遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理對(duì)血清miRNA表達(dá)水平的影響及對(duì)心肌保護(hù)作用的研究

鄭浩　陳菲菲　王玨

[摘要] 目的 觀察遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理對(duì)血清miRNA的表達(dá)水平的影響及對(duì)心肌的保護(hù)作用。 方法 選擇2012年7月～2013年12月本院收治的合并心力衰竭的瓣膜病患者60例，隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，各30例。兩組患者入院后行相關(guān)評(píng)估，麻醉誘導(dǎo)后，觀察組患者行遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理，對(duì)照組同樣放置壓力帶，但不進(jìn)行充氣，后建立體外循環(huán)并行手術(shù)。檢測(cè)患者手術(shù)前、手術(shù)24 h后患者血清肌鈣蛋白I（cTnI）、腦鈉素（BNP）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）的變化；采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR（qRT-PCR）來(lái)測(cè)定miRNA的表達(dá)；觀察兩組患者術(shù)后呼吸機(jī)使用時(shí)間、ICU停留時(shí)間，并采用超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)手術(shù)后7 d左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；記錄兩組患者術(shù)后心律失常評(píng)分及自動(dòng)復(fù)跳率。 結(jié)果 手術(shù)24 h后，兩組患者生化指標(biāo)較手術(shù)前均有所升高，但觀察組升高程度不及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；手術(shù)24 h后，兩組患者miRNA表達(dá)水平較手術(shù)前均有所升高，觀察組miRNA-1升高程度不及對(duì)照組，miRNA-21、miRNA133a升高程度大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；觀察組患者心律失常評(píng)分均小于對(duì)照組，手術(shù)中心臟復(fù)跳后LVEF及自動(dòng)復(fù)跳率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 遠(yuǎn)端缺血處理可減少再灌注后心肌損傷，產(chǎn)生一定的心肌保護(hù)作用，并有可能通過(guò)抑制miRNA-1的表達(dá)、促進(jìn)miRNA-133、miRNA-21的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞] 遠(yuǎn)端缺血處理；miRNA；心肌損傷；再灌注；心律失常

[中圖分類號(hào)] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）30-0005-04

體外循環(huán)技術(shù)使心臟手術(shù)成為可能，但其同時(shí)會(huì)造成心肌細(xì)胞的缺血、缺血及再灌注損傷，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞凋亡，損傷心功能[1]。為改善體外循環(huán)過(guò)程中對(duì)心肌保護(hù)，部分藥物被用來(lái)減少心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷，但迄今為止尚無(wú)明確的方法來(lái)改善體外循環(huán)的心肌保護(hù)過(guò)程[2]。缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IPC）是一項(xiàng)內(nèi)源性的適應(yīng)性反應(yīng)保護(hù)策略，它是通過(guò)簡(jiǎn)短交替實(shí)行缺血/再灌注，以提高隨后缺血損傷的抵抗能力[3]。“處理”后的患者心臟可以更長(zhǎng)時(shí)間的耐受缺血再灌注所產(chǎn)生的損傷，已在臨床證實(shí)為一種有效的內(nèi)源性心肌保護(hù)策略。隨后發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)離心臟的組織及器官進(jìn)行缺血預(yù)處理亦能產(chǎn)生同樣的心肌保護(hù)作用，將其稱為遠(yuǎn)端預(yù)處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）[4]，而microRNA[5]是一類長(zhǎng)度在20～23個(gè)核苷酸片段的非編碼小RNA分子，具有負(fù)性調(diào)節(jié)基因的作用，本研究旨在觀察遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理對(duì)瓣膜性心臟病患者血清中miRNA表達(dá)水平及心肌保護(hù)作用的影響，為臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選擇2012年7月～2013年12月本院收治的合并心力衰竭的瓣膜病患者60例，患者均完善術(shù)前檢查及準(zhǔn)備，進(jìn)行心功能及運(yùn)動(dòng)耐量評(píng)估。心功能評(píng)價(jià)依靠MRI和超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，固定MRI操作醫(yī)生和超聲心動(dòng)圖操作醫(yī)生；運(yùn)動(dòng)耐量應(yīng)用6 min步行試驗(yàn)。患者知曉本實(shí)驗(yàn)研究，簽署知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)[6]：患者為瓣膜性心臟病，符合美國(guó)2006年瓣膜性心臟病指南的Ⅰ類和Ⅱa類適應(yīng)證；嚴(yán)重左室功能低下，MRI顯示左室EF≤30%，超聲心動(dòng)圖顯示左室EF≤40%；既往無(wú)頻發(fā)室性心律失常，或存在惡性室性心律失常病史；患者無(wú)認(rèn)知障礙，依從性佳，可配合治療以及參與系列功能檢查，愿意參加術(shù)后隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：3個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)急性心梗；合并惡性腫瘤，合并血液系統(tǒng)疾病，血液檢查異常：白細(xì)胞計(jì)數(shù)≤4 000/μL或≥10 000/μL，血紅蛋白≤10 g/dL，血小板計(jì)數(shù)≤100 000/μL；或凝血功能異常；不能進(jìn)行MRI檢查；1年內(nèi)參加其他藥物的臨床試驗(yàn)；嚴(yán)重肝腎疾病[AST（GOT）>100 IU/L，或ALT（GPT）>100 IU/L]，不能耐受試驗(yàn)；孕婦或處于哺乳期；即往有嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)病史；具有其他不適合臨床試驗(yàn)的情況。將60例患者分為對(duì)照組和觀察組，每組30例。兩組患者年齡、性別、病程、瓣膜病變類型等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方式 采用維庫(kù)溴銨、咪達(dá)唑侖誘導(dǎo)，行氣管插管，中心靜脈及橈動(dòng)脈分別置管，連續(xù)監(jiān)測(cè)患者生命指征及動(dòng)脈血壓，同時(shí)監(jiān)測(cè)體溫。手術(shù)時(shí)給予異丙酚，速度維持在（4～6）μg/（kg·h），間斷給予芬太尼，速度維持在（8～10）μg/（kg·h），同時(shí)吸入七氟醚。

1.2.2 遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理方法[7] 麻醉誘導(dǎo)后，將患者左側(cè)上臂進(jìn)行遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理，用特用壓力袖帶包繞左上臂，每次5 min，共重復(fù)3次，壓力200 mmHg。檢測(cè)指尖氧飽和度下降到80%以下為陽(yáng)性。5 min間期進(jìn)行再灌注。對(duì)照組同樣放置壓力帶，但不進(jìn)行充氣，共30 min。患者及手術(shù)醫(yī)生進(jìn)行雙盲操作。

1.2.3 體外循環(huán)的建立及手術(shù)[8] 采用正中胸骨切口，于升主動(dòng)脈遠(yuǎn)端插入灌注管，上下腔靜脈分別插腔靜脈引流管，單純主動(dòng)脈瓣置換插房腔管，右上肺靜脈置管行左心引流，建立體外循環(huán)。兩組患者均在常規(guī)淺低溫、中度稀釋體外循環(huán)下行心內(nèi)直視瓣膜置換手術(shù)，采用冷晶心肌保護(hù)液順灌保護(hù)心肌。體外循環(huán)：采用常規(guī)預(yù)充復(fù)方氯化鈉500 mL，羥乙基淀粉或號(hào)拍酷明膠1000 mL，甘露醇200 mL，肝素30 mg，硫酸鎂1 g。可采用速尿維持晶膠比范圍在0.6～0.7，必要時(shí)使用濃縮紅細(xì)胞或血漿維持術(shù)中紅細(xì)胞比容為0.20～0.25。術(shù)中抗凝使用肝素。心臟停跳期間維持體溫31℃。灌注流量維持（2.2～2.6）L/（min·m2）體表面積。阻斷升主動(dòng)脈后，采用1∶4冷晶-血液20 mL/kg，以250 mL/min的速度從主動(dòng)脈根部灌注，每隔半個(gè)小時(shí)用1∶8冷晶-血液10 mL/kg復(fù)灌。全部手術(shù)均由相同的手術(shù)醫(yī)師完成。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo)[9，10]

（1）采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)患者手術(shù)前、手術(shù)24 h后的血清肌鈣蛋白I（cTnI）、腦鈉素（BNP）、肌酸激酶同工酶 （CK-MB）的變化。（2）前期研究已采用miRNA芯片檢測(cè)RIPC后患者血清miRNA表達(dá)譜改變，獲得變化倍數(shù)大于2倍可能參與遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理的miRNA（miRNA-1、miRNA-21、miRNA133a），采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR（qRT-PCR）來(lái)測(cè)定上述miRNA的表達(dá)，檢測(cè)過(guò)程按照上海康成公司提供試劑盒說(shuō)明來(lái)進(jìn)行。（3）采用超聲心動(dòng)圖儀器監(jiān)測(cè)兩組患者手術(shù)中心臟復(fù)跳后左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。（4）記錄兩組患者術(shù)后心律失常評(píng)分及自動(dòng)復(fù)跳例數(shù)，參照 Curtis-Walker標(biāo)準(zhǔn)[4]評(píng)價(jià)術(shù)后患者心律失常評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下：未出現(xiàn)心律失常計(jì)0分；房性心律失常，偶發(fā)室早計(jì)1分；室早二聯(lián)律、三聯(lián)律、頻發(fā)室早、二度房室傳導(dǎo)阻滯計(jì)2分；短陣室速，多源室早計(jì)3分；室速，三度房室傳導(dǎo)阻滯計(jì)4分；室顫計(jì)5分。自動(dòng)復(fù)跳率=自動(dòng)復(fù)跳例數(shù)/總?cè)藬?shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者手術(shù)前及手術(shù)后24 h心肌壞死標(biāo)志物的比較

手術(shù)前，兩組患者cTnI、BNP、CK-MB比較無(wú)明顯差異（P>0.05），手術(shù)24 h后，兩組患者上述指標(biāo)較手術(shù)前均有所升高，但觀察組升高程度不及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.2 兩組患者手術(shù)前后miRNA-1、miRNA-21、miRNA133a的檢測(cè)表達(dá)比較

手術(shù)前，兩組患者miRNA-1、miRNA-21、miRNA133a比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），手術(shù)24 h后，兩組患者上述指標(biāo)較手術(shù)前均有所升高，觀察組miRNA-1升高程度不及對(duì)照組，miRNA-21、miRNA133a升高程度大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

2.3 兩組患者手術(shù)中心臟復(fù)跳后LVEF、心律失常評(píng)分及自動(dòng)復(fù)跳率比較

觀察組患者心律失常評(píng)分均小于對(duì)照組，手術(shù)中心臟復(fù)跳后LVEF及自動(dòng)復(fù)跳率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理（RIPC）是一種無(wú)創(chuàng)性[11，12]的由機(jī)體自身啟動(dòng)內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，能對(duì)機(jī)體器官的缺血再灌注損傷進(jìn)行保護(hù)。對(duì)該過(guò)程的機(jī)制研究有助于心肌缺血再灌注損傷及其他器官如腦、肝臟等器官的缺血再灌注損傷的保護(hù)，并且對(duì)于器官移植過(guò)程中造成的缺血再灌注損傷也有一定的作用。近年來(lái)，越來(lái)越多研究顯示[13，14]遠(yuǎn)程預(yù)處理無(wú)論應(yīng)用在心臟或心臟外其他器官均能減少再灌注損傷，且通過(guò)非心臟的其他器官（如腎、肝或腸）或組織（上下肢骨骼肌）的缺血預(yù)處理來(lái)保護(hù)遠(yuǎn)處的心肌缺血損傷。遠(yuǎn)程心臟保護(hù)作用也可以不通過(guò)缺血刺激，而是通過(guò)遠(yuǎn)膈器官如肢體的缺血刺激、局部使用辣椒素和非創(chuàng)傷外周傷害性切口來(lái)實(shí)現(xiàn)心臟保護(hù)作用。RIPC的機(jī)制[15，16]：主要由三部分組成。遠(yuǎn)端組織激活或產(chǎn)生促動(dòng)子、遠(yuǎn)端組織和心臟之間的交流、心肌內(nèi)保護(hù)現(xiàn)象的誘導(dǎo)[17]。當(dāng)前研究多將其機(jī)制與缺血預(yù)處理的研究機(jī)制聯(lián)系在一起。譬如，包括腺苷、緩激肽、鴉片體被認(rèn)為是可能的遠(yuǎn)端啟動(dòng)子。但是，至今尚未找到明確的作用機(jī)制。近期，研究人員在一些模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)RIPC可能包括某種未明確的“小的疏水分子”的血源性體液因子參與反應(yīng)[18]。

現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)miRNAs幾乎能夠調(diào)控所有心臟病理生理過(guò)程，包括心臟重塑，發(fā)育，纖維化過(guò)程，以及細(xì)胞凋亡，血管新生，心肌收縮力和心臟電生理[19]，相關(guān)心肌梗死后的miRNA調(diào)控也有較多報(bào)道，多集中于調(diào)控心梗后心肌凋亡，缺血再灌注損傷。同一個(gè)miRNA一般能夠作用于成百個(gè)不同的靶點(diǎn)mRNAs，這些靶點(diǎn)在一定程度上部分關(guān)聯(lián)，從而使miRNA能夠在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上游整體調(diào)控比較復(fù)雜的病理過(guò)程或疾病狀態(tài)。miRNA-1[16]具有心肌和骨骼肌的表達(dá)特異性，可負(fù)性調(diào)控靶基因HSP70蛋白的表達(dá)，而許多研究發(fā)現(xiàn)HSP70蛋白可以減輕缺血-再灌注損傷，從而對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用，而miRNA-133同樣在心臟和骨骼肌的肌細(xì)胞中特異性表達(dá)，在心臟中的miRNA-133其表達(dá)可受到心臟轉(zhuǎn)錄因子SRF的調(diào)控，并對(duì)SRF具有負(fù)反饋?zhàn)饔谩ＥcmiRNA-1相反的是miRNA-133可促進(jìn)心肌原細(xì)胞的增殖，并抑制細(xì)胞分化，從而起到保護(hù)心肌的作用。而miRNA-21可以調(diào)控PDCD4基因的轉(zhuǎn)錄，并借此減少心肌梗死的發(fā)生率，抑制心肌細(xì)胞凋亡[20]。

本研究結(jié)果顯示，RIPC處理后患者較對(duì)照組患者心臟損傷更小，且發(fā)生心律失常可能性更低，自主復(fù)跳率更高，而術(shù)后miRNA-1、miRNA133a、miRNA-21均升高，但較對(duì)照組miRNA-1有所減低，miRNA133a、miRNA-21有所升高，與前期研究結(jié)果吻合。

綜上所述，遠(yuǎn)端缺血處理可減少再灌注后心肌損傷，產(chǎn)生一定的心肌保護(hù)作用，并有可能是通過(guò)抑制miRNA-1的表達(dá)，促進(jìn)miRNA-133、miRNA-21的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。

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（收稿日期：2016-06-12）