固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質

高 慧，邢 燕，汪 洋，宋金枝，王 旭

（1.淄博市疾病預防控制中心，山東 淄博 255026；2.杭州醫學院，浙江 杭州 310053）

固相萃取-高效液相色譜-熒光法測定人體尿液中單胺類神經遞質

高 慧1，邢 燕1，汪 洋1，宋金枝2，王 旭2

（1.淄博市疾病預防控制中心，山東 淄博 255026；2.杭州醫學院，浙江 杭州 310053）

建立一種快速、準確測定人體尿液中腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺及5-羥色胺4種單胺類神經遞質的方法。尿液樣品以Waters Oasis WCX固相萃取柱富集，依次用2mL 20mmol/L乙酸銨-甲醇溶液、2mL甲醇淋洗雜質，最后用5mL含2%甲酸的乙腈水溶液（85∶15，ν∶ν）提取被分析物。經Agilent C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）分離，以甲醇與乙酸鈉溶液的不同配比設置流動相梯度，在熒光檢測激發波長280nm，發射波長340nm條件下，測定人體尿液中4種單胺類神經遞質的含量。結果表明：4種單胺類神經遞質的回收率為92.2%～104.8%，相對偏差為1.6%～3.1%，檢出限為0.002～0.05μg/mL。該方法穩定、快速、簡便，能滿足人體尿液中多種單胺類神經遞質的含量測定。

單胺類神經遞質；固相萃??；高效液相色譜；熒光檢測

0 引 言

神經遞質是神經末梢分泌的化學物質，在化學突觸傳遞中擔當信使的作用。單胺類物質（MNTs）是最早發現的一類神經遞質，包括多巴胺（DA）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）和5-羥色胺（5-HT）。MNTs在中樞神經系統、外周植物神經系統和激素介導的內分泌及外分泌活動中起著極其重要的作用[1]。固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）是近年發展起來的一種樣品預處理技術，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，與傳統的液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率，更可將分析物與干擾組分有效分離，正成為復雜樣品純化、富集的有效手段。

人體尿液中單胺類神經遞質含量的準確檢測，對嗜鉻細胞瘤等相關疾病診斷、新藥研制開發、藥物療效評價等方面有重要意義。由于人體尿液基質非常復雜，且單胺類神經遞質在尿液中的含量較低，因此對檢測方法的靈敏度和選擇性都提出較高的要求。MNTs的檢測方法主要有電化學分析法[2]、熒光法[3]、高效液相色譜-熒光檢測法[4]、高效液相色譜-電化學檢測法[5-6]、毛細管電泳法[7]、色譜-質譜聯用法[8-9]。電化學分析法測定生物樣品的穩定性較差，且修飾電極的使用壽命有限，靈敏度不高[2]；熒光法易受樣品基質影響，穩定性也較差[3]；毛細管電泳法的重現性較差[7]。MNTs本身質譜響應信號不強，準確測定存在困難，且色譜-質譜聯用法的儀器比較昂貴[8]。本研究旨在通過固相萃取柱將人體尿液中的單胺類神經遞質進行選擇性的萃取富集，采用高效液相色譜熒光檢測法進行分析，建立一種快速、高效、準確測定尿中4種單胺類神經遞質的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀-熒光檢測器（美國沃特世公司）；Agilent C18色譜柱（250mm× 4.6 mm，5 μm）、Waters XBridge C18柱 （250 mm× 4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18柱 （250 mm× 4.6 mm，5 μm）；微量注射器；固相萃取儀（美國色譜科）；CP 225D微量分析天平（德國賽多利斯）；Oasis HLB、Oasis WCX、Oasis WAX固相萃取柱（美國沃特世公司）。

標準品：重酒石酸去甲腎上腺素（美國 Sigma公司），酒石酸腎上腺素（上海阿拉丁試劑有限公司），多巴胺鹽酸鹽（上海源葉生物科技有限公司），5-羥色胺鹽酸鹽（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇（HPLC級，美國默克公司）；乙腈（HPLC級，美國默克公司）；鹽酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙酸銨（分析純，天津化學試劑有限公司）；乙酸鈉（分析純，上?；瘜W試劑總廠所屬上海試劑四廠）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

反相液相色譜柱Agilent C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；進樣量為10 μL；熒光檢測激發波長280 nm，發射波長340 nm；柱溫為30℃；流動相及梯度洗脫程序如表1所示。流動相成分中緩沖液即為含0.1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉 （EDTA-2Na）的0.04mol/L乙酸鈉溶液（pH 4）。

表1 流動相梯度表

1.2.2 樣品的檢測

1）樣品預處理

取新鮮人體尿液2mL，加200μL 1mol/L的鹽酸溶液將尿液進行酸化處理，隨后加入2.0mL 0.5mol/L的乙酸銨，混勻，超聲5 min后，以5 000 r/min離心10min。取上清液，經0.45μm濾膜過濾，濾液于4℃冰箱保存待用。

2）樣品制備

就業關系到國計民生，直接影響社會穩定。中國由于經濟結構調整，面臨較大的就業壓力。而旅游業是一個勞動密集型產業，在緩解就業壓力方面起著重要作用。在旅游就業中，由于旅游非正規就業對教育和技能水平的要求不高，因此在吸收城鎮失業人口和農村剩余勞動力方面發揮著重要的作用，而在旅游非正規就業中，存在著一種規模較大但又經常被人們忽視的就業類型——自我就業。

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis WCX固相萃取柱。取上述處理過的尿樣4 mL上樣，流量為1 mL/min，依次用2 mL 20mmol/L乙酸銨-甲醇溶液、2mL甲醇淋洗雜質，最后用5mL含2%甲酸的乙腈水溶液（85∶15，ν∶ν）洗脫被分析物，流量為0.5mL/min。所得洗脫液氮吹至近干，用初始流動相復溶至1.0mL，經0.22μm濾膜過濾后，供HPLC分析。

1.2.3 標準溶液配制

準確稱取EP、NE、DA和5-HT標準品各20mg，分別置于10mL容量瓶中，加入0.01mol/L的鹽酸溶液，充分震蕩使其溶解并定容至刻度，得質量濃度均為2000μg/mL的標準儲備液，保存于4℃冰箱中。

1.2.4 標準曲線繪制

準確吸取EP、NE、DA和5-HT 4種標準儲備液，用0.01mol/L的鹽酸溶液稀釋為EP 30.0 μg/mL、NE 50.0 μg/mL、DA 50.0 μg/mL和5-HT 20.0 μg/mL的標準應用液。分別準確吸取標準應用液0.01，0.05，0.30，1.00，2.00mL于10mL容量瓶中，初始流動相定容，用HPLC分析，繪制標準曲線。

1.2.5 測 定

取1.2.2方法制備的尿液上樣，進行HPLC分析，保留時間定性，峰面積定量。

2 結果與討論

2.1 固相萃取條件的選擇及優化

固相萃取的效果取決于其填料類型[10]，本實驗分別考察了親水親油平衡柱（Oasis HLB）、弱陽離子交換柱（Oasis WCX）和弱陰離子交換柱（Oasis WAX）對神經遞質的萃取效果，結果見圖1。表明4種單胺類神經遞質在Oasis WCX柱有較好的保留，且回收率最高，雜質去除理想；Oasis HLB回收率次之，但干擾雜質去除不夠理想；Oasis WAX回收率不理想。Oasis WCX柱為弱陽離子交換柱，可吸附帶正電的分子。這4種神經遞質極性比較弱，在中性條件下為不帶電荷的分子，而在酸性條件下成為帶正電荷的弱陽離子。

圖1 不同固相萃取柱對提取回收率的影響

2.1.2 淋洗液的選擇

尿樣成分復雜，含有多種蛋白質和鹽類化合物，會干擾目標化合物的洗脫，因此洗脫之前的凈化步驟也很重要。本文考察了純水、甲醇、5%氨水-水溶液、20 mmol/L乙酸銨-甲醇溶液4種不同溶劑作為淋洗液的去雜質效果，結果表明，先用2 mL 20mmol/L乙酸銨-甲醇溶液，再用2mL甲醇作為淋洗液時，能最大程度去除尿液中的尿酸及部分中性和堿性化合物的干擾，且對于4種單胺類神經遞質在萃取柱有最大保留。

2.1.3 洗脫條件的優化

圖2 不同洗脫液對提取回收率的影響

考察了2%甲酸-甲醇、2%甲酸-乙腈、含2%甲酸的乙腈-水（85∶15，ν∶ν）3種不同的洗脫溶液，結果如圖2所示。結果表明用含2%甲酸的乙腈水溶液洗脫效率最高。洗脫液每次1mL進行洗脫，當用量為5 mL時，4種單胺類神經遞質已完全洗脫，因此，本實驗采用5mL含2%甲酸的乙腈-水溶液（85∶15，ν∶ν）作為洗脫液。

2.1.4 流量的優化

樣品過柱流量也是優化目標化合物固相萃取效果必須考慮的因素，因本實驗的目標樣品為尿樣，基于臨床應用考慮和固相萃取柱的容量，樣品體積一般不會大于10mL，而較小的流量一般都會對回收率提高有積極影響，因此本實驗選擇流量為0.5mL/min。

2.2 分離條件的優化

單胺類神經遞質在水溶液中具有較高的溶解性，造成在一般反相色譜柱保留強度較弱[11]。為了提高穩定性和達到更好的分離效果，選擇酸性溶液加入適量的有機相作為流動相。分別考察了乙腈和乙酸鈉水溶液、甲醇和乙酸鈉水溶液，發現甲醇和乙酸鈉水溶液分離效果與峰形優于乙腈和乙酸鈉水溶液，因此有機相選用了甲醇。為了減少溶液中金屬離子的干擾加入了EDTA-2Na。

流動相的pH是離子對色譜分離的關鍵，4種單胺類神經遞質在酸性條件下穩定性最佳，考察了流動相的pH 2.0～pH 4.0對樣品出峰情況的影響，如圖3所示，結果表明，在pH較小時峰分離不好，在pH 4.0時色譜分離效果最好，故選用pH 4.0的流動相分析。

2.3 色譜條件優化

分別考察了 Waters XBridge C18柱、Waters Symmetry C18柱和Agilent C18柱分離效果，發現Waters XBridge C18柱和Waters Symmetry C18柱對于分離EP和NE效果不夠理想。Agilent C18柱對分析物分離效果最好，因此選用此色譜柱。

圖3 流動相pH對分離效果的影響

選用紫外檢測器，發現峰形過小，靈敏度太低，以致無法檢出[12]。選用電化學檢測器，發現其背景較高且基線波動較大，原因可能是其電極在分析過程中參與氧化還原反應，反應產物累積在電極表面使得檢測靈敏度降低，低濃度分析物難以檢出[13]。故改用熒光檢測器，其基線平穩，選擇性好，可有效分離分析物。用熒光檢測器進行掃描，發現4種單胺類神經遞質在激發波長和發射波長分別為280，340 nm附近有最大吸收峰，樣品溶液雜質干擾小，檢測靈敏度高，故定其為檢測波長。尿液樣品圖譜與樣品加標分離效果如圖4所示。

圖4 尿液樣品圖譜與樣品加標分離效果圖

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍及方法檢出限

采用外標法，配制不同質量濃度的標準溶液進樣測定，以峰面積為縱坐標，樣品質量濃度為橫坐標作圖，繪制標準曲線，以3倍信噪比計算4種單胺類神經遞質的檢出限，結果見表2。線性范圍和檢出限可以滿足嗜鉻細胞瘤等相關疾病診斷的臨床需求。

表2 EP、NE、DA和5-HT的標準曲線

2.4.2 方法的精密度和回收率

取健康人的混合尿，分別加入1，30，200 μL標準應用液，每一質量濃度平行制作5份，連續5d，按1.2.2方法萃取凈化后，氮吹至近干，用初始流動相定容至1.0 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，用HPLC分析，每份測定3次，記錄各種單胺類神經遞質峰面積的平均值，代入當日標準曲線計算測得濃度，考察方法的日內精密度和日間精密度；將測得的各種單胺類神經遞質色譜峰面積與相應質量濃度標準溶液直接進樣測得的色譜峰面積對比，得方法的絕對回收率，結果見表3。日內、日間精密度對于嗜鉻細胞瘤患者用藥前后療效對照具有重要的臨床價值，絕對回收率滿足了4種單胺類神經遞質的檢測要求。

表3 方法的精密度和準確度（n=5）

3 結束語

本文通過對尿液樣品前處理條件和色譜分析條件的優化，選擇了最佳檢測條件，實現了對尿中4種單胺類神經遞質的同時測定，具有操作簡便、靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬、雜質干擾少及結果準確可靠的優點。因尿液基質復雜，尿中4中單胺類神經遞質含量較低，將尿液樣品經鹽酸溶液酸化處理后，在4℃冰箱保存一周結果無顯著變化，對于臨床患者尿液留存有實際意義。本文選用的Oasis WCX固相萃取柱既能實現尿液中復雜干擾物的去除，又能實現待測物的完全保留和洗脫，實現了HPLC-熒光檢測器對4種單胺類神經遞質的完全分離檢測，滿足了尿中單胺類神經遞質的分析測試要求。

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（編輯：莫婕）

Determination of monoamine neurotransmitters in human urine by solid phase extraction-high performance liquid chromatography-fluorescence detector

GAO Hui1，XING Yan1，WANG Yang1，SONG Jinzhi2，WANG Xu2
（1.Zibo Center For Disease Control and Prevention，Zibo 255026，China；2.Hangzhou Medical College，Hangzhou 310053，China）

A rapid and accurate method for detecting pinephrine，norepinephrine，dopamine，serotonin hydrochloridein human urinewasdeveloped.Themonoamineneurotransmitterswere extracted from human urine samples with Waters Oasis WCX solid phase extraction（SPE）cartridges. Then 2 mL 20 mmol/L ammonium acetate-methanol solution，2 mL methanol were used for eluting impurities.Finally，the analyte were extracted by 5 mL acetonitrile-water solution（85∶15，ν∶ν）containing 2%formic acid.The separation was performed on Agilent C18 capillary column（250mm× 4.6 mm，5 μm）followed by different proportion of methanol and sodium acetate solutions gradient elution.Four monoamine neurotransmitters in human urine were detected by high performance liquid chromatography with fluorescence detection（excitation wavelength 280 nm， emission wavelength 340 nm）.The results showed the average recoveries were between 92.2%and 104.8%，the relative standard deviations were between 1.6%and 3.1%，and the limits of detection were between 0.002μg/mL and 0.05μg/mL.The method used in this study is stable，fast and easy.The method has practical value for detecting monoamine neurotransmitters in human urine．

monoamine neurotransmitter；solid-phase extraction；high performance liquid chromatography；fluorescence detection

A

：1674-5124（2017）02-0060-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.02.012

2016-10-10；

：2016-11-29

浙江省科技廳分析測試項目（2015C37009）；浙江省大學生創新科技計劃（新苗項目）（2015R436003）；2014年浙江省高等學校訪問學者專業發展項目（FX2014132）

高 慧（1979-），女，山東淄博市人，主管技師，研究方向為理化檢驗。

王 旭（1980-），女，山東聊城市人，教授，博士，主要從事衛生理化檢驗研究。