部位均由體外免疫組化和病理所證實。實驗表明體外結直腸癌組織免疫組化結果和體內EGFR分子成像結果具有良好的一致性，證明了人體在體CLE分子成像的可行性。

腫瘤的生長和轉移離不開新生血管的形成。血管內皮生長因子(VEGF)是胃腸道腫瘤靶向治療的靶點，在正常組織和腫瘤組織的血管生成中扮演重要角色。 CLE聯合熒光靶向探針可以觀察到VEGF受體在細胞膜上的分布。2010年Foersch S等[28]利用AlexaFluor488標記的血管內皮生長因子(VEGF)，對人結腸癌荷瘤鼠模型進行了CLE在體成像，同時又對結腸癌患者的腫瘤標本進行體外CLE成像。并將結果和病理，免疫組化及熒光顯微鏡結果進行比較。通過定量分析的方式分析圖像結果，證明了應用此技術可以鑒別上皮內瘤變與正常黏膜(P<0.05)。研究表明CLE結合熒光靶向探針進行成像是一種有效區分腫瘤性和非腫瘤性病變的成像方式，可以早期發現腫瘤組織。研究發現運用治療性靶向探針，可以篩選出藥物敏感性高療效好的患者，以實施個性化診療，將對結直腸癌及其癌前病變的診斷、治療及預后評估具有重要意義。

綜上所述，將熒光靶向探針和共聚焦激光顯微內鏡相結合，可對消化道腫瘤及癌前病變進行診斷，其與傳統內鏡相比，具有高特異性，高準確性，操作簡單的優勢，可早期診斷消化道腫瘤及癌前病變。同時運用靶向藥物作為探針，可以實現個體化治療，并預測治療的反應性及對靶向治療的效果，從而提高患者的遠期生存率。然而，成像深度及表面噴灑穿透力有限，尚缺乏可供患者靜脈應用的安全、無毒熒光標記分子探針等問題仍是目前急需解決重點。同時熒光信號強度判斷標準尚需進一步統一和完善，對于采取半定量或者定量分析，業界還存在爭議。但從目前的研究來看，這項技術仍體現出廣闊的應用前景。未來隨著技術的進步，分子影像學也必然會成為醫生的得力助手，在日后的臨床診療中發揮出巨大優勢。

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(2016--收稿 2016--修回)

(責任編輯 梁秋野)

首都臨床特色應用研究(2141109002514099)

賈逸文，碩士研究生。

100039 北京，武警總醫院消化內科

劉海峰，E-mail:haifengliu333@163.com

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