赭曲霉毒素A致癌機制研究進展

劉 靜，張紅英 綜述 張祥宏 審校

赭曲霉毒素A致癌機制研究進展

劉 靜1，張紅英2綜述 張祥宏3審校

赭曲霉毒素A；致癌機制；氧化應激

赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)是一種主要由純綠青霉、碳黑曲霉和赭曲霉產生的真菌毒素，廣泛存在于食品、農產品和動物飼料中，因此OTA與人類健康的關系備受關注。研究發現，OTA具有腎毒性、肝毒性、神經毒性、免疫毒性和致畸性[1]。國際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer, IARC)1993年把OTA定為“B級人類可能致癌物”[2]。但是，迄今為止有關OTA的致癌作用機制尚不完全清楚。筆者主要就目前備受關注的OTA致癌機制進行綜述。

1 OTA致癌性

OTA是嚙齒類動物明確的致癌物。美國國家毒物學計劃的一項研究，210、70、21 μg/kg體重OTA喂食F344N大鼠。2年后，210 μg/kg體重劑量組出現了腎管狀腺瘤和癌，其中72%為雄性，16%為雌性。70 μg/kg體重劑量組，39%的雄性大鼠和4%的雌性大鼠出現了腎腺瘤或癌。OTA誘癌有性別差異，雄性較雌性敏感。此外，還觀察到腎臟非新生物形式的病理變化，例如增生、細胞增殖、胞漿改變和核肥大。腎細胞癌轉移主要發生在肝、肺和淋巴結[3]。基于此，國際癌癥研究中心將OTA界定為B級人類可能致癌物[2]。德意志研究聯合會的一個委員會在2003年對工作區域的化學物質的健康危害進行了調查，根據OTA的長期的動物實驗研究或流行病學研究的證據認為OTA具有致癌危險，將OTA分為2類致癌物[4]。

除了腎臟腫瘤外，Schwartz[5]提出了OTA暴露可能與睪丸癌發生率增高有關的假說。雖然沒有流行病學研究支持此假說，但是實驗證明高劑量的OTA引起睪丸癌，并且形成OTA-DNA加合物。乳腺也是OTA的潛在靶目標，OTA增高了乳腺纖維腺瘤的發病率[3]。

2 OTA介導的細胞效應

2.1 OTA誘導氧化應激

2.1.1 機制 ROS誘導的氧化應激及大分子物質損傷被認為是衰老及包括腫瘤在內的慢性疾病的發病機制之一[6, 7]。一些研究結果顯示，OTA引發ROS生成，通過各種直接和間接的機制導致氧化應激。

還原系統由磷脂囊泡、NADPH氧化酶、細胞色素P450還原酶和Fe3+組成，OTA可以螯合Fe3+從而減少其還原為Fe2+，在氧存在的情況下，Fe2+提供活性成分開始脂質過氧化[8]。一些學者報道，OTA氫醌/苯醌對由OTA氧化產生，苯醌是半醌和氫醌減少的結果。這些導致氧化還原循環和活性氧的產生。雖然給予OTA處理可以使體外培養的細胞形成苯醌[9]，但是體內環境對于這些反應的生理變化的真正關聯還沒有得以明確。

遺傳毒理學研究為OTA介導的氧化損傷機制的研究提供了又一有力證據。OTA明顯降低腎組織中參與氧化應激的基因的表達，其中許多基因的啟動子區包含抗氧化調控元件。抗氧化調控元件被Nrf2所識別，Nrf2參與編碼解毒、細胞保護、抗氧化酶的基因的基礎表達和誘導[10]。這些發現引發了如下假說，即OTA削弱了細胞的抗氧化防御屏障從而使細胞更易于發生氧化損傷，此假說得到了研究人員的證明。

2.1.2 氧化損傷 體內外研究發現OTA可以導致細胞氧化損傷。ROS可以直接引起DNA氧化堿基的形成，形成的DNA氧化堿基又直接導致多種形式的DNA損傷。并且在腫瘤形成中通常可以看到氧化DNA堿基引發的突變。OTA可以誘導體外培養的人胃黏膜上皮細胞GES-1和大鼠腎小管上皮細胞ROS生成增多，形成8-oxoguanine(DNA堿基氧化修飾，氧化損傷標志物)[11, 12]。100 μM OTA處理60min誘導人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y和小鼠海馬細胞HT22 發生氧化應激[13]。OTA還可以誘導體外培養的人外周血單個核細胞和食管上皮細胞Het-1A發生DNA損傷，出現DNA鏈斷裂[14, 15]。體內實驗觀察到同樣的現象，給予F344大鼠0.25，0.50，1.0和2.0 mg/(kg·d)OTA灌胃2周，彗星實驗觀察發現肝、腎和脾細胞出現DNA鏈斷裂[16]。Kamp等[17]灌胃F344大鼠0.03, 0.1, 0.3 mg/kg bw/day OTA 4周，所有實驗組動物出現肝和腎的氧化損傷。在肝臟和腎臟，DNA的損傷與DNA糖基酶Fpg有關。Fpg是一種DNA修復酶，參與氧化損傷DNA或者誘突變劑損傷DNA的堿基切除修復。其他研究者在給予動物廣泛劑量OTA處理后，在各種組織中均觀察到DNA氧化損傷。抗氧化劑可以緩解OTA介導的DNA損傷，進一步說明OTA誘導氧化應激損傷。例如，抗氧化劑N-acetyl-L-cysteine(NAC)可以降低OTA引起的人近端腎小管上皮細胞HK-2 DNA和人胃黏膜上皮細胞GES-1氧化損傷[11, 12]。

蛋白質的羥基化作用通過多種氧化途徑發生。羥基化是一種重要的蛋白質修飾方式，與蛋白(酶)功能改變、蛋白錯折疊和蛋白分解有關。組織中蛋白羥基化水平增高與很多疾病有關。由于哺乳動物細胞中細胞骨架蛋白含量豐富，如actin，多受到各種ROS和低分子量反應性羥基的攻擊[18]。目前，關于OTA對蛋白羥基化作用影響的報道不一致。給予F344大鼠每天0.3 mg/kg體重OTA喂養4周，在肝和腎沒有觀察到蛋白質氧化增加[17]。Wistar大鼠喂食OTA 289 μg/kg體重，90 d，在肝臟同樣沒有觀察到蛋白質氧化增加[19]。但是，與之相反，Domijan等[20]在喂食Wistar大鼠每天0.5 mg/kg體重的第1、7、14和21天檢測蛋白質氧化發現，大鼠的肝和腎中蛋白質羥基在第14和21天明顯增加。體外研究也觀察到了蛋白質的氧化形式。

自由基引起的反應中研究最廣泛的是脂質過氧化作用，其副產物中，HNE、MDA、丙烯醛和巴豆醛則研究較多。這些反應性親電子物質具有修飾DNA堿基的能力，引起突變性損傷，因此被認為與氧化應激脂質過氧化反應的致突變性和致癌作用有關。已經證實，癌癥發生過程中HNE和MDA會升高[6]。研究發現，OTA誘導MDA形成。最初時，Rahimtula[21]研究小組發現，將OTA加入到肝細胞或腎細胞的微粒體中，可以刺激脂質過氧化反應，大鼠體內實驗同樣如此。另有研究報道，OTA-鐵復合物刺激脂質過氧化反應[8]。另外，有研究證實，OTA誘導的脂質過氧化反應可以導致微粒體釋放Ca2+[22]，給予動物模型不同的口服劑量OTA發現MDA生成增多，體外培養細胞給予OTA處理后可以檢測到HNE-蛋白加合物。

2.1.3 生物反應 眾所周知，ROS可以觸發生物反應，例如激發和抑制信號通路和基因表達。這些生物反應可能參與了反應性化學物質的致癌機制。體內外研究表明，氧化應激作為信使參與OTA誘導的負面生物效應。例如，OTA誘導自由基生成，增加細胞膜Ca2+通透性[22]。

2.2 OTA抑制蛋白合成 體內外實驗研究均發現，OTA可以通過抑制肽鏈的延長而抑制蛋白質合成，并且很多研究表明抑制蛋白合成與OTA的急性毒性作用有關。抑制蛋白質合成是OTA的一種主要作用，與抑制RNA和DNA的合成有關。最近的遺傳毒理學研究報道，長期喂食大鼠致癌劑量的OTA可以明顯降低RNA和蛋白的表達，進一步說明OTA具有抑制蛋白質合成的作用[23]。

2.3 OTA與細胞信號

2.3.1 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases，MAPKs) 是信號級聯反應的關鍵部件，涉及磷酸化激活的反應，調控信號從細胞膜到細胞核的傳導。ERK、JNK和P38是主要的MAP激酶，調控哺乳動物細胞生理學的許多方面。一般認為，ERK負責調節細胞增殖，JNK和P38更傾向于參與應激反應和凋亡。體外實驗研究發現，OTA誘導ERK1/2、JNK和P38磷酸化[24, 25]。喂養雄性大鼠致癌劑量OTA 7、21 d和12個月，OTA影響腎組織中MAPK的表達和磷酸化。經分析，ERK上游的效應器為胰島素樣生長因子(IGF-1)，(IGF)-PI3K-PKB 通路可能參與OTA介導的雄性大鼠腎毒性[26]。腎腫瘤中的信號級聯作用已經廣泛研究。一些學者發現細胞增殖、細胞存活、抗凋亡活性和腎腫瘤發展與IGF-1系統的刺激、蛋白激酶C活性的增加和MAPK-ERK的激活有直接關系。并且動物實驗的結果也支持MAPK級聯激活與腎腫瘤相關。

2.3.2 Ca2+動態平衡 Ca2+是重要的細胞信號，例如涉及鈣調蛋白和蛋白激酶C的激活，且鈣動態平衡失衡是毒素損傷的早期和關鍵事件。體外實驗表明OTA影響細胞內的Ca2+平衡[22]。但是，體內實驗只有有限的且不一致的關于OTA和Ca2+平衡的結果[27]。有研究報道，鈣調素抑制大鼠腎皮質的DNA合成，并且抑制肝癌細胞的腫瘤活性[28]。

3 OTA誘發多種細胞效應

3.1 細胞毒性和細胞死亡 高濃度OTA引起強烈的氧化應激和抑制蛋白合成，從而導致細胞毒性和細胞死亡。眾所周知，毒性作用可能誘發細胞的再生和增殖，這可能導致細胞轉化和腫瘤的發展。總之，近期的研究表明組織再生和細胞增殖可能參與了OTA的致癌作用[29]。

3.2 凋亡 在一定水平上，氧化應激可以誘導程序性細胞死亡，即凋亡，是有別于壞死的積極過程。一些研究表明，OTA可以誘導體內外細胞發生凋亡。隨著腫瘤的發展，凋亡的作用是難以定義的。通常認為凋亡去除異常細胞而阻止腫瘤的發展。但是，基于體外實驗的研究結果，一些學者主張OTA的介導的細胞凋亡引起抗凋亡細胞的選擇，這極有可能導致細胞轉化為腫瘤細胞[14]。此外，因為壞死和凋亡刺激代償細胞損失反應能力，導致細胞增殖和癌癥的發展。

3.3 轉化與增殖 除了導致DNA損傷，持續的低水平的氧化應激可以誘導細胞增殖。這最終可轉換成基因突變的DNA損傷，從而導致細胞轉化和腫瘤的發生發展[11]。

綜上所述，OTA不是通過單一的、定義明確的機制發揮作用的，而是一個復雜的、相互聯系的網絡機制。抑制蛋白合成、氧化應激、特定信號通路的激活都參與了OTA的致癌機制。其中，關于氧化應激機制越來越受到人們的關注。一些專家認為，OTA介導的氧化應激在OTA誘導的腎腫瘤的發生中起著舉足輕重的作用。總之，有力的證據表明OTA可以引起氧化應激反應，并且氧化應激參與OTA致癌。

[1] Internationalprogramme on chemical safety (IPCS), 2001. Safety Evaluation of Certain Mycotoxins in Food, WHO Food Additives Series 47, World Health Organization, Geneva.

[2] International Agency for Research on Cancer.Some Naturally Occurring Substances, Food Items and Constituents, Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins[J].Geneva: International Agency for Research on Cancer.IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, 1993, 56: 26-32 .

[3] National Toxicology Program.Toxicology and Carcinogenesis Studies of Ochratoxin A (CAS No. 303-47-9) in F344/N Rats (Gavage Studies).Natl Toxicol Program Tech Rep Ser, 1989, 358:1-142.

[4] DFG, DeutcheForschungsgemeinschaft List of MAK andBAT Values, Commission for the investigation of HealthHazards of chemical compounds in the work area, report no.39, Wiley-VCH, VerlagWeinheim，2003.

[5] Schwartz G G. Hypothesis: Does ochratoxin A cause testicular cancer[J]. Cancer Causes Control, 2002, 13(1): 91-100.

[6] Klaunig J E, Kamendulis L M.The role of oxidative stress in carcinogenesis[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2004, 44: 239-267.

[7] Valko M, Rhodes C J, Monco L J,etal. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer [J]. Chem Biol Interact, 2006, 160(1): 1-40.

[8] Omar R F, Hasino B B, Mejilla F,etal. Mechanism of ochratoxin a stimulated lipid peroxidation [J]. Biochemical Pharmacology, 1990, 40(6): 1183-1191.

[9] Faucet-Marquis V, Pont F, Stormer F C,etal. Evidence of a new dechlorinatedochratoxin A derivative formed in opossum kidney cell cultures after pretreatment by modulators of glutathione pathways: correlation with DNA-adduct formation [J]. Mol Nutr Food Res, 2006, 50(6): 530-542.

[10] KenslerTW, WakabayashiN, Biswal S. Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway [J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2007, 47:89-116.

[11] Cui J, Liu J, Wu S,etal.Oxidative DNA damage is involved in ochratoxin A-induced G2arrest through ataxia telangiectasia-mutated (ATM) pathwaysin human gastric epithelium GES-1 cells in vitro [J]. Arch Toxicol,2013, 87(10):1829-1840.

[12] Somy Yoon, Wei Tao Cong, Yeojin Bang,etal. Proteome response to ochratoxin A-induced apoptotic cell death in mousehippocampal HT22 cells [J]. Mutagenesis, 2007, 22(1): 35-42.

[13] Robbiano L, Baroni D, Carrozzino R,etal. DNA damage and micronuclei induced in rat and humankidney cells by six chemicals carcinogenic to the rat kidney [J]. Toxicology, 2004, 204(2-3): 187-195.

[14] Liu J, Wu S, Shen H,etal. OchratoxinAinduces DNA damage and G2 phase arrest in human esophageal epithelium Het-1A cells in vitro [J].J Toxicol Sci, 2015, 40(5):657-665.

[15] Liu J, Wang Y, Cui J,etal.Ochratoxin A induces oxidative DNA damage and G1 phase arrest in humanperipheral blood mononuclear cells in vitro [J]. ToxicolLett, 2012, 211(2):164-171.

[16] Kamp H G, Eisenbrandt G, Schlatter J,etal. Ochratoxin A: induction of (oxidative) DNA damage, cytotoxicity and apoptosis in mammalian cell lines and primary cells [J]. Toxicology, 2005, 206(3): 413-425.

[17] Kamp H G, Eisenbrand G, Janzowski C,etal. OchratoxinA induces oxidative DNA damage in liver and kidney afteroral dosing to rats [J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2005, 49(12): 1160-1167.

[18] Dalle-Donne I, Rossi R, Colombo R,etal. Biomarkers of oxidative damage in human disease [J]. Clin Chem, 2006, 52(4): 601-623.

[19] Gagliano N, Donne I D, Torri C,etal. Early cytotoxic effects of ochratoxinA in rat liver: a morphological, biochemical and molecular study [J]. Toxicology, 2006, 225 (2-3): 214-224.

[20] Domijan A M, Rudes K, Peraica M.The effect ofochratoxin A on the concentration of protein carbonyls inrats [J].Arh Hig Rada Toksikol, 2005, 56(4):311-315.

[21] Rahimtula A D, Bereziat J C, Bussacchini-Griot V,etal. Lipid peroxidation as a possible cause of ochratoxin A toxicity [J].Biochemical Pharmacology, 1998, 37(23): 4469-4477.

[22] Khan S, Martin M, Bartsch H,etal. Perturbation of liver microsomal calcium homeostasis byochratoxin A [J]. Biochemical Pharmacology, 1989, 38(1): 67-72.

[23] Marin-Kuan M, Nestler S, Verguet C,etal. A toxicogenomics approach to identifynew plausible epigenetic mechanisms of ochratoxinAcarcinogenicityin rat [J].ToxicolSci, 2006, 89(1): 120-134.

[24] Wang Y, Liu J, Cui J,etal. ERK and p38 MAPK signaling pathways are involved in ochratoxin A-induced G2phase arrest in human gastric epithelium cells [J].Toxicol Lett，2012,Mar 7,209(2):186-192.

[25] Kumar R L, Ansari K M, Chaudhari B P,etal.Topical application of ochratoxin A causes DNA damage and tumor initiation in mouse skin [J]. Plos One. 2012; 7(10): e47280.

[26] Marin-Kuan M, Nestler S, Verguet C. MAPK-ERK activation in kidney of male rats chronically fed ochratoxin A at a dosecausing a signi cant incidence of renal carcinoma [J]. ToxicolApplPharmacol, 2007, 224(2): 174-181.

[27] Rached E, Hard G C, Blumbach K,etal. Ochratoxin A: 13-week oral toxicity and cell proliferation in male F344/n rats [J]. ToxicolSci, 2007, 97(2): 288-298.

[28] Tsurusaki Y, Yamaguchi M. Role of regucalcin in liver nuclearfunction: binding of regucalcin to nuclear protein or DNA andmodulation of tumor-related gene expression [J]. Int J Mol Med,2004,14(2):277-281.

[29] Stemmer K, Ellinger-Ziegelbauer H, Ahr HJ,etal. Carcinogen-specific gene expression profiles in short-term treated Ekerandwild-type rats indicative of pathways involved in renal tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2007, 67(9): 4052-4068.

(2016-08-23收稿 2016-10-15修回)

(責任編輯 張 楠)

國家自然科學基金面上項目(基金代碼 81171889)

劉 靜，博士，講師。

100039 北京，武警總醫院 1.病理科，2.質量管理科；

3.050017 石家莊，河北醫科大學病理研究室

張祥宏，E-mail：zhangxianghong2008@163.com

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