血塞通注射液對體外OGD/R損傷的BV2細胞炎癥反應的影響

洪倩+王實+陳昌秀+掌瑜+王陽+樊媛++馬增春

[摘要]該研究通過對小鼠神經小膠質細胞（BV2）體外模擬腦缺血再灌注（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation， OGD/R）損傷探討血塞通注射液（XST）抗炎癥反應的作用及可能的作用機制。BV2細胞OGD損傷4 h后，通過測定細胞存活率（MTS法）確定復氧時間及血塞通給藥濃度，采用ELISA法檢測細胞上清中炎癥因子TNFα，IL1β，IL6及IL10的分泌水平，蛋白質免疫印跡（Western blot）法檢測細胞中pERK，pJNK，pp38蛋白表達水平的變化，免疫熒光法檢測NFκB p65的核轉位水平。結果顯示XST 25 mg·L-1可顯著提高OGD 4 h/R 6 h引起的細胞活力的下降，并抑制TNFα，IL1β，IL6及IL10的分泌水平的增高，同時XST能下調OGD/R誘導的pJNK，pp38蛋白表達的升高，并逆轉NFκB p65的核轉位。以上研究結果表明 XST對OGD/R損傷的BV2細胞炎癥反應具有顯著的抑制作用，其作用機制可能與抑制前炎癥因子的分泌，調節MAPK信號通路及核轉錄因子NFκB p65有關。

[關鍵詞]血塞通注射液； 體外模擬腦缺血再灌注； 炎癥因子； MAPK； NFκB p65

缺血性腦卒中是常見多發的神經系統性疾病，約占腦卒中的60%～80%[1]，是世界范圍內危害人類健康的重要疾病之一。已有研究表明，小膠質細胞激活后的炎癥反應和免疫應答參與介導缺血性腦卒中的腦損傷過程[2]。小膠質細胞是中樞神經系統（central nervous system，CNS）中參與免疫應答的主要細胞類型，約占所有神經膠質細胞的5%～20%[3]。激活的小膠質細胞通過分泌釋放TNFα，IL1β，IL6，IL10等促炎因子以及NO，ROS等細胞毒性因子造成CNS神經元損傷[4]。血塞通注射液（Xuesaitong injection，XST）含三七總皂苷，三七長于止血、活血、消腫止痛，藥理研究表明，三七有增加冠狀動脈血流量、擴張血管、降低動脈血壓、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、降低血黏度等作用。實驗研究也表明，三七總皂苷制劑具有通利血脈、祛瘀化滯之功，能保護神經細胞，促進吞噬細胞的吞噬功能以及膠質細胞的修復功能，對腦梗死有確切的治療作用[57]。本研究采用BV2細胞體外模擬腦缺血再灌注損傷，考察XST對體外OGD/R誘導BV2神經小膠質細胞炎癥反應及相關的信號通路的影響，闡明XST抗炎的分子機制。

1材料

11細胞株BV2細胞購自中國科學院昆明動物研究所細胞庫，細胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養基加青霉素100 U·mL-1、鏈霉素100 mg·L-1，置37 ℃，5%CO2的培養箱內培養，每隔24 h換1 次培養液，48 h傳代1次。

12藥物與試劑血塞通注射液（XST，云南白藥集團股份有限公司，批號XBl2002）；金納多注射液（JND，批號H6138）；DMEM高糖培養基、DMEM無糖培養基及胎牛血清（Gibco公司）；青鏈霉素混合液（100×）（Biotopped公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；MTS試劑盒（Promega公司）；蛋白質提取試劑盒（QiaGen公司）；腫瘤壞死因子（TNFα）、炎癥因子IL1β，IL6，IL10 ELISA試劑盒（eBioscience公司）；抗體：GAPDH Rabbit mAb，p38 MAPK Antibody，Phosphop38 MAPK （Thr180/Tyr182） Rabbit mAb，SAPK/JNK（56G8） Rabbit mAb，PhosphoSAPK/JNK （Thr183/Tyr185） Rabbit mAb，p44/42 MAPK （Erk1/2） Antibody，Phosphop44/42 MAPK （Erk1/2） （Thr202/Tyr204） Antibody，NFκB p65 Rabbit mAb，PhosphoNFκB p65（Ser536） Rabbit mAb（CST公司）。

13儀器CO2細胞培養箱購自美國Thermo公司；Eppendorf 5810R型高速冷凍多用途離心機（德國）；缺氧小室購自加拿大Stemcell公司；微孔板檢測系統Flex Station 3購自美國MD公司；ChemiDoc XRS系統購自美國Biorad公司；Leica DMI 4000B熒光倒置顯微鏡購于德國徠卡公司。

2方法

21體外模擬腦缺血再灌注（OGD/R）模型的建立體外模擬腦缺血再灌注（OGD/R）模型的建立參考文獻方法并根據本實驗結果略作改動[8]。細胞按一定密度接種于96孔板或6孔板中，培養24 h后，棄上清，用無糖、無血清的DMEM培養基更換，置于缺氧小室中，用95%氮氣、5%CO2混合氣體連續通氣20 min，控制進氣流量為20 L·min-1。隨后，將出氣閥夾緊并將小室置于37 ℃CO2培養箱中繼續培養4 h。缺氧4 h后，氧糖剝奪試驗結束，將細胞置于二氧化塘培養箱中常規培養（37 ℃，95%空氣，5%CO2），復氧同時分別給予血塞通及金納多注射液處理細胞，按照不同試驗需要復氧培養一定時間。

22細胞活力測定將BV2細胞以15×104個/100 μL/孔的密度接種至96孔板中，OGD 4 h后加入不同濃度的血塞通注射液（625，125，25，50，100 mg·L-1），分別復氧15，3，6，12 h，復氧結束后，采用MTS試劑盒檢測細胞活力，按說明書加入20 μL MTS，繼續在培養箱中孵育4 h后，于490 nm處測定各組吸光度A490。

23酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測炎癥因子表達將BV2細胞以15×104個/100 μL/孔的密度接種至96孔板中，按照OGD 4 h/R 6 h執行體外氧糖剝奪試驗，復氧同時給藥，復氧3 h后分別收集各組細胞上清液-80 ℃保存，按照ELISA試劑盒說明書測定各組細胞上清液中腫瘤壞死因子（TNFα）、炎癥因子IL1β，IL6和IL10水平。

24Western blot檢測蛋白質水平將BV2細胞以10×106個/mL/孔的密度接種于6孔板中，按照OGD 4 h/R 6 h執行體外氧糖剝奪試驗，復氧同時給藥，復氧結束后收集各組細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，應用BCA法測定樣品蛋白濃度。經SDSPAGE電泳后，電轉蛋白至PVDF膜，封閉，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗小鼠的p38，Phosphop38 MAPK （Thr180/Tyr182），SAPK/JNK（56G8），PhosphoSAPK/JNK （Thr183/Tyr185），p44/42 MAPK （Erk1/2），Phosphop44/42 MAPK （Erk1/2） （Thr202/Tyr204）一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗兔二抗（1∶2 000）溶液室溫孵育2 h后洗滌膜，ECL法顯影，應用ChemiDoc XRS系統拍照，采用GelPro analyzer 4圖像分析軟件進行顯影條帶灰度值分析。

25免疫熒光檢測NFκB p65核轉位為檢測BV2細胞NFκB p65在細胞中的定位，采用免疫熒光雙標法檢測OGD/R引起的NFκB p65核轉位及藥物的抑制作用。將BV2細胞以80×104個/100 μL/孔的密度接種于96孔板中，24 h后按照OGD 4 h/R 1 h執行氧糖剝脫試驗，復氧同時分別給予50 mg·L-1血塞通及金納多注射液處理細胞1 h。復氧結束后，用1×PBS輕輕洗細胞1次，每孔加入150 μL 4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min，1×PBS洗細胞1次，每孔加入含03% Triton X100的1% BSA室溫透化、封閉細胞1 h，1×PBS洗細胞1次，然后每孔加入100 μL兔抗小鼠NFκB p65一抗（1∶100稀釋），37 ℃孵育2 h（或4 ℃過夜），1×PBS洗細胞3次，加入山羊抗兔IgGCFL 488二抗（1∶250稀釋）37 ℃培養2 h，1×PBS洗細胞3次，加入終濃度為2 mg·L-1 Hoechst 33258染核，孵育10 min后1×PBS洗細胞1次，用Leica DMI 4000B熒光倒置顯微鏡檢測NFκB p65在細胞質和細胞核中的表達，評價其轉核情況及藥物的抑制作用。

26統計學分析所有數據以±s表示，采用SPSS Statistics V170軟件進行統計學處理，OneWay ANOVA分析比較各組均數之間的差異，以P<005為差異有統計學意義。

3結果

31XST對OGD/R損傷的BV2細胞的保護作用為了探討XST對OGD/R損傷的BV2細胞的影響，本研究采用MTS法對不同條件處理后的BV2細胞活力進行了檢測。為獲得最佳的OGD/R條件及藥物給藥濃度，本試驗對BV2細胞OGD時間，復氧時間及XST給藥濃度進行了優化。結果顯示，OGD 1～4 h后，A490明顯降低，與正常組比較有顯著性差異，以OGD 4 h細胞活力下降最低（P<001）（圖1）。隨后檢測了不同復氧時間點BV2細胞的活力，結果顯示，XST作用質量濃度25 mg·L-1可顯著提高OGD 4h/R 6 h組的細胞活力（P<005），因此選擇復氧6 h作為后續對XST給藥濃度的考察及后續試驗條件（圖1）。復氧階段加XST質量濃度達25，50 mg·L-1可顯著提高細胞活力（P<001）（圖1），給藥濃度為625，125，100 mg·L-1時無顯著性差異。因此選擇給藥濃度25 mg·L-1為后續試驗條件。

與對照組相比1）P<005，2）P<001；與OGD/R組相比3）P<005，4）P<001（圖2，3同）。

缺血性腦卒中通過一系列復雜的病理生理事件導致腦損傷，而炎癥反應已被證實為其中的一個關鍵因素[9]。缺血性腦卒中炎癥反應的主要機制是激活小膠質細胞，從而進一步促進神經元的死亡，小膠質細胞被認為是存在于中樞神經系統中的一種特殊的巨噬細胞[10]。小膠質細胞過度活化是導致神經炎癥介質（細胞因子和趨化因子）誘導的疾病進展的本質，能增強神經元損傷。血塞通注射液是從三七中提取有效活性成分而制成的注射液，主要含人參皂苷和三七皂苷，臨床主要用于緩解腦梗死，動脈粥樣硬化，腦栓塞，視網膜靜脈阻塞等癥狀。此外，體外研究表明血塞通注射液能不同程度地抑制ADP和血管膠原誘導的人血小板聚集，其抗血小板聚集作用與拮抗血小板活化因子（PAF）有關[1112]。然而，血塞通注射液對腦缺血神經小膠質細胞激活引起的炎癥反應有無影響一直未得到明確地闡明。 已有研究表明，激活神經小膠質細胞能引起其過度

增殖并向炎癥部位遷移從而分泌大量的神經毒性物質及前炎癥因子介導的神經損傷[1314]。小膠質細胞的激活能通過釋放前炎癥因子及細胞毒因子像IL1β，IL6，TNFα，MIP1a，NO，ROS等影響神經細胞的存活[1516]。因此，選擇能夠抑制OGD/R激活的膠質細胞炎癥介質分泌的藥物理論上能夠改善神經細胞的存活。本研究通過OGD/R模型誘導的BV2細胞炎癥反應，并對血塞通注射液抗炎反應進行考察，同時通過對炎癥相關信號通路的檢測揭示其抗炎癥反應可能的作用機制。

為了獲得對藥物可靠的活性評價結果，本研究首先對氧糖剝脫模型缺氧及復氧時間進行了優化。結果顯示BV2細胞在OGD 4 h/R 6 h后細胞活力明顯降低（約45%），而復氧12 h由于細胞活力的自身恢復導致模型組與正常組之間細胞活力無顯著性差異。同時25 mg·L-1XST能明顯提高OGD/R誘導的細胞活力的下降，因此OGD 4 h/R 6 h條件可用于對藥物活性的評價。利用此條件對XST進行量效關系考察，結果顯示血塞通注射液提高細胞活力為非劑量依賴性，且在25 mg·L-1對OGD/R引起的細胞損傷具有最大的保護效應。此外，已有研究顯示神經小膠質細胞衍生的炎癥因子觸發有害的下游信號通路的激活并促進神經細胞進一步的損傷，包括神經元功能的破壞及直接的神經毒性[17]。細胞活力結果顯示血塞通注射液在25 mg·L-1能顯著提高OGD/R引起的細胞活力的降低，因此，本實驗通過檢測細胞培養液中前炎癥因子的水平來考察血塞通25 mg·L-1的抗炎活性。結果顯示TNFα，IL1β，IL6，IL10水平在BV2細胞OGD/R后較基礎水平（正常組）明顯升高，25 mg·L-1血塞通能顯著抑制炎癥因子的分泌，減輕OGD/R引起的炎癥反應，具有明顯的抗炎活性。結合細胞活力和前炎癥因子的結果，發現血塞通注射液能夠提高細胞存活率，同時降低前炎癥因子水平，提示血塞通注射液可能通過調節細胞存活及凋亡平衡而具有抗凋亡功能。因此，在后續的研究中更進一步的評價來揭示血塞通處理的受益是非常必須的。

盡管上述研究已經證實血塞通具有明顯的抗炎效應，但其作用機制仍沒有得到充分地闡明。腦缺血后神經元的損傷通過氧化應激，炎癥反應或線粒體功能失調最終激活凋亡級聯反應。MAPK信號通路作為腦缺血損傷作用的靶點和介質的重要性已逐漸被認識。出現在腦缺血損傷后產生的氧化應激和炎癥介質已被證實能夠激活MAPK級聯信號而參與神經元的存活和損傷[1820]。由于MAPK信號通路中包含許多重要的參與小膠質細胞分泌和調節炎癥因子的信號分子，其可能在腦缺血疾病中代表了確切的病理學基礎，對于OGD/R誘導的 MAPK信號通路研究具有重要意義[21]。為探討血塞通注射液保護小膠質細胞免受OGD/R損傷的作用機制，本研究對OGD/R引起的BV2細胞MAPK信號通路的變化進行了檢測，并考察血塞通注射液對MAPK蛋白磷酸化水平的影響。結果顯示OGD/R能顯著上調pERK1/2，pJNK1/2和pp38 MAPK 蛋白的表達，25 mg·L-1血塞通注射液能顯著抑制JNK1/2和p38 MAPK的激活，而對pERK1/2蛋白表達的升高無抑制作用。提示JNK1/2和p38 MAPK信號通路可能參與血塞通的神經保護作用。

炎癥反應已經被越來越認識到是腦卒中病理生理過程中重要的貢獻者，炎癥反應引起一系列細胞事件，如循環免疫細胞的滲透和腦居民免疫反應細胞的激活，包括小膠質細胞、星型膠質細胞和內皮細胞等[2223]。NFκB信號通路是這些免疫反應過程的中間調控者，參與誘導前致炎因子和趨化因子如IL1β，IL6，TNFα，iNOS的產生，進而在腦缺血狀態下對神經元介導毒性效應[22]。本研究中OGD/R能顯著誘導前致炎因子的分泌，提示NFκB信號通路可能參與OGD/R誘導的BV2細胞炎癥反應過程，因此，本研究通過免疫熒光法檢測NFκB p65轉核情況來反應NFκB信號通路是否被激活，進而參與OGD/R誘導的炎癥反應。結果顯示，在正常組細胞中NFκB p65蛋白主要集中在細胞質表達，而經過氧糖剝脫及復氧后NFκB p65蛋白大部分在細胞核中高表達，提示OGD/R誘導了NFκB信號通路的活化。而給予血塞通注射液后，NFκB p65蛋白在細胞質和細胞核之間得到重新分配，并大部分重新轉移至細胞質中，提示血塞通注射液對NFκB信號通路的激活具有顯著地抑制作用。基于此研究結果，認為血塞通能通過抑制NFκB信號通路削弱OGD/R損傷誘導的炎癥反應。

基于本次實驗研究結果，血塞通注射液能夠抑制OGD/R誘導的小膠質細胞激活并參與調控NFκB/MAPK信號通路的活化，減少前炎癥因子的分泌而產生抗炎及保護神經元的作用。同時，血塞通注射液可能代表一種治療方法，預防在缺血性疾病中小膠質細胞引起的損傷。進一步的研究需要在整體動物及原代神經元細胞基礎上更深入地闡明血塞通注射液對缺血再灌注損傷的影響及可能的作用機制，為血塞通注射液在臨床用于治療中風偏癱，淤血阻絡動脈粥狀硬化性血栓性腦梗死、腦血栓提供中藥藥理學基礎。

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[責任編輯張寧寧]