金針菇乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選條件的優化與應用

余淑英 盧 艷 王星麗 瞿 亮 孫培龍 張安強*

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金針菇乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選條件的優化與應用

余淑英1盧 艷1王星麗2瞿 亮2孫培龍1張安強1*

（1. 浙江工業大學食品科學技術系，浙江杭州 310014；2. 杭州百山祖生物科技有限公司，浙江杭州 310052)

經優化乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選條件，結合體外乙酰膽堿酯酶的活性，篩選出具有抗阿爾茨海默的高抑制活性的均一金針菇子實體多糖組分；采用改良的Ellman法，建立乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選系統，考察其最大吸收波長、AChE的濃度、ATCI的濃度、顯色劑DTNB的濃度，以及反應體系的時間對系統的影響，最終確定反應體系的最佳條件為：酶反應體系的反應溫度37 ℃，反應時間30 min，最佳檢測波長412 nm，AChE的濃度0.05 u/mL，ATCI的濃度0.10 mmol/L，pH=8.0的100 mmol/L PBS緩沖溶液，顯色劑DTNB終濃度0.066 7 mmol/L，通過乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選發現了金針菇多糖抑制劑。

金針菇多糖；乙酰膽堿酯酶抑制劑；篩選條件優化

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）即老年癡呆癥，是以記憶損傷、認知功能障礙、行為障礙和自理能力下降為特征的慢性神經退行性疾病[1,2]。研究認為，阿爾茨海默病是一種多病因的疾病，膽堿假說是較能夠接受的病理理論，乙酰膽堿酯酶抑制劑是治療該類疾病的有效藥物[3,4]。研究表明，乙酰膽堿酯酶抑制劑不僅能夠提高腦內乙酰膽堿的含量，而且能夠阻止Aβ淀粉斑的形成[1~5]。這對于阿爾茨海默（AD）和很多神經系統疾病的發病病理的研究和初期治療具有非常重要的作用。乙酰膽堿酯酶抑制劑是目前美國FDA唯一允許用作治療老年癡呆癥的藥物，其中有4種藥物獲得許可，分別為塔克林（Tacrine），加蘭他敏（Galantamine）、多奈哌齊（Donepezil）、利斯的明（Rivastigmine）[6,7]，多屬于生物堿類。老年癡呆癥具有發病緩慢、持久的特點，需要長期服藥才能見效，而上述幾種藥物多半衰期短，易引起患者肝、胃器官不適等副作用，嚴重阻礙了其應用。而從天然產物中開發的適宜患者長期服用、毒副作用小、作用面廣的乙酰膽堿酯酶抑制劑則成了一個研究的熱點[2]。

金針菇被譽為“增智菇”，富含蛋白質、多糖、脂類等，其多糖粗提物能改善記憶障礙模型小鼠的學習記憶能力。范青生等的研究表明，金針菇菌絲體懸液具有顯著增強小鼠學習能力，鞏固和強化小鼠記憶的作用；并能增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，增加T細胞的數目，促進溶血素抗體的生成[8]。袁仲研究發現金針菇子實體可顯著改善記憶力障礙小鼠的學習記憶能力，且可活化淋巴細胞而產生免疫反應[9]。鄒宇曉等研究發現，金針菇多糖粗提物可有效改善模型小鼠、大鼠的學習記憶能力，從動物行為學指標上證明了多糖的改善記憶功能[10]。楊文建等通過研究金針菇不同提取物（水相、石油醚相、乙酸乙酯相和乙醇）的體外乙酰膽堿酯酶活性，發現水提物具有較強的乙酰膽堿酯酶的抑制活性[11]。為了探索金針菇改善記憶力的作用機制，本課題對乙酰膽堿酯酶抑制活性的篩選條件進行優化，得到了金針菇多糖抑制乙酰膽堿酯酶活性的最佳條件，為新型乙酰膽堿酯酶抑制劑的設計合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇子實體由杭州百山祖生物科技有限公司提供，粉碎成細粉狀備用。試劑有碘代硫代乙酰膽堿（Acetyhhiocholine, ATCI，美國sigma公司）、乙酰膽堿酯酶（Acetyl cholinesterase, AChE，美國sigma 公司）、二硫二硝基苯甲酸（5,5`-Dithio bis-2- nitrobenzoic acid，DTNB，美國sigma公司）、十二烷基磺酸鈉（SDS，分析純，純度＞99.0%，美國sigma 公司）、陽性對照石杉堿甲（Huperzine A，純度＞99.0%），均購自阿拉丁試劑公司，其他均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機（日本Hitachi（日立）公司），數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫療儀器廠），SENCO旋轉蒸發器（上海申生科技有限公司），Spectra Max M5微孔板檢測系統（美國Molecular Devices公司），96孔酶標板（美國康寧公司），DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司），ALPHA 2-4 LD冷凍干燥機（德國Christ公司），Waters1525 高效液相儀（美國Waters公司），Waters2414 示差檢測器（美國Waters公司），TSKgel G4000PWXL 高效液相色譜柱（日本TOSOH公司）。

1.3 方法

（1）金針菇多糖的制備。稱取烘干至恒重的金針菇子實體1 600 g進行粉碎，95%乙醇回流（脫去部分脂類、色素以及其他一些小分子物質），超聲輔助水提醇沉法[5] 提取，離心，得到的上清液分別用40%、60%、80%乙醇沉純，再離心得上清液40%、60%、80%組分。采用savage法，即用氯仿︰正丁醇（4︰1）溶液反復萃取3～4次，離心除去有機試劑層，濃縮揮干殘余有機試劑，除去粗多糖中游離的蛋白，各組分溶液冷凍干燥得到黃色固體粉末，分別命名為FVP40、FVP60和FVP80。

（2）乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選優化條件。

AChE在100 mmol/L、37 ℃、pH=8.0的PBS中保持良好的活性[12]，選用該條件下的PBS及反應溫度。根據Ellman法[13]，反應體系檢測波長選擇412 nm。配置1 U/mL的AChE稀釋液400 μL，分別吸取上述AChE稀釋液10、20、40、60、80、100 μL于6個編號的潔凈干燥離心管中，用PBS（c=100 mmol/L，pH=8.0）緩沖溶液補充體積到100 μL，得到不同濃度的AChE標準溶液。取10 μL上述不同濃度的AChE溶液，70 μL pH=8.0的PBS，20 μL 1 mmol/L的DTNB溶液于96孔酶標板中，37 ℃、預孵2 min，加入20 μL1 mmol/L的底物ATCI溶液，37 ℃恒溫反應，每隔90 s測定412 nm處吸光度值（OD），PBS（c=100 mmol/L，pH=8.0）緩沖溶液為空白對照，60 min，重復3次，確定酶反應終濃度[14]。

圖1 總糖的標準曲線

注：為雙倒數圖，縱軸上的截距為1/Vm，橫軸上的截距為-1/Vm，直線的斜率為Km/Vm。

底物ATCI終濃度的確定[15]：PBS（c=100 mmol/L，pH=8.0）緩沖溶液為空白對照，對0.1、0.13、0.2、0.3、0.6、0.8、1.2 mmol/L的ATCI溶液反應初速度進行測定，測試條件同上，每隔60 s測定412 nm處吸光度值，共45 min，平行測3次，以確定最終ATCI濃度。

顯色劑DTNB終濃度的確定[16]：配置1.0 mmol/L DTNB儲備液。PBS緩沖溶液為空白對照，分別對0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L不同濃度的DTNB溶液的反應初速度進行測定，測試條件同酶反應終濃度。3次平行試驗。

反應時間的確定[17]：體系反應時間確定的測試條件同酶反應終濃度，每隔60 s測定一次412 nm處OD值。PBS緩沖溶液代替AChE溶液為空白對照。測定3次，3次平行試驗。

樣品抑制率：將樣品配成各種濃度待測。吸取10 μL 不同濃度的樣品溶液，70 μL pH=8.0的PBS，20 μL DTNB溶液于96孔酶標板中，37 ℃、預孵2 min，后加20 μL ATCI溶液，37 ℃恒溫反應30 min再加入20 μL SDS終止反應，酶標儀412 nm處測定吸光度值。完全抑制組用10 μL石杉堿甲溶液代替10 μL樣品溶液；空白組用10 μL PBS（pH=8.0）代替10 μL樣品溶液，樣品對照組用15 μL LPBS（pH=8.0）代替15 mL AChE溶液。

2 結果與分析

2.1 粗多糖的分離

（1）總糖的標準曲線。根據苯酚－硫酸法所測定的結果畫出散點圖的總糖標準曲線（圖1），散點擬合的直線方程為=0.008 5+0.024 9，2=0.995 5。其中為葡萄糖含量（μg），為490 nm處的吸光值。

（2）還原糖的標準曲線。DNS比色法測得還原糖標準曲線（圖2），散點擬合直線方程為=0.008 5+0.024 9，2=0.997 7。其中為葡萄糖含量（μg），為520 nm處的吸光值。

（3）FVP40、FVP60、FVP80組分的多糖。 采用水提醇沉法得到的各組分，根據還原糖的標準曲線方程和總糖的標準曲線方程，可求得FVP40、FVP60、FVP80粗多糖的還原糖和總糖的含量。HPLC測得各組分的液相數據，可根據標準曲線計算得到分子量范圍（表1）。

表1 三組分的粗多糖產量、糖含量及分子量

2.2 乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選優化條件

（1）酶反應終濃度[18]。以不同酶濃度下的反應初速度0為縱坐標，酶濃度為橫坐標作線性回歸圖（圖3），得到線性回歸方程：=0.207 5+0.000 4，相關系數=0.994 2。結果表明，直接反應酶濃度與吸光值成正比例關系，乙酰膽堿酯酶在0～0.066 7 U/mL范圍內保持良好的線性關系，故反應體系酶終濃度應控制在0.066 7 U/mL以內。由于實驗室條件限制，查閱相關文獻，乙酰膽堿酯酶的終濃度確定為0.05 U/mL。

圖3 乙酰膽堿酯酶濃度與反應初速度的關系

圖4 乙酰膽堿酯酶活性的Lineweaver-Burk曲線

圖5 顯色劑DTNB終濃度與吸光值的關系

圖6 乙酰膽堿酯酶反應過程曲線圖

（2）底物ATCI終濃度[19]。按Lineweaver-Burk法作雙倒數圖（圖4）[20]，可得米氏常數Km的值為0.095 mmol/L。由于在篩選酶抑制劑時，并不知道抑制劑的作用類型，為減少IC50的誤差，使篩選體系靈敏度更高，所用底物的濃度應接近Km值，因此該反應體系的底物ATCI終濃度確定為0.10 mmol/L。

（3）顯色劑DTNB終濃度。在酶濃度0.05 U/mL和底物濃度0.10 mmol/L條件下，吸光度值隨著衍生劑DTNB的濃度增大而增大（圖5）。當顯色劑DTNB濃度達到0.007 mmol/L時吸光值不再增大，說明反應已達飽和，結合實際操作，顯色劑DTNB的終濃度確定為0.066 7 mmol/L。

（4）反應時間[21]。AChE催化水解ATCI需要一定的時間，若反應時間過短，吸光度值太小，背景干擾比較大；反應時間過長，AChE活性則會出現衰減，不能準確測定酶的活性。結果如圖6所示，在30 min之內乙酰膽堿酯酶的反應呈良好的線性關系，反應處在穩態階段[22]。為了在較短的時間內得到較為準確的實驗數據，選取30 min作為反應時間，此時的OD412可間接反映其反應速率。

2.3 乙酰膽堿酯酶抑制活性的篩選條件

反應體系的總體積120 μL，緩沖體系pH=8.0的100 mmol/L PBS緩沖溶液，AChE終濃度為0.05 U/mL，ATCI終濃度為0.10 mmol/L，顯色劑DTNB終濃度為0.066 7 mmol/L，體系反應溫度37 ℃，反應時間30 min，測定波長為412 nm。此外，當石杉堿甲的濃度為70 μg/L[2]時，已達到了酶篩選模型的標準，所以陽性對照為70 μg/L的石杉堿甲。

2.4 FVP40、FVP60、FVP80三組分乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究

分別配制三組分0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液。采用2.3節的酶活測試條件，酶標儀中反應30 min后測412 nm處的吸光值。結果如圖7所示，FVP60組分濃度為0.8 mg/mL時對乙酰膽堿酯酶活性的抑制率最高，達到46.17%，此時FVP80組分的乙酰膽堿酯酶活性抑制率最低。總的來看，三組分對乙酰膽堿酯酶的抑制能力為FVP80＜FVP40＜FVP60，并隨樣品濃度的增加呈現出先增強后減弱的趨勢，FVP60表現出較好的乙酰膽堿酯酶的抑制活性。

3 討 論

采用改良的Ellman法建立了金針菇乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選優化條件：100 mmol/L、pH=8.0 PBS緩沖溶液，AChE、ATCI、顯色劑DTNB的終濃度分別為0.05 u/mL、0.10 mmol/L、0.066 7 mmol/L，陽性對照石杉堿甲70 μg/L，體系反應溫度37 ℃，反應時間30 min，測定波長412 nm。該法準確可靠，靈敏度高，重現性好，能夠達到對抑制物的快速篩選。且在此條件下測定從金針菇子實體中提取的三個組分均對乙酰膽堿酯酶表現顯著的抑制活性，其中FVP60組分在0.8 mg/mL濃度下對乙酰膽堿酯酶活性的抑制率最高，達46.17%。以上結果表明，金針菇多糖對乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究具有巨大的潛力，為金針菇多糖的進一步開發和利用提供了一定的科學依據，同時也為老年癡呆癥的治療藥物研制提供一種新的思路。

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Optimization and application of acetylcholinesterase inhibitor screening criteria from the fruiting body of

Yu Shuying Lu Yan Wang Xingli Qu Liang Sun Peilong Zhang Anqiang

（1. Department of Food Science and Technology, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China）（2. Hangzhou Baishanzu Biological Science and Technology Co. Ltd, Hangzhou 310052, China）

In order to optimize the screening conditions for acetylcholinesterase inhibitors and combine with in vitro activity of acetylcholinesterase and screen with high inhibiting activity of anti-Alzheimer uniformpolysaccharide. The improved Ellman method was used to establish an acetylcholinesterase inhibitor screening system and investigate influences on the system by the maximum absorption wavelength, the concentration of AChE, ATCI concentration, the concentration of reagent DTNB, time of system, and ultimately determine the optimum conditions of the reaction system. A screening model for AChEIs was optimized with temperature 37 ℃, reaction time 30 min, wavelength 412 nm, the concentration of AChE 0.05 u/mL, a concentration of ATCI 0.10 mmol/L, 100 mmol/L PBS buffer solution pH=8.0, color agent DTNB final concentration 0.066 7 mmol/L; Through the screening of acetylcholinesterase inhibitors found FVP inhibitors.

polysaccharide of; acetylcholinesterase inhibitor; screening and optimization

S646

A

2095-0934（2017）01-034-06

國家十二五科技支撐項目“食用菌深加工產品開發與產業化”（2013BAD16B07）

，E-mail：zhanganqiang@zjut.edu.cn