LAMP和Xpert Mtb/RIF早期診斷肺結核傳染源的價值比較

張偉陽，鐘建平，楊國彪，金法祥，許文芳，王華鈞

（紹興市立醫院，浙江紹興 312000，1.感染科；2.檢驗科）

·臨 床 經 驗·

LAMP和Xpert Mtb/RIF早期診斷肺結核傳染源的價值比較

張偉陽1，鐘建平1，楊國彪1，金法祥2，許文芳2，王華鈞1

（紹興市立醫院，浙江紹興 312000，1.感染科；2.檢驗科）

目的：評價DNA環介導恒溫擴增（LAMP）技術和Xpert Mtb/RIF早期發現肺結核傳染源的臨床應用價值。方法：采用Xpert Mtb/RIF檢測試劑盒、MGIT液體培養和LAMP技術對肺結核300份痰液標本進行檢測，其中涂陽標本100例。結果：肺結核涂陽標本100例，LAMP技術檢測結核分枝桿菌（MTB），陽性96例，陽性率為96.0%，Xpert Mtb/RIF檢測MTB，陽性97例，陽性率為97.0%，涂陽標本2種方法檢測結果差異無統計學意義（P＞0.05）。涂陰標本200例，LAMP技術檢測MTB，陽性107例，陽性率為53.5%，Xpert Mtb/RIF檢測MTB，陽性50例，陽性率為25.0%，涂陰標本2種方法檢測結果差異有統計學意義（P＜0.01）。結論：在診斷肺結核涂陽標本時，LAMP技術與Xpert Mtb/RIF的敏感性相似；診斷涂陰標本時，LAMP技術優于Xpert Mtb/RIF。

抗酸桿菌；結核分枝桿菌；核酸擴增技術；診斷

結核病嚴重危害人類健康。近10年來，由于艾滋病的流行、移民和流動人口的增加、耐多藥結核桿菌的增多，以及不少國家和地區對結核病控制的忽視等因素，全球結核病形勢急劇惡化[1]。結核病是由結核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染病，早期發現活動性肺結核傳染源是預防和控制結核病傳播的重要措施之一。本研究采用DNA環介導恒溫擴增試驗（loopmediatedisothermalamplifyication，LAMP）技術及XpertMtb/RIF試劑盒對MTB進行檢測，并與MGIT液體培養法比較各檢測法的應用價值。

1 材料和方法

1.1 標本來源標本均來自我院2014年住院診斷為肺結核病的患者（男195例，女105例，平均年齡43.7歲），每人送檢一份合格痰標本，共300份，其中涂陽標本100例，涂陰標本200例。

1.2 試劑與儀器LAMP試劑（廣州華峰生物科技有限公司），GeneXpertMtb/RIF檢測儀及試劑盒（美國Cepheid公司），顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），低溫高速離心機（美國ThermoFisherScientific公司），生物安全柜（美國Nuaire公司）。

1.3 分枝桿菌菌株14株非MTB（包括胞內分枝桿菌5株、鳥分枝桿菌3株、膿腫分枝桿菌1株、瘰疬分枝桿菌1株、堪薩斯分枝桿菌2株、海分枝桿菌1株、偶發分枝桿菌1株），均為本院臨床分離株，通過DNA微陣列芯片法進行菌種鑒定；H37RvMTB標準株1株來自浙江省結核病防治研究所。

1.4 檢驗方法每份痰標本同時進行MGIT液體培養、XpertMtb/RIF檢測及LAMP技術檢測。

1.5 MGIT液體培養采用N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉（NALC-NaOH）處理中和離心法培養MTB。

1.6 LAMP技術

1.6.1 DNA制備：根據痰液標本量，加入2倍體積4%NaOH溶液，充分混勻，室溫靜置液化30min；吸取1mL液化液加入無菌1.5mL離心管中，15000r/min離心5min，棄上清；沉淀用1mL0.9%氯化鈉溶液洗滌，15000r/min離心5min，棄上清，沉淀用1mL0.9%氯化鈉溶液重懸洗滌，15000r/min離心5min，棄上清，沉淀用于模板提取；分別加入100μLDNA提取液I和0.25μLProteinaseK，56℃溫浴30min，再沸水浴10min；加入12.5μLDNA提取液I I，混勻，12000r/min離心5min，上清即為DNA模板。

1.6.2 核酸擴增：取出HF管于室溫解凍。向上述反應管內按順序分別加入陰性對照、待檢模板和陽性對照各2.5μL；置65℃恒溫反應60min。反應結束，將HF管倒置甩動2次，再正置甩動2次，使工作液與顯色液充分混合，冷卻至室溫后觀察。

1.6.3 結果判讀：待檢標本反應管液體呈綠色，結果為MTB陽性；待檢標本反應管液體呈橙色，則報告MTB檢驗結果為陰性。

1.7 Xpert Mtb/RIF檢測檢測試劑由美國Cepheid公司研發，PCR檢測所需的3個步驟（DNA提取、擴增和檢測）自動化，WHO于2010年批準了該法的應用，按試劑說明書操作。

1.8 統計學處理方法率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LAMP和Xpert Mtb/RIF檢測結果涂陽標本100例，LAMP檢測MTB陽性率為96.0%，XpertMtb/ RIF檢測MTB陽性率為97.0%，2種方法檢測結果差異無統計學意義（χ2=0.15，P＞0.05），見表1。

表1 涂陽標本檢測MTB結果

涂陰標本200例，LAMP檢測MTB陽性率為53.5%，XpertMtb/RIF檢測MTB陽性率為25.0%，2種方法檢測結果差異有統計學意義（χ2=34.1，P＜0.01），見表2。

表2 涂陰標本檢測MTB結果

涂陰標本200例，LAMP技術檢測MTB的陽性率與MGIT液體培養法比較，差異有統計學意義（χ2=42.2，P＜0.01）；XpertMtb/RIF檢測與MGIT液體培養法比較，差異無統計學意義（χ2=0.5，P＞0.05）。

2.2 非MTB檢測結果LAMP技術和XpertMtb/RIF檢測14株非MTB（胞內分枝桿菌5株，鳥分枝桿菌3株，膿腫分枝桿菌1株，瘰疬分枝桿菌1株，堪薩斯分枝桿菌2株，海分枝桿菌1株，偶發分枝桿菌1株），結果均未檢出。XpertMtb/RIF檢測MTBH37Rv標準株，結果MTB陽性，利福平耐藥基因rpoB未檢測到突變結果，即對利福平敏感；LAMP技術檢測MTBH37Rv標準株，結果陽性。

2.3 LAMP技術檢測結果300例痰液標本，陽性203例，陽性率為67.7%，檢測結果肉眼判斷，沒有靶序列DNA的則為橙色，含有靶序列DNA管中有大量的LAMP擴增產物而顯綠色，結果觀察見圖1。

3 討論

圖1 LAMP技術檢測結果（綠色為陽性，橙色為陰性）

結核病細菌學檢查是發現結核病傳染源的主要途徑和手段，是確定結核病診斷和化療方案的重要依據[2]。痰涂片染色法臨床中應用最普遍，但敏感性低，漏檢率較高，且無法區分MTB和非MTB，也不能確定菌體是活菌還是死菌。隨著分子生物學技術的發展，建立在核酸擴增基礎上的檢測法推動更多科學研究，全球已經開發了多種新型的結核病實驗室診斷新技術，其中LAMP技術反應2h即可完成核酸擴增，通過目測可以得到清晰的結果，不需要長時間的循環溫度，不需要PCR等昂貴的儀器，僅需要一恒溫設備，檢測成本大大降低。XpertMtb/RIF是WHO推薦的一種全新的結核病快速檢測方法，其采用熒光定量核酸擴增技術，檢測MTB利福平耐藥基因rpoB的81bp耐藥核心區是否發生突變，從而判斷受檢菌株是否對利福平耐藥。該檢測系統所需試劑價格昂貴，在結核病高發的發展中國家，其廣泛應用還存在困難。本研究結果顯示，XpertMtb/RIF檢測陽性147例，陽性率為49.0%，LAMP檢測陽性率為67.7%，明顯高于MGIT液體培養法，這與國內外文獻[3-6]報道基本一致。

綜上所述，在診斷肺結核涂陽標本時，LAMP技術與XpertMtb/RIF的敏感性相似；診斷肺結核涂陰標本，LAMP技術優于XpertMtb/RIF，且具有試劑成本低的優勢。LAMP技術檢測過程僅需2h，能早期診斷和鑒別診斷肺結核，預防非耐藥結核病進一步轉變為耐藥結核病，阻止和減少耐藥MTB在社區中的播散。因此，LAMP技術是一種簡便、快速、靈敏度高的結核分枝桿菌檢測技術。

[1] 金法祥, 王華鈞, 許文芳, 等. 4種新方法快速檢測結核分枝桿菌的臨床研究[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2015, 25(21): 3638-3639.

[2] 戴廣明, 曹以誠, 杜正平, 等. 結核分枝桿菌環介導恒溫擴增(LAMP)快速檢測方法的評價[J]. 中國防癆雜志, 2011, 33(1): 47-51.

[3] 金法祥, 王華鈞, 孫小軍. DNA環介導恒溫擴增試驗檢測結核分枝桿菌的研究[J]. 中華醫院感染學雜志, 2011, 21 (12): 2639-2640.

[4] IWAMOTO T, SONOBE T, HAYASHI K. Loop-mediated isothermal amplification for direct of mycobacterium tuberculosis complex, M.avium, and M.intracellulare in sputum samples[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6)∶ 2616-2666.

[5] PANDEY B D, POUDEL A, YODA T, et al. Development of an in-house Loop-mediated isothermal amplifyication (LAMP) assay for detection of Mycobacterium tuberculosis and evaluateon in sputum samples of Neaplese patients[J]. J Med Microbiol, 2008, 57(4)∶ 439-443.

[6] LAIFANGBAM S, SINGH H L, SINGH N B, et al. A comparative study of fuorescent microscopy with Ziehl-Neelsen staining and culture for the diagnosis of pulmonary tuberculosis[J]. Kathmandu Univ Med J, 2009, 7(27)∶ 226-230.

（本文編輯：丁敏嬌）

Clinical application of LAMP and Xpert Mtb/RIF in early detection of pulmonary tuberculosis infection

ZHANG Weiyang1, ZHONG Jianping1, YANG Guobiao1, JIN Faxiang2, XU Wenfang2, WANG Huajun1. 1.Department of Infectious Diseases, Shaoxing Municipal Hospital, Shaoxing, 312000; 2.Department of Clinical Laboratory, Shaoxing Municipal Hospital, Shaoxing, 312000

Objective:To compare the clinical application of DNA loop mediated isothermal amplifcation (LAMP) technology and Xpert MTB/RIF in early detection of the infectious source of pulmonary tuberculosis.Methods:Three hundred TB sputum samples were detected using Xpert Mtb/RIF detection, MGIT liquid culture and LAMP technology, of which 100 cases of smear-positive specimens, 200 cases of smear-negative specimens.Results:In 100 cases of TB smear-positive specimens, the positive rate was 96.0% with LAMP technology, and the positive rate was 97.0% with Xpert Mtb/RIF detection (P＞0.05). In 200 cases of smear-negative specimens, the positive rate was 53.5% with LAMP technology, and the positive rate was 25.0% with Xpert Mtb/RIF detection (P＜0.01).Conclusion:In the diagnosis of smear positive specimens, the sensitivity of LAMP technology and Mtb RIF/Xpert was similar. In the diagnosis of smear negative specimens, LAMP technology is better than Mtb Xpert/RIF.

acid fast bacilli; mycobacterium tuberculosis; nucleic acid amplifcation techniques; diagnosis

R446.5

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.013

2016-05-31

紹興市衛生計生科技計劃成果轉化項目（2016ZH003）。

張偉陽（1965-），男，浙江新昌人，主任醫師。

金法祥，主任技師，Email：sxjfx0575@126.com。