高蛋氨酸飼料飲食誘導血管內皮細胞損傷大鼠模型建立

任曉麗，楊波，陳錫文，樓永良

（溫州醫科大學，浙江溫州 325035，1.實驗動物中心；2.環境與公共衛生學院；3.檢驗醫學院與生命科學學院）

·論 著·

高蛋氨酸飼料飲食誘導血管內皮細胞損傷大鼠模型建立

任曉麗1，楊波2，陳錫文1，樓永良3

（溫州醫科大學，浙江溫州 325035，1.實驗動物中心；2.環境與公共衛生學院；3.檢驗醫學院與生命科學學院）

目的：探討不同比例蛋氨酸飲食和不同飼養周期對大鼠血管內皮細胞（EC）損傷模型建立的影響。方法：雄性SD大鼠隨機分為正常飲食對照組（C組）、1%高蛋氨酸飲食組（M1組）、3%高蛋氨酸飲食組（M3組）和5%高蛋氨酸飲食組（M5組）。C組喂飼普通飼料，高蛋氨酸飲食組大鼠分別喂飼含1%、3%和5%蛋氨酸飼料，持續8周。實驗開始（0周）、第2、第4、第6、第8周末行斷尾取血，采用ELISA法檢測血清同型半胱氨酸（Hcy）含量，掃描電鏡觀察第8周末主動脈弓EC形態。結果：各高蛋氨酸飲食組大鼠血清Hcy含量均隨飼養時間延長而顯著增加（P＜0.05），且不同添加比例蛋氨酸飲食與不同飼養周期對大鼠血清Hcy水平具有顯著地交互作用（P＜0.05）。與C組相比，M1組大鼠血清Hcy含量在飼養第4周顯著升高（P＜0.05），而M3和M5組大鼠血清Hcy含量在飼養第2周顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。掃描電鏡顯示M1組大鼠EC排列紊亂、細胞間隙明顯增寬、偶見有細胞碎片和血細胞附著；M3組呈典型“蟲蝕”樣變，病灶邊緣呈鋸齒狀，散在血細胞和細胞碎片；M5組血管內皮大片崩解或脫落，膠原裸露，伴有大量血細胞附壁、血栓形成和脂質沉積。結論：低比例蛋氨酸飼料長期喂養和高比例蛋氨酸飼料短期喂養可誘導EC不同程度損傷，是一種建立EC損傷動物模型有效易行的方法。

蛋氨酸；同型半胱氨酸；動物模型；內皮細胞

血管內皮細胞（endothelialcell，EC）結構和功能障礙與動脈粥樣硬化性血管性疾病發生、發展密切相關，其相關機制一直是臨床醫學領域的研究熱點。由于不能直接在人體上進行實驗，目前大多數研究是通過建立體外細胞損傷模型[1]和檢測體內EC損傷生物標志物來進行。體外細胞損傷模型雖可通過控制各種影響因素，明確細胞損傷的具體機制，但需體內實驗研究證實；內皮損傷評價體系雖可以間接評估內皮功能，但缺乏動物模型針對性的研究證據，結論推廣受到限制。因此，建立簡單無損傷的EC損傷動物模型，對深入研究體內EC損傷機制，評估藥物對EC損傷的保護作用具有必不可少的橋梁作用。

近年來，動物模型研究方法（如手術法、基因敲除等）雖可以解決部分研究問題所需，但由于缺乏統一的操作，且價格昂貴、對動物創傷大、成模率低、動物模型不穩定等影響了研究進展。目前，國內外開始采用飲食誘導法建立體內EC損傷模型，大鼠由于飼養方便、模型制作經濟、食性與人相近且抵抗力強，是醫藥研究領域的主要模型動物之一。我們前期對健康雄性Wister大鼠經3%蛋氨酸飼料進行8周干預[2]，發現EC排列紊亂，細胞間隙增大，胞膜表面部分脫落呈大小不等的蟲蝕狀或火山口狀缺損，甚至脫落等。有研究[3]發現l%蛋氨酸飼料是誘導大鼠發生高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血癥較為合適的劑量，且無生長抑制等不良反應，與我們前期研究結果存在差異，這可能是由于大鼠造模的飼養周期不同造成的。因此，為進一步探究蛋氨酸飲食誘導大鼠EC損傷模型建立的最佳建模條件，我們采用不同比例的蛋氨酸飼料喂飼法構建EC損傷大鼠模型，探討建模的最佳蛋氨酸添加劑量和飼養周期，為高蛋氨酸飼料喂飼法建立體內EC損傷模型技術的推廣和應用奠定理論和實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物選用健康雄性SD大鼠32只，體質量（160～180）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，在溫州醫科大學實驗動物中心SPF級動物房分籠飼養，合格證編號為SCXK（滬）2012-0002，均自由采食、飲水。

1.2 實驗設計與分組大鼠適應性飼養1周后，稱重、編號并隨機分為4組：正常飲食對照組（C組）、1%蛋氨酸飲食組（M1組）、3%蛋氨酸飲食組（M3組）和5%蛋氨酸飲食組（M5組），每組8只。各組大鼠分別在實驗開始（0周）、第2、第4、第6和第8周行斷尾采血，并常規制備血清。高蛋氨酸飼料是在正常普通飼料配方基礎上，將原料分為兩部分，一部分直接加工成普通飼料，供C組大鼠食用；另一部分按各實驗組添加不同比例蛋氨酸，制成顆粒飼料，即為高蛋氨酸飼料，分別供M1、M3和M5組大鼠食用。所有飼料均購于上海普路騰生物科技有限公司。

1.3 取樣飼養8周后，各實驗組禁食24h后，稱重并依次用10%水合氯醛（0.1mL/100g）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，常規制備血清，-80℃冰箱凍存、待測。迅速打開胸腔，取下主動脈弓，剝離動脈附著組織，0.9%氯化鈉溶液灌洗血污，并取主動脈弓下段1cm左右，切成2～3mm小段迅速投入預置2.5%戊二醛溶液青霉素小瓶前固定。

1.4 指標檢測

1.4.2 血清Hcy濃度：試劑盒購自南京建成科技有限公司，采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書分別檢測第0、2、4、6和8周血清Hcy濃度。

1.4.3 EC掃描電鏡觀察：打開預置2.5%戊二醛溶液的青霉素小瓶，制作掃描電鏡樣品標本。分別經PBS清洗、鋨酸后固定、乙醇梯度脫水、C02臨界點干燥和離子濺射法鍍金，最后用JSM-6510分析型掃描電子顯微鏡（日本日立公司）觀察并拍照。

1.5 統計學處理方法采用STATA11.0統計軟件進行統計學分析。實驗數據以±s表示，不同添加比例的高蛋氨酸飲食對大鼠體質量的比較采用重復測量雙因素方差分析，不同添加比例的高蛋氨酸飲食對大鼠日平均攝食量的比較采用單因素方差分析，不同添加比例蛋氨酸飲食和不同飼養周期大鼠血清Hcy水平比較采用重復測量雙因素方差分析，并采用Bonferroni法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同添加比例的高蛋氨酸飲食對大鼠體質量的影響不同比例的蛋氨酸飲食對大鼠體質量的影響見圖1。實驗后C組和M1組大鼠體質量較實驗前均顯著增長，且組間體質量增加趨勢差異無統計學意義（P＞0.05）。M3和M5組大鼠體質量增加趨勢顯著低于C組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示添加3%和5%的蛋氨酸飲食對大鼠體質量的增長均具有明顯的抑制作用。

圖1 不同添加比例的高蛋氨酸飲食對大鼠體質量的影響

2.2 不同添加比例的高蛋氨酸飲食對大鼠日平均攝食量的影響不同添加比例的高蛋氨酸飲食對大鼠日平均攝食量的影響見圖2。與C組相比，M3和M5組大鼠日平均攝食量均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01），而M1組大鼠日平均攝食量差異無統計學意義（P＞0.05），提示添加3%和5%蛋氨酸飲食對大鼠食欲有明顯抑制作用。

圖2 不同添加比例的高蛋氨酸飲食對大鼠日平均攝食量的影響

2.3 不同添加比例的高蛋氨酸飲食和不同飼養周期對大鼠血清Hcy水平的影響不同添加比例高蛋氨酸飲食和不同飼養周期對大鼠血清Hcy水平的影響見表1。重復測量雙因素方差分析顯示，不同添加比例的高蛋氨酸飲食對大鼠血清Hcy含量有顯著影響，差異有統計學意義（P＜0.05），隨飼養時間延長各高蛋氨酸飲食組大鼠血清Hcy含量顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），且不同添加比例蛋氨酸飲食與不同飼養周期對大鼠血清Hcy水平具有顯著的交互作用，差異有統計學意義（P＜0.05）。與0周相比，M1組大鼠血清Hcy含量從飼養第4周開始顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而M3和M5組大鼠血清Hcy含量從飼養第2周開始顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與C組相比，2周、4周、6周和8周的M3和M5組大鼠血清Hcy水平顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.01）；4周、6周和8周M1組與同期C組相比顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與M1組相比，6周、8周M3組大鼠血清Hcy水平顯著提高，差異有有統計學意義（P＜0.05），而4周、6周、8周M5組大鼠血清Hcy水平顯著高于M1組，差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1 不同添加比例蛋氨酸飲食和不同飼養周期對大鼠血清Hcy水平的影響（n=8，±s）

表1 不同添加比例蛋氨酸飲食和不同飼養周期對大鼠血清Hcy水平的影響（n=8，±s）

與同組0周比：aP＜0.05；與C組同時期比：bP＜0.05；與M1組同時期比：cP＜0.05

組別Hcy（umol/L）0周2周4周6周8周C組7.54±0.627.66±0.557.72±0.767.93±0.758.01±1.02 M1組7.44±0.557.87±0.958.19±1.02ab8.64±0.92ab9.04±0.64abM3組7.60±0.648.28±0.39ab8.46±1.03ab9.34±0.83abc9.80±0.71abcM5組7.57±0.698.47±0.50ab9.11±0.89abc9.50±1.04abc10.07±0.90abc

2.4 不同添加比例的高蛋氨酸飲食對大鼠主動脈弓EC損傷掃描電鏡觀察C組大鼠主動脈弓EC呈多邊形，大小一致，且沿血管縱軸呈條帶狀排列，細胞表面光滑，細胞間隙均勻，核所在部位向血管腔面稍隆起，胞膜完整（見圖3A-B）。M1組大鼠EC形態大小不一、排列紊亂、細胞間隙明顯增寬，胞膜表面部分脫落，偶見有細胞碎片和血細胞附著（見圖3C-E）。M3組大鼠EC損傷呈典型的“蟲蝕”樣損害，病灶處形成表淺性潰瘍，邊緣呈鋸齒狀，周邊可見散在血細胞和細胞碎片附著（見圖3F-H）。M5組大鼠EC大片崩解或脫落，內皮下膠原裸露，伴有大量血細胞附壁、血栓形成和脂質沉積（見圖3I-L）。

3 討論

圖3 不同添加比例蛋氨酸飲食對大鼠主動脈弓EC損傷掃描電鏡圖

蛋氨酸是人體必需含硫氨基酸之一，必須從食物中獲取。機體蛋氨酸攝入過高，引起血液Hcy水平升高而誘發高Hcy血癥。流行病學和實驗研究表明，高Hcy血癥可以誘導EC損傷和功能障礙，是導致動脈粥樣硬化發生的始動因素[4]。本實驗通過研究添加1%、3%和5%蛋氨酸飼料誘導SD大鼠EC損傷，發現不同添加比例蛋氨酸和不同飼養周期對EC損傷具有顯著的交互作用。1%高蛋氨酸飲食對大鼠食欲和體質量無明顯影響，從飼養第4周開始血清Hcy含量顯著高于正常飲食對照組且具有時間趨勢效應，提示1%高蛋氨酸飲食經過4周飼養干預可誘發高Hcy血癥。3%和5%高蛋氨酸飲食大鼠從飼養第2周開始血清Hcy含量顯著高于正常飲食對照組且具有時間趨勢效應，提示3%和5%蛋氨酸負荷飲食飼養2周可以誘導高Hcy血癥，但大鼠表現為明顯食欲和生長抑制等營養不良狀態，提示中高比例蛋氨酸飲食大鼠呈長期饑餓狀態，這可能是由于高劑量的蛋氨酸添加后造成其他氨基酸等營養素吸收障礙或肝功能障礙引起[5]。饑餓應激能使動物體內自由基含量增多，與細胞膜磷脂多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，使磷脂結構發生變化，最終導致細胞結構和功能障礙。柯斌等[6]研究發現，大鼠禁食4d后體質量顯著下降，但血脂、血糖和肝腎功能等相關指標均保持正常，提示短期禁食對大鼠具有良好的安全性和耐受性。朱會萍等[7]研究發現，大鼠禁食超過5d后腦組織脂質過氧化反應顯著增強，表現為SOD含量顯著下降而MDA含量顯著增加，提示長期禁食分解代謝加速導致自由基生成增多，誘發組織脂質過氧化損傷。本研究動物持續飼養8周，中高比例蛋氨酸添加組大鼠呈明顯長期饑餓應激狀態，提示饑餓應激誘發的脂質過氧化反應可能介導了損傷。因此，本研究所觀察到的中高劑量組EC損傷比低劑量組大鼠明顯，可能是由于饑餓應激與較高蛋氨酸含量對內皮損傷的聯合作用。

采用飼料喂飼法誘導EC損傷模型研究報道較多，較為一致的研究認為高蛋氨酸飼料喂養大鼠可誘導血管內皮損傷，但尚不清楚蛋氨酸飲食最佳的成模劑量和飼養周期。EC是Hcy毒作用的靶細胞之一[8-9]，不同劑量的蛋氨酸負荷誘導體內Hcy水平升高的差異性可能造成動物EC不同程度損傷。SCHERER等[10]用0.03μmol/g低劑量Hcy灌服Wister大鼠30d，可以導致慢性血管內皮炎性損傷。孟斌等[3]發現l%蛋氨酸飼料誘導大鼠發生高Hcy血癥，且無明顯生長抑制。然而，先前的研究并未能提供最佳的成模劑量和飼養周期，本研究通過觀察不同添加比例蛋氨酸飼料和不同飼養周期對大鼠EC損傷的影響，結果顯示蛋氨酸飲食負荷后大鼠血清Hcy在不同的飼養周期顯著提高，提示整體動物對蛋氨酸負荷后的代謝反應不同。此外，我們先前研究發現3%蛋氨酸飲食可以誘導大鼠EC結構和功能紊亂，表現為EC形態明顯異常，排列紊亂，細胞間隙增大，細胞表面微絨毛減少甚至消失，血管活性物質分泌失衡等[2]，提示3%高蛋氨酸飼料喂飼法可誘導EC損傷。本研究通過掃描電鏡發現，1%蛋氨酸負荷后EC呈輕度損傷狀態，表現為細胞大小不一、排列紊亂、細胞間隙明顯增寬，胞膜表面部分脫落，偶見有細胞碎片；3%蛋氨酸負荷后EC呈中度損傷，表現為典型的“蟲蝕”樣損害，且病灶邊緣呈鋸齒狀，周邊可見散在血細胞和細胞碎片；5%蛋氨酸負荷后EC呈重度損傷，表現為血管內皮大面積地崩解或脫落，內皮下膠原纖維裸露，并伴有大量血栓形成和脂質沉積，表明經過8周不同比例的蛋氨酸飲食飼養，大鼠EC呈現出不同程度地結構和功能損害，為體內動物EC損傷模型建立提供客觀的形態學依據。

綜上所述，蛋氨酸飲食誘導EC損傷模型是一種理想、穩定、易行且與人體動脈粥樣硬化發病過程相似的動物模型研究工具。應根據不同的研究需要，添加蛋氨酸劑量并合理選擇飼養周期為建模條件。鑒于飲食誘導動物模型的穩定、可復制性以及不同比例蛋氨酸飲食對食欲的影響，尚需要對動物模型的特征性、穩定性和成模機理進行深入研究。

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（本文編輯：趙翠翠）

Stablishment of vascular endothelial cell injury model induced by high methionine feed diet in rats

REN Xiaoli1, Yang Bo2, CHEN Xiwen1, LOU Yongliang3. 1.Laboratory Animal Research Center, Wenzhou Medical University, Whenzou, 325035; 2.School of Environment Science and Public Health, Wenzhou Medical University, Whenzou, 325035; 3.School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Whenzou, 325035

Objective:To investigate the effects of the diet rich in different proportions of methionine on endothelial injury in sprague-dawley (SD) rats.Methods:Male SD rats were randomly divided into the normal diet group (CR), 1% methionine loading diet group (M1 R), 3% methionine loading diet group (M3 R) and 5% methionine loading diet group (M5 R), and blood in tail vein were drawn at 0, 2nd, 4th, 6th and 8th week, respectively. After 8 weeks, serum concentrations of homocysteine (Hcy) were measured, and the endothelial ultrastructure changes in aorta wall were observed using scanning electron microscope.Results:A signifcant interaction between high methionine diet and feeding duration on endothelial injury was found (P＜0.05), and serum levels of Hcy were signifcantly increased in rats fed with high methionine diet (P＜0.05), with feeding duration increasing. Compared with CR, serum level of Hcy in M3 and M5 R was signifcantly higher at 2nd week (P＜0.01), whereas serum Hcy in M1 R was signifcantly higher at 4th week (P＜0.05). Endothelial cells in M1 R were imperfectly unanimous in size, and the cell surface shrinked. Endothelium in M3 R and M5 R were found to be damaged by worms kinds of harming typical, with enclose wall thrombus and the fat deposition.Conclusion:High dietary intake of methionine is signifcantly associated with endothelial injury, which suggests that a method setting up endothelial injury animal models would be established.

methionine; homocysteine; animal model; endothelial cells

R332

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.010

2016-04-08

浙江省科技計劃項目（2013C37007）。

任曉麗（1981-），女，浙江寧波人，實驗師。

樓永良，教授，Email：lyl@wmu.edu.cn。