人肺癌細胞特異性結(jié)合肽的篩選與驗證

樊敏杰，金 瑾，韓化敏

(拜西歐斯(北京)生物技術(shù)有限公司，北京 100070)

肺癌發(fā)生于支氣管黏膜上皮，發(fā)病率和死亡率增長最快，近50 a來肺癌的發(fā)病率顯著增高，在歐美工業(yè)發(fā)達國家和我國的一些工業(yè)大城市中，肺癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中已居首位，在女性中發(fā)病率也迅速增高，是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1-2]。由于發(fā)病隱匿，早期多無癥狀，幾乎2/3的肺癌患者在就診時已是晚期(Ⅲ～Ⅳ期)，我國肺癌早期診斷率較低，患者5 a生存率僅有10%，國外發(fā)達國家是15%～20%[3-4]，這個差距就是早期診斷問題。臨床上傳統(tǒng)的診斷方法如胸片、支氣管鏡、痰細胞學(xué)檢查等方法，缺乏足夠的特異性和敏感性，因此市場上急需開發(fā)出一種用于臨床診斷方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 隨機十二肽噬菌體展示試劑盒購自美國New England Biolabs公司，包括隨機十二肽噬菌體展示文庫(1.5×1013pfu·mL-1)、E.coli ER2738 宿主菌、-96 gⅢ測序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’；人支氣管上皮細胞16HBE購自廣州吉妮歐生物技術(shù)有限公司；人肺癌細胞A549由中國科學(xué)院生物物理研究所贈送；M13單克隆抗體購自北京義翹神州科技有限公司。

LB培養(yǎng)基：每L含：10 g細菌用胰蛋白胨(英國Oxoid公司，批號LP0042)，5 g酵母提取物(英國Oxoid公司，批號LP0021)，5 g NaCl(上海索萊寶生物科技有限公司，批號S8211)。高壓滅菌，室溫貯存。

LB/IPTG/Xgal平板：將0.25 g異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG，上海索萊寶生物科技有限公司，批號I8070)溶于5 mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)溶液中。溶液于-20 ℃避光貯存。向LB培養(yǎng)基中加入瓊脂粉(15 g·L-1)，高壓滅菌，冷卻至低于70 ℃時，加入1 mL IPTG/Xgal，混勻后平鋪在無菌的細菌用培養(yǎng)平板中。瓊脂凝固后將平板于4 ℃避光貯存。

頂層瓊脂：每L含：10 g細菌用胰蛋白胨，5 g酵母提取物，5 g NaCl，1 g MgCl2·6H2O，7 g瓊脂粉。高壓滅菌，分成50 mL等份。將凝固后的固體培養(yǎng)基貯存于室溫，用時微波爐融化。

四環(huán)素(Tet)(上海索萊寶生物科技有限公司，批號T8180)貯液：以20 mg·mL-1的濃度溶于乙醇中。-20 ℃避光貯存。用前搖勻。

LB-Tet培養(yǎng)基：1 L LB培養(yǎng)基加入1 mL Tet貯液。

LB-Tet平板：向LB培養(yǎng)基中加入瓊脂粉(15 g·L-1)，高壓滅菌，冷卻至低于60 ℃時，加入1 mL Tet貯液，混勻后平鋪在無菌的細菌用培養(yǎng)平板中。凝固后將平板于4 ℃避光貯存。如果平板顯棕色或黑色則不宜使用。

封閉緩沖液：以質(zhì)量分數(shù)3%將脫脂奶粉(美國BD公司，批號232100)溶于磷酸鹽緩沖液中。過濾除菌，4 ℃貯存。

PEG/NaCl：含2.5 mol·L-1NaCl的質(zhì)量分數(shù)20%聚乙二醇(PEG)-8000(上海索萊寶生物科技有限公司，批號p8260)。高壓滅菌，室溫貯存。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞準備 購買復(fù)蘇細胞接收到貨后，更換新的含質(zhì)量分數(shù)10%高糖DMEN培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞融合達80%以上質(zhì)量分數(shù)0.25%胰酶進行傳代，培養(yǎng)3代后取對數(shù)生長期細胞進行實驗。A549細胞同16HBE培養(yǎng)方式一致，培養(yǎng)3代以上可使用。

1.2.2 隨機十二肽噬菌體篩選 取一個培養(yǎng)于T175瓶生長達90%飽和的16HBE細胞，用質(zhì)量分數(shù) 0.25% 的EDTA消化，計數(shù)取1×107個300 g離心5 min，棄上清，用含質(zhì)量分數(shù)3%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液重懸封閉細胞，4 ℃ 2 h。取10 μL原始噬菌體肽庫即1.5×1012的噬菌體稀釋到1.5 mL封閉液內(nèi)，37 ℃ 2 h。封閉過的噬菌體與16HBE細胞混合，孵育吸附2小時。孵育期間取1個培養(yǎng)于T175瓶生長達90%飽和的A549細胞，用質(zhì)量分數(shù)0.25%的EDTA消化，計數(shù)取1×107個細胞300 g離心5 min，1.5 mL封閉液重懸，封閉2 h。將孵育完畢的16HBE細胞，400 g離心5 min，小心吸出上清加入封閉過的A549細胞，孵育2 h。將A549細胞300 g離心5 min，棄掉上清，加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，重復(fù)洗滌10次，將細胞重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液中。取10 μL測定滴度，剩余噬菌體感染E.coli ER2738宿主菌進行擴增，用于下一輪篩選。重復(fù)以上操作進行第2、3、4輪篩選。除第1輪投放噬菌體原始文庫，第2、3、4輪分別采用上一輪洗脫液擴增噬菌體，其余條件均與第1輪一致。每輪篩選前后均使用LB/IPTG/Xgal瓊脂平板測定噬菌體滴度。并計算回收率。經(jīng)4輪淘篩過后，將獲得的特異性噬菌體肽庫，培養(yǎng)于LB/IPTG/Xgal瓊脂平板上，挑分離良好的藍色噬菌斑進行擴增。短期4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 陽性克隆ELISA初步鑒定 將A549細胞以5×104/孔的密度，接種于96孔板，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，加質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛37 ℃固定30 min；加200 μL/孔封閉液37 ℃ 1 h；磷酸鹽洗滌3遍，加噬菌體樣品孵育2 h；磷酸鹽洗滌3遍，加50 μL/孔2 000倍稀釋的M13抗體，37 ℃孵育1 h；洗滌4遍后加100 μL TMB顯色；加50 μL孔2 mol·L-1H2SO4終止，酶標儀450 nm讀數(shù)。以M13K07作為陰性對照，P/N>3為陽性。共篩選394個克隆，初步挑選讀數(shù)較高的10個克隆進行下一步驗證，分別為140、141、179、193、217、278、290、295、362、385。

1.2.4 細胞ELISA檢測陽性克隆靶向性 細胞培養(yǎng)數(shù)量滿足時，分別將16HBE細胞、A549細胞用質(zhì)量分數(shù)0.25%的EDTA消化，計數(shù)取每份5×106個于2 mL離心管內(nèi)，各取9份，300 g離心5 min，1 mL封閉緩沖液重懸于2 mL離心管內(nèi)，4 ℃搖動封閉1 h。同時，將以上得到的每個噬菌體克隆取0.5 mL于2 mL離心管，再分別加入0.5 mL封閉緩沖液，孵育1 h。另取M13K07輔助對照噬菌體同樣方法做封閉處理。將封閉結(jié)束的細胞與封閉結(jié)束后的噬菌體混合到15 mL離心管內(nèi)，4 ℃搖動孵育2 h。將細胞300 g離心5 min，小心吸除上清液，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液吹洗均勻，再300 g離心5 min。如此反復(fù)洗滌細胞5次。將經(jīng)封閉緩沖液2 500倍稀釋的M13抗體分別取0.5 mL加到各份細胞內(nèi)重懸，4 ℃搖動孵育1 h。再洗滌5遍。用100 μL TMB顯色，加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，酶標儀450 nm處讀數(shù)。重復(fù)3次實驗，顯示278號克隆均呈現(xiàn)高親和力。

1.2.5 噬箘體克隆測序分析 將噬箘體擴增上清液，用-96 gⅢ測序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’送北京金唯智生物科技有限公司全自動測序并分析。

2 結(jié)果

2.1 隨機十二肽噬菌體篩選與分析結(jié)果 以16HBE細胞為非特異性吸附，A549細胞為靶細胞，完成4輪的淘篩，通過滴度測定對每輪的投入量與回收量進行分析，呈現(xiàn)逐漸遞增的富集效果。見表1。

表1 差減吸附篩選噬箘體富集效應(yīng)

2.2 陽性克隆ELISA初步鑒定 通過ELISA對第4輪淘篩后394個噬箘體克隆進行初步鑒定，并分析其與肺癌細胞結(jié)合情況，以M13K07噬箘體為陰性對照排除非特異性結(jié)合。以實驗組與對照組OD450 nm比值≥3為標準，優(yōu)選出最高的10組克隆，分別為140、141、179、193、217、278、290、295、362、385。見圖1。

圖1 與A549細胞高親和力噬箘體克隆

2.3 細胞ELISA檢測陽性克隆靶向性 選以上10個陽性克隆，分別與16HBE細胞、A549細胞進行細胞水平ELISA，鑒定其靶向性，結(jié)果顯示，278號淘篩噬箘體克隆顯示出與A549細胞高的靶向性。此克隆與A549高親和力，而與16HBE幾乎沒有結(jié)合。見圖2。

圖2 噬箘體克隆靶向性結(jié)合情況

2.4 DNA測序及同源性分析結(jié)果 將278號克隆(同時將179、193、290、295測序，分析同源性需要)送至北京金唯智生物科技有限公司用試劑盒自帶96 gⅢ測序引物測序，推導(dǎo)出278號噬菌體克隆DNA序列為AGTGATTGGAAGCTTTATACGCAGCCTATTACTCTG，其所編碼的12個氨基酸的多肽的氨基酸序為SDWKLYTQPITL，同時另外4個克隆除295外，均為SDWKLYTQPITL。說明此序列存在高重復(fù)率。經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫比對，未發(fā)現(xiàn)肺癌相關(guān)已知序列，很可能為新發(fā)現(xiàn)靶點序列。

3 討論

噬菌體展示技術(shù)建立于1985年,該技術(shù)通過基因工程改造，將外源基因與絲狀噬箘體融合，獲得的重組噬菌體能被特定抗體所識別。而后在多領(lǐng)域得到了發(fā)展:新型疫苗研制方面的應(yīng)用、酶抑制劑篩選中的應(yīng)用、醫(yī)學(xué)診斷和治療方面的應(yīng)用。近年來主逐漸成為腫瘤靶向治療的研究方向之一[5-7]，在體外已成功淘篩到針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、鼻咽癌細胞等特異性結(jié)合肽，可能在腫瘤的診斷、靶向治療等方面具有潛在的臨床應(yīng)用價值[8-9]。腫瘤標志物是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞所產(chǎn)生或分泌并釋放到血液、細胞、體液中，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)。其具有高效、高靈敏、方便、標本易獲取及創(chuàng)傷輕等優(yōu)點，因此檢測、篩選及鑒定腫瘤標志物一直是肺癌早期診斷研究的重點。

本研究利用A549細胞為靶細胞，16HBE細胞為吸附細胞，經(jīng)過4輪淘篩，共挑選了394個克隆初步進行非特異性排除，優(yōu)選了10個高親和力克隆進行后續(xù)的靶向性鑒定，結(jié)果得到1個克隆與A549細胞高親和力，而與正常16HBE細胞不結(jié)合。測序后得到其序列，數(shù)據(jù)庫BLAST未有肺癌已知相關(guān)序列，但與芽孢桿菌屬硫酸酯酶存在同源性，查閱文獻又發(fā)現(xiàn)Proteobacteria門細菌與人高度同源[10]， 其配體硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，在腫瘤生物學(xué)作用的酶是C6-內(nèi)脫磺基酶(endo-6-O-sulfotase,Sulf),其功能是選擇性去除葡萄糖酰胺六號碳上的磺基。Sulf在哺乳細胞內(nèi)有2個異構(gòu)體,即Sulf1和Sulf2。與肝素酶類似,修飾酶在多數(shù)腫瘤組織中表達增高,可能通過調(diào)節(jié)某些生長因子的活性，從而促進腫瘤的進一步惡化[11]。但肺癌細胞并未見相關(guān)研究報道，結(jié)合機制需要做近一步研究。但已說明噬箘體展示技術(shù)在尋找腫瘤特異性識別多肽的領(lǐng)域具有重要價值，為臨床診治提供了新的實驗依據(jù)。

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