微小RNAs在牙釉質發育過程中的表達和作用

周雅川 周學東 鄭黎薇

口腔疾病研究國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學華西口腔醫院，成都 610041

微小RNAs在牙釉質發育過程中的表達和作用

周雅川 周學東 鄭黎薇

口腔疾病研究國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學華西口腔醫院，成都 610041

微小RNAs（microRNAs）是一類內源性的短鏈非編碼RNA，在轉錄后水平調控基因的表達，在各項生物發生過程中發揮重要的調控作用。牙釉質發育過程中任何信號的干擾和突變都可能導致牙釉質形成障礙。本文對miRNAs在牙釉質發育過程中的表達和作用機制進行綜述。

微小RNA； 釉質發育； 成釉細胞； 表達

牙釉質是人體中最堅硬的礦化組織，由有序排列的羥磷灰石晶體組成，在人體中行使咀嚼、保護和美觀等功能。牙釉質發育伴隨著成釉細胞的分化和牙釉質基質的分泌、礦化過程[1]。發育過程中任何信號的干擾和突變都可能導致牙釉質形成的障礙，如釉質發育不全（amelogenesis imperfecta， AI）。

微小RNAs（m icroRNAs，miRNAs）是一類短鏈的非編碼RNA，能與靶基因mRNA的3’端非編碼區（3’ untranslated region，3’UTR）特異性地結合，在轉錄后水平調節基因的表達，在各項關鍵的生物發生過程中發揮了重要的作用[2-3]。本文概述了人及嚙齒類動物牙釉質的正常結構及發育過程，總結了m iRNAs在釉質發育過程中的時空性表達譜，探討了其參與的相關信號網絡調控機制，從而對miRNAs在釉質發育過程中的表達及作用有深入的認識，為釉質發育相關的臨床疾病的診治提供理論基礎。

1 釉質發育

1.1 牙釉質的結構特點

牙釉質是人體內高度礦化的堅硬組織，由小于1%的有機質和大量的無機成分構成，緊密排列的羥磷灰石晶體聚集成簇，形成釉柱和釉間柱交錯的結構，為釉質的硬度和彈性提供了物質和結構基礎[1,4-5]。釉質基質依賴于成釉系細胞的合成和分泌功能，然而伴隨著牙齒的萌出，成釉細胞的凋亡限制了釉質的再生[5]。

嚙齒類動物如小鼠的切牙釉質的結構與人牙釉質類似，但其只分布在切牙的唇側。其牙釉質結構從內到外大致分為四層：內層無釉柱結構層、釉柱交錯結構層、釉柱平行排列結構層、表層無釉柱結構層[6-7]。小鼠切牙的釉質隨著切端的不斷磨耗，具有終身生長的特點，因此成為研究釉質發育過程的最佳模型[8]。

1.2 牙釉質的發育過程

1.2.1 人牙釉質的發育過程 牙發育過程伴隨著口腔上皮組織和間充質組織的相互作用。早期的牙胚發育始于口腔上皮層增厚，并內陷入間充質組織形成上皮蕾狀結構。隨著發育的進程，逐漸形成帽狀期和鐘狀期牙胚[9]。鐘狀期牙胚的成釉器結構最終分化形成釉質。成釉器包括內釉上皮層（inner enamel epithelium，IEE）、中間層（stratum intermedium，SI）、星網狀層（stellate reticulum，SR）和外釉上皮層（outer enamel epithelium，OEE）。從鐘狀期開始，IEE快速向成釉向序列性分化，依次形成前成釉細胞、前分泌期成釉細胞、分泌期成釉細胞和成熟期成釉細胞。前成釉細胞通過基底膜與牙本質細胞相鄰，當成牙本質細胞開始分泌形成牙本質基質后，基底膜結構消失，前分泌期成釉細胞在牙本質基質礦化環境中進一步分化形成具有分泌功能的分泌期成釉細胞。分泌期成釉細胞靠近分泌端細胞膜形成典型細胞突起，稱為Tomes突，分泌釉質基質蛋白，如釉原蛋白（amelogenin，AMEL）、成釉蛋白（ameloblastin，AMBN）、釉蛋白（enamelin，ENAM）[10]等，釉質層增厚。Tomes突含有分泌功能和無分泌功能的兩側細胞膜結構[11]，由此決定了釉質晶體的構象排列，為釉質的進一步礦化提供了支架結構。隨著成釉系細胞的進一步分化，成熟期成釉細胞的分泌端細胞膜呈現鋸齒狀或平滑面兩種交替變化的結構[12]，分泌基質蛋白酶[13]（如KLK4，MMP20等），降解基質蛋白，為釉質的礦化進行調整空間結構。隨著釉質層的增厚和礦化過程，釉質的硬度不斷加強，形成高度礦化的堅硬組織。

1.2.2 嚙齒類動物的釉質發育過程 嚙齒類動物如小鼠的牙胚發育大約始于胚胎期11.5 d（E11.5），而釉質層的出現始于出生后0 d（P0）[9]。小鼠切牙的釉質只存在于唇側，與序列性分化的牙上皮細胞層伴行，完整地展示了成釉細胞分化和釉質形成的各個階段。

小鼠切牙的根尖區包含兩個干細胞龕稱為頸環（cervical loop，CL），分別為唇側頸環（labial cervical loop，laCL）和舌側頸環（lingual cervical loop，liCL），其中只有唇側頸環具有成釉向分化的能力。隨著切端釉質的不斷磨耗，頸環區前體細胞沿牙體長軸依次分化形成成釉系細胞[14]。前分泌期成釉細胞呈立方樣，細胞核顯著，分泌形成無釉柱結構的釉質；沿切端向移行分化形成的分泌期成釉細胞，細胞呈高柱狀，分泌端形成突起結構分泌大量釉質基質到細胞外，釉質晶體成核并延長；成熟期成釉細胞呈矮柱狀，此時釉質晶體的厚度和寬度顯著增加，并礦化形成具有典型的4層牙釉質結構。

1.2.3 AI AI是指在釉質發育過程中由于各種因素的干擾導致釉質發育障礙。在不同發育階段的異常干擾會導致不同的發育障礙表現[15-16]。例如，異常干擾發生在牙本質-釉質基底膜形成的階段時，會導致釉質層易于從牙本質表面脫落。異常干擾發生在牙釉質基質分泌期時，會導致基質分泌不足形成菲薄的釉質層，為發育不良（hypoplasia）[17]。異常干擾發生在釉質基質礦化的成熟期時，會導致礦化程度降低形成松軟的釉質結構，為礦化不良（hypomineralization）[18]。

2 m iRNAs的生物學功能

miRNAs是一類內源性表達的短鏈非編碼RNAs，可以通過互補性結合在mRNA的3’UTR，在轉錄后水平調節基因的表達[19-20]。在人類基因組中已預測存在有500~800種m iRNAs，幾乎所有的基因都受到m iRNAs的調控作用。大量研究[21-24]證明，m iRNAs在多項生物學活動中發揮重要作用，包括形態發生和器官形成過程。

成熟的功能性m iRNAs的合成是一系列酶聯反應的結果。首先在細胞核內轉錄形成單鏈或發卡樣的pri-m iRNAs，pri-m iRNAs被細胞核內Drosha酶剪切形成pre-m iRNAs，并轉運到細胞質中，由細胞漿中的Dicer酶剪切形成成熟的單鏈m iRNA[25]。miRNA與Argonaute蛋白形成RNA介導的沉默復合體，與靶基因mRNA的互補堿基序列配對結合，促進其降解或抑制基因的轉錄。

3 m iRNAs調節釉質發育過程

3.1 釉質發育過程中m iRNAs的表達譜

近年來，學者們通過實時定量聚合酶鏈式反應、m iRNAs芯片分析、高通量序列分析等手段，比較小鼠牙胚組織及發育各階段的m iRNAs的時空性表達特點，提示在牙發育的不同階段m iRNAs的作用。

3.1.1 釉質發育過程中m iRNAs的空間性表達譜 基于牙釉質唇側分布及終身生長的特點，小鼠的切牙結構良好地展示了釉質發育過程的各個階段，包括細胞增殖、細胞成釉向分化及基質分泌和礦化過程。由此，通過原位分離切牙不同部位的組織（唇側頸環、舌側頸環、成釉系細胞區），分別提取RNA進行芯片分析，構建了釉質發育過程中m iRNAs的空間表達譜[5-6,26]。研究發現唇側和舌側頸環區相比較有26種差異性表達的miRNAs，唇側頸環和成釉系細胞區相比有35種差異性表達的miRNAs。其中，實時定量聚合酶鏈式反應技術確認了m iR-31在唇側頸環區表達顯著高于舌側頸環區，而m iR-138在成釉系細胞區表達明顯高于唇側頸環區。m iRNAs表達譜的建立提示了特異性的m iRNAs參與了牙上皮前體細胞的增殖更新及成釉向分化過程[5]。

3.1.2 釉質發育過程中miRNAs的時間性表達譜 學者[27]通過收集小鼠不同發育時期的牙胚組織行miRNAs芯片分析，發現牙胚發育早期的蕾狀牙胚中Drosha酶和Dicer1酶的表達水平顯著高于牙胚牙冠形成時期，同樣的頸環干細胞區的Drosha酶和Dicer1酶的表達水平顯著高于成釉系細胞區，提示m iRNAs在釉質發育過程中發揮RNA干擾的作用。M ichon[28]證實了在E16牙胚主要表達m iR-140、m iR-875-5p、m iR-31和miR-141，而E18牙胚主要表達m iR-689、m iR-455、m iR-720和miR-711。某些特異性表達的m iRNAs被進一步研究，如miR-135a在蕾狀期和帽狀期牙胚高表達，在內釉上皮層不表達；m iR-689在成釉器高表達，隨分化進入晚鐘狀期E18后移行進入釉結區域[29]。

3.2 m iRNAs在釉質發育過程中的動物學研究

3.2.1 牙上皮條件性敲除m iRNAs的轉基因小鼠模型 由于Dicer1是成熟m iRNA形成過程中不可或缺的物質，體內條件性敲除Dicer1構建的Cre/Dicer1flox/flox的小鼠模型，實現了特定時間在小鼠體內特定組織中敲除m iRNAs的表達，被廣泛用于m iRNAs時空性表達特點和作用機制的研究?？谇簧掀そM織特異性表達的基因主要有Pitx2、K14和Shh，其中Pitx2和Shh在胚胎早期E10.5即被檢測出局限性的表達在口腔上皮組織中[30-31]，而口腔上皮中K14的表達在E12被檢測到[32]。學者們[9,33-34]通過構建Pitx2-Cre/Dicer1flox/flox轉基因小鼠、K14-Cre/Dicer1flox/flox轉基因小鼠和Shh-Cre/Dicer1flox/flox轉基因小鼠，均實現了在口腔上皮中條件性敲除m iRNAs，以便于研究m iRNAs在釉質發育過程中的作用。

正常野生型小鼠（w ild-type m ice，WT m ice）的切牙為彎刀樣，牙釉質呈黃棕色。Cao等[33]構建的Pitx2-Cre/Dicer1flox/flox小鼠切牙出現釉質發育的障礙，表現為切牙形態平直、牙釉質菲薄呈白堊色。胚胎期小鼠切牙牙胚的組織學檢測發現，E14.5時牙胚形態異常且上皮細胞失去正常細胞極性，釉原蛋白和成釉蛋白的分泌顯著減少，細胞的成釉向分化進程受到干擾。K14-Cre/Dicer1flox/flox小鼠[9]未出現明顯的胚胎期釉質發育的障礙，然而在P5出現了異常的上皮結構的內陷，到了P25至P90，切牙釉質表面出現縱溝和點狀裂隙，提示成釉上皮細胞的異常增殖活性。小鼠磨牙則形成了異常的牙尖結構，提示牙尖形態發育相關的釉結處m iRNAs可能的調控作用。小鼠切牙和磨牙的釉質均呈現不規則的表面，提示m iRNAs的缺失影響釉質形成的礦化成熟階段。Shh是牙發育過程中介導上皮細胞間及上皮間充質細胞間相互作用的關鍵基因[35]，Shh-Cre/Dicer1flox/flox小鼠的上頜出現多生牙，而磨牙和下頜切牙的表型無明顯異常[34]。這提示在利用Cre-loxP系統構建轉基因小鼠的技術中，不同的組織特異性的基因介導的Cre小鼠會呈現不同的表型，這與基因在組織中的調控作用有密切的關系，因此選擇合適的組織特異性的基因是構建Cre-loxP轉基因小鼠的重要研究內容。

3.2.2 專一m iRNAs敲除的轉基因小鼠模型 盡管條件性敲除Dicer1的轉基因小鼠證明了m iRNAs在釉質發育過程中發揮了重要的作用，然而沒有特異性的揭示某個/簇m iRNA的作用。2007年開始有學者[36]致力于利用Cre-loxP系統構建單個/簇m iRNA敲除的轉基因小鼠模型，為m iRNAs特異性功能的研究提供了技術支持。越來越多的m iRNA敲除的動物模型用于生物發育和疾病發生的研究，然而釉質發育過程中特異性m iRNA敲除的研究十分有限[37]。Cao等[26]構建了全身性敲除m iR-200c/141（m iR-200c/141-/-）的轉基因小鼠，發現小鼠切牙的釉質缺失、牙本質菲薄，且骨密度顯著下降。組織學檢測發現切牙唇側頸環失去了細胞間連接，分泌期成釉細胞分泌的釉質基質減少，釉質礦化程度降低。以上結果證明了m iR-200c/141對于牙上皮干細胞的分化和釉質的形成具有重要的調控作用。

3.2.3 體內注射m iRNA抑制劑的小鼠模型 Antagom irs是一類在體外化學合成的m iRNAs抑制劑，根據m iRNAs的序列，經過膽固醇結合和末端修飾等技術，實現了在動物體內抑制某m iRNA的表達。首例動物體內靜脈注射miR-122 Antagomir的動物模型中，Antagom ir成功地抑制了體內m iR-122的表達，降低了血漿中膽固醇的含量，從而證明了此類技術的有效性[38]。

隨著該類產品的成熟和技術的發展，此類研究也應用于釉質發育過程的研究。Sehic等[39]在新生小鼠下頜磨牙區微量注射m iR-214 Antagom ir，發現實驗小鼠牙釉質呈現礦化不良的表型，表現為釉柱晶體交錯紊亂，釉質表面抗酸蝕能力下降。分子生物學檢測釉質發育相關基因如Enam、Amelx、Calb1和Prnp等表達下降。以上結果均證實了m iR-122在釉質發育過程中的調控作用。

4 m iRNAs調控參與的信號網絡

眾所周知，牙發育的形態學分期包括蕾狀期、帽狀期、鐘狀期。bite-it數據庫（http://bite-it.helsinki. fi）總結了牙發育各時期的信號因子表達譜，證明復雜的信號轉導通路和信號反饋系統構成了精密的信號網絡，以保證各項生物學事件的正常進程[40]。m iRNAs的作用原理是通過特異性地結合在靶基因的3’UTR區域，從而在轉錄后水平調節靶基因的表達。作為表觀遺傳學調控的重要內容，m iRNAs也參與到整個信號網絡體系中，通過調節關鍵信號分子的表達調節釉質發育的過程。

4.1 成釉細胞分化過程的調控

鐘狀期牙胚開始進入快速分化階段，其中成釉器分化形成牙釉質，牙乳頭分化形成牙本質和牙髓，牙囊分化形成牙周組織。在此環境中，大量的信號蛋白自分泌或旁分泌作用于靶細胞，調控細胞的分化和基質的分泌過程，主要包括骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、成纖維細胞生長因子（fibroblast grow th factor，FGF）、Shh和Wnt信號通路[41-42]。m iRTooth數據庫收納了三大m iRNAs靶基因預測數據庫，包括TargetScan、m iRBase和miRNAMap，釉質發育過程中這些信號蛋白的表達受到多種miRNAs的調控。

學者們進一步在釉質發育障礙的動物模型中證明了m iRNAs對下游信號因子的調控作用。Pitx2-Cre/Dicer1flox/flox小鼠經過基因組DNA芯片分析，發現m iRNAs敲除后小鼠牙胚中Noggin和Follistatin信號表達顯著升高，而AMELX和AMBN基因表達下降[33]。miR-200c/141-/-轉基因小鼠的前分泌/分泌期成釉細胞中Noggin表達也顯著上升，而細胞連接蛋白E-cad和牙釉質基質蛋白AMELX表達下降[26]。前成釉細胞中Pitx2信號激活m iRNA-200a-3p，并且負反饋調節Pitx2和β-catenin的表達，而Pitx2/m iRNA-200a-3p信號可以通過調節Wnt/β-catenin信號通路使間充質細胞向牙上皮樣細胞轉化。

4.2 頸環區上皮干/前體細胞增殖的調控

頸環區上皮干/前體細胞的增殖和自我更新依賴于復雜的信號網絡的調控。間充質組織中表達的Fgf信號（尤其是Fgf3和Fgf10）作為激動劑，可以旁分泌調節上皮中的Notch信號通路的表達[43-44]。體內下調Fgf抑制劑Spry-2和Spry-3能有效促進上皮干細胞的增殖活性[45]。另外，研究[46]證明BMP信號通路參與抑制頸環處干細胞的增殖，而BMP抑制劑Noggin能促進切牙的持續性生長。m iRTooth數據庫根據生物信息學分析預測Fgf10是m iR-31的靶基因，Spry-2是miR-720和miR-652的靶基因，Noggin是miR-200b、m iR-200c和m iR-429的靶基因，提示m iRNAs在切牙干/前體細胞更新和增殖過程中的作用。

內源性的activin信號特異性地表達在唇側間充質組織中，其異常激活會導致頸環過度增殖形成多生牙胚，并且通過抑制唇側頸環區Bmp4和Fgf3的表達促進干細胞的增殖。此表型與K14-Cre/Dicer1flox/flox小鼠牙釉質縱溝的形成可能有相似的調控機制。另外，Pitx2-Cre/Dicer1flox/flox小鼠[33]因體內miRNAs的上皮條件性敲除，亦呈現頸環區結構的膨大，形成多生切牙。這提示m iRNAs可能通過調節唇側間充質中activin的表達調控干/前體細胞的增殖能力，然而特異性調控的m iRNA和直接的調控證據仍需進一步的研究。

4.3 牙尖形成過程的調控

牙釉質的形成過程與牙冠的形態發生密切相關，目前認為牙尖的形態和數量與牙胚釉結的發育有密切的關系。帽狀期的初級釉結和鐘狀期的次級釉結是內釉上皮局部增厚形成的，許多與胚胎發育相關的關鍵基因在釉結中都有表達，從而使釉結成為調節牙早期形態發生的重要結構。如Bmp2、Bmp4通過刺激homeobox轉錄因子調節牙胚早期發育，Bmp6調節上皮-間充質的相互作用[47]。Shh信號在釉結的表達可能與釉結細胞的凋亡有關，并通過調控Fgf4的表達調節細胞增殖和參與牙冠形態發生[48]。miRNAs在釉結中的表達無直接的證據證明，一些研究的間接證據提示m iRNAs在釉結信號網絡中的作用。研究[9]證明m iR-689的靶基因axin2在E18之前高表達。K14-Cre/Dicer1flox/flox小鼠多生牙尖的表型與Sostdc-1-/-小鼠、Spry2-/-小鼠和K 14-Eda轉基因小鼠的表型類似[32,49-50]。由此，更多的m iRNAs參與牙冠發育形成的研究仍需進一步的探索。

5 總結和展望

通過互補性結合靶基因mRNA的3’UTR，miRNAs在轉錄后水平調節基因的表達，參與調節釉質發育過程。高通量數據篩選的技術構建了m iRNAs在釉質發育過程中的時空性表達譜。miRNAs條件性敲除的轉基因小鼠及專一m iRNAs敲除的轉基因小鼠為揭示m iRNAs的調節作用提供了更直接的證據，然而特定的某個/簇miRNAs的調控作用仍然研究較少，可能與單個/簇miRNAs干擾的技術局限有關。另外化學制劑Agomir、Antagom ir在動物模型中的運用，為miRNAs的體內研究拓寬了思路，有賴于更可靠的體外合成技術的進展，例如增加試劑的靶向性、穩定性、可追蹤性等。

m iRNAs參與釉質發育過程中復雜的信號網絡調節體系，與Bmp、Wnt、Shh等信號通路密切相關，參與細胞分化、干細胞增殖及秞結發育等各個階段。雖然大量的數據支持m iRNAs在網絡調控中的功能性作用，然而miRNAs靶向作用的機制仍有待于大數據庫的篩選和更多直接的動物學證據證明。

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（本文編輯 李彩）

Expression and function of m icroRNAs in enamel development

Zhou Yachuan, Zhou Xuedong, Zheng Liwei. (State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

m icroRNAs (m iRNAs) are endogenous short, noncoding RNAs that can negatively regulate gene expression post-transcriptionally. m iRNAs are involved in multiple developmental events in various tissues and organs, including dental enamel development. Any disruption during enamel development may result in inherited enamel malformations. This article reviews the expression and function of m iRNAs in enamel development.

m icroRNAs; enamel development; ameloblast; expression

R 780.2

A

10.7518/hxkq.2017.03.018

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81470711, 81371136). Correspondence: Zheng Liwei, E-mail: liwei.zheng@scu.edu.cn.

2016-08-11；

2016-12-09

國家自然科學基金（81470711，81371136）

周雅川，博士，E-mail：iamyczhou@outlook.com

鄭黎薇，教授，博士，E-mail：liwei.zheng@scu.edu.cn