富血小板血漿對脂肪干細胞體外增殖及成脂分化的影響

李鋒，黃盛斌，趙樹蕃，鄧輝

（1.溫州醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，浙江溫州 325027；2.溫州醫科大學附屬口腔醫院口腔醫學研究所，浙江溫州 325027；3.廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心口腔科，廣東廣州 510120；4.溫州醫科大學附屬口腔醫院牙周科，浙江溫州 325027）

·論 著·

富血小板血漿對脂肪干細胞體外增殖及成脂分化的影響

李鋒1，黃盛斌2，趙樹蕃3，鄧輝4

（1.溫州醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，浙江溫州 325027；2.溫州醫科大學附屬口腔醫院口腔醫學研究所，浙江溫州 325027；3.廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心口腔科，廣東廣州 510120；4.溫州醫科大學附屬口腔醫院牙周科，浙江溫州 325027）

目的：研究不同體積分數富血小板血漿（PRP）對脂肪干細胞（ASCs）體外增殖及成脂分化的影響。方法：采用酶消化組織塊法分離培養ASCs，有限稀釋法克隆純化，檢測細胞表面標志物并進行鑒定。改良兩步離心法從人全血中制備PRP。利用細胞計數試劑盒（CCK-8）檢測在培養基中分別添加不同體積分數（0、10%、20%、30%）PRP對ASCs增殖的影響。反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測在成脂誘導培養基中添加不同體積分數PRP對ASCs成脂分化相關基因過氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、脂肪分化相關蛋白（adipophilin）表達的影響。結果：CCK-8結果顯示，培養基中添加PRP顯著促進了ASCs的增殖（P＜0.01）；與10% PRP相比，20% PRP或30% PRP更好地促進了ASCs的增殖（P＜0.01），而20% PRP與30% PRP相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。RT-PCR結果顯示，成脂誘導培養基中添加PRP時，PPARγ、LPL、adipophilin表達均明顯升高（P＜0.05），而加入PRP的體積分數為10%、20%、30%時，對PPARγ、adipophilin表達的影響差異無統計學意義（P＞0.05），以20% PRP對LPL表達的促進作用最為明顯（P＜0.01）。結論：PRP可以促進ASCs體外增殖及成脂分化，對脂肪組織再生有重要研究價值。

富血小板血漿；脂肪干細胞；細胞增殖；成脂分化

各種原因導致的軟組織缺損不僅損毀患者外部容貌，還嚴重影響其心理、社會功能等，一直是創傷整形和修復重建外科所面臨的難題[1]。目前臨床軟組織修復重建的常用方法包括人工合成替代物植入、自體組織瓣移植、自體脂肪移植[2]。各種人工合成材料植入人體后容易破裂泄漏、移位、產生異物排斥反應、不能進行功能改建[3]，而液態硅膠注射更是被許多國家明令禁止；自體組織瓣移植實際屬于“拆東墻補西墻”，塑形難、組織量難以保證，且會造成供區損傷及繼發畸形；自體脂肪移植的存活率較低，一般為30%～60%[4]，這極大地影響了自體脂肪移植的遠期療效。近年來，組織工程技術迅猛發展，為軟組織缺損的重建帶來了新的希望。脂肪組織工程包括種子細胞、支架材料及生長因子3個要素[3]。

2001年，ZUK等[5]首次發表關于脂肪組織中存在多能干細胞的研究后，脂肪干細胞（adiposederivedstemcells，ASCs）成為研究熱門。ASCs可以從脂肪組織中大量獲取，具有組織來源豐富、取材方便、獲取過程微創等優點，且ASCs具有更穩定的增殖活性、自我更新能力和更強的成脂、成骨、成內皮細胞等多向分化潛能[6]，因此，ASCs是脂肪組織工程中促進脂肪再生的理想種子細胞。

富血小板血漿（platelet-richplasma，PRP）是自體全血經過多次差速離心得到的含有高濃度血小板的血漿[7]，其被激活后可釋放出高濃度的血小板衍化生長因子（plateletderivedgrowthfactor，PDGF）、轉化生長因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、成纖維細胞生長因子（fibroblasticgrowthfactor，FGF）、血管內皮細胞生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）、表皮生長因子（epidermalgrowthfactor，EGF）等[8]，這些細胞生長因子對細胞的形態發生、增殖、分化、新生血管形成等起到誘導促進作用；激活后的PRP還含有纖維蛋白、纖維黏連蛋白、玻璃黏連蛋白等蛋白質[9]，形成精細的纖維蛋白網狀結構，具有促進細胞黏附、防止細胞流失功能。本研究旨在探討PRP對ASCs體外增殖及成脂分化的影響，觀察將PRP及ASCs應用于脂肪組織工程的可行性。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器I型膠原酶（collagenasetype I；Hyclone，美國）、α-MEM培養基（alphamodifiedminimumessentialmedium，α-MEM；Hyclone，美國）、胎牛血清（fetalbovineserum，FBS；Hyclone，美國）、雙抗（青霉素、鏈霉素；Millipore，USA）、0.25%胰蛋白酶（Sigma，美國）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA；AidScience，上海）；細胞計數試劑盒（cellcountingkit-8，CCK-8；Dojindo，日本）、RNAisoPlusTotalRNA提取試劑（TaKaRa，日本）、PrimeScript?RTreagentkit反轉錄試劑盒（TaKaRa，日本）、SYBR?PremixExTaqTMPerfectRealTime（TaKaRa，日本）；血細胞分析儀（SysmexXS-800i；Sysmex，日本）、ThermoKS12超凈工作臺（Thermo，美國）、恒溫水浴箱（Heto-Hoten，丹麥）、倒置相差顯微鏡（LeicaDMI6000，德國）、酶標儀（Thermo，美國）、低速離心機（湘儀，湘潭）、溫控臺式離心機SORVALLRLEGENDT（Thermo，美國）、微量移液器（Thermo，美國）。

1.2 ASCs的分離培養和鑒定①ASCs分離培養：脂肪抽吸術中獲取約15mL人腹部皮下脂肪組織；于超凈工作臺內用加有雙抗的無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate-bufferedsaline，PBS）反復漂洗脂肪組織，用眼科剪充分剪碎并去除肉眼可見的血管及筋膜組織；加入等體積0.15%I型膠原酶混勻于37℃恒溫搖床消化30min；在200×g下離心10min，去除上層油脂、脂肪組織等，將離心管底部的細胞團用含10%FBS、1%雙抗的α-MEM培養基重懸，接種于細胞培養瓶中，置于飽和濕度、37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養；原代培養96h后予以更換培養基，去除未貼壁細胞；倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長狀況，待細胞在培養瓶底達90%融合時，用0.25%胰蛋白酶予以消化并接種至新的培養基中進行傳代培養。②ASCs表面分子標志檢測：取生長狀態良好的第3代ASCs，待其達到90%融合時，0.25%胰蛋白酶消化，PBS清洗后于低速離心機1000r/min離心5min，用PBS重懸細胞并計數，調整細胞濃度為1.0×106/mL；將所制備單細胞懸液分裝入10支1.5mLEP管，每支1.0mL，1000r/min離心5min，用100μLPBS重懸細胞；在上述10支EP管中，隨機選1支不加抗體作為空白對照，其余9支分別加入20μLCD14-FITC、20μLCD29-PE、20μLCD31-FITC、20μLCD34-FITC、20μLCD44-FITC、20μLCD45-FITC、20μLCD49d-PE、5μLCD105-PE、20μLCD106-PE于4℃避光孵育30min；孵育完畢后，向各EP管中加入1mLPBS重懸細胞，1000r/min離心5min，棄去上清；用300μLPBS重懸細胞，經過200目細胞篩過濾轉移至流式離心管中，將各流式離心管放入流式細胞儀檢測。

1.3 PRP的制備及血小板計數將健康志愿者捐獻的400mL全血平均分裝在20支離心管中，從每支離心管中吸取0.5mL全血，利用血細胞分析儀自動計數其中的血小板數量。將20支離心管130×g離心15min，可見其中的血液大致分為上下2層：上層為血漿，下層為紅細胞；從每支離心管中分別吸出3mL血漿備用。將20支離心管中剩余的血液分別用等體積的PBS進行稀釋后緩慢加入含有淋巴細胞分離液的另外20支離心管，使血液與淋巴細胞分離液之間界限清晰；將以上20支離心管250×g離心15min，可見其中的液體從上到下分為界限清晰的4層：血漿層、富含血小板及白細胞的棕黃層、淋巴細胞分離液層、紅細胞層；使用微量移液器小心吸取20支離心管中的棕黃層，用PBS離心清洗（200×g、4℃、10min）2次后分別用之前提取的3mL血漿重懸，吹打混勻即得PRP；利用血細胞分析儀對以上20份3mL的PRP樣本分別進行血小板計數。將所得20份PRP樣本混合均勻，備用。

PRP的激活：取上述PRP，分裝在20支離心管中，每支離心管中加入0.5mL人凝血酶溶液（由500U凝血酶凍干粉溶解在0.5mL1%CaCl2溶液制得，現制現用），可見PRP即被激活成凝膠狀；將離心管置于4℃過夜，以使其中的成分充分反應，第2日晨即可見有上清液滲出。將各離心管3000×g離心10min，收集上清液進行后續實驗。

1.4 不同體積分數PRP對ASCs增殖的影響采用CCK-8檢測PRP對ASCs體外增殖的影響。待第2代ASCs生長達到約90%融合時，0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，按以下5個分組制備ASCs細胞懸液：①陰性對照組：3.0mLα-MEM+1.5×105ASCs；②陽性對照組：3.0mLα-MEM+10%FBS+1.5×105ASCs；③10%PRP組：3.0mLα-MEM+10%PRP+1.5×105ASCs；④20%PRP組：3.0mLα-MEM+20%PRP+1.5×105ASCs；⑤30%PRP組：3.0mLα-MEM+30%PRP+1.5×105ASCs。將上述各組ASCs細胞懸液接種在96孔培養板中，每組均接種28孔，每孔均含細胞懸液100μL，在培養第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7天后，每組各取培養板內4孔，分別加入10μLCCK-8溶液（注意輕手操作，不要在孔內生成氣泡），置于細胞培養箱中繼續避光孵育3h，用酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度值（opticaldensity，OD）。以培養時間為橫坐標，OD值的±s為縱坐標，繪制ASCs的生長曲線。

1.5 不同體積分數PRP對ASCs成脂分化的影響取貼壁生長達90%左右融合的第3代ASCs，在以下5種環境下進行培養：①陰性對照組：α-MEM+10%FBS；②陽性對照組：成脂誘導培養基（α-MEM培養基中加入10%FBS，1μmol/L地塞米松，5mg/L胰島素，0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，0.2mmol/L吲哚美辛）；③10%PRP組：成脂誘導培養基+10%PRP；④20%PRP組：成脂誘導培養基+20%PRP；⑤30%PRP組：成脂誘導培養基+30%PRP。各組ASCs誘導培養3周后，提取各組細胞總RNA，利用KaTaRaPrimeScript?RTreagentKit試劑盒反轉錄合成cDNA，通過ABIPRISMR?7300RealTimePCR儀擴增，檢測各組細胞中成脂分化相關基因過氧化物酶體增殖體激活受體γ（peroxisomeproliferators-activatedreceptorsγ，PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，LPL）、脂肪分化相關蛋白（adipophilin）以及內參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）的表達情況。引物設計見表1。質量控制及數據分析：實驗重復3次，每次實驗設置3組復孔，所有操作均在相同條件下由同一人完成，盡量減少實驗的誤差。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 統計學處理方法利用7300SystemSDS軟件對數據進行解析，按照2-△△Ct=2-[（Ct目的基因- Ct內參基因）誘導后細胞-（Ct目的基因-Ct內參基因）陰性對照細胞]對基因的相對表達進行分析。采用SPSS17.0統計學軟件進行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ASCs的分離與培養原代培養72h左右可見貼壁細胞逐漸增多，見圖1A。原代培養9d左右細胞達到80%～90%融合，此時應及時進行傳代培養。傳代后的細胞生長較迅速，一般3～4d即可達90%融合；且經過1～2代的傳代培養后，得到較為純化的ASCs，為成纖維細胞樣長梭形，形態均一，見圖1B。

圖1 ASCs的培養圖（×100）

2.2 ASCs表面分子標志的檢測流式細胞術檢測第3代ASCs表面分子標志表明，ASCs陽性表達CD29（為95.8%）、CD44（為95.9%）、CD49d（為50.6%）、CD105（為95.2%），而陰性表達CD14（為1.4%）、CD31（為2.0%）、CD34（為1.8%）、CD45（為4.2%）、CD106（為5.5%），見圖2。

2.3 全血及PRP中的血小板檢測本研究對獲取的20份PRP樣本進行血小板計數，并與全血中的血小板計數比較，見表2。全血中的血小板計數為（171.0±32.3）×109/L，PRP中的血小板計數為（1531.3±297.9）×109/L；符合PRP中的血小板濃度應達到全血中的5倍以上[7]的基本要求。

2.4 PRP對ASCs增殖的影響CCK-8所得各組ASCs生長曲線見圖3，第4天時各組細胞的OD值統計學比較見圖4。CCK-8結果示：與陰性對照組相比，培養基中添加FBS或PRP均明顯促進了ASCs的增殖（P＜0.01）；各濃度組PRP對ASCs增殖的促進作用明顯優于FBS（P＜0.01）；與10%PRP組相比，20%PRP組或30%PRP組更好地促進了ASCs的增殖（P＜0.01），而20%PRP組與30%PRP組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 PRP對ASCs成脂分化的影響ASCs在不同的條件下誘導培養3周后，RT-PCR結果見圖5。與陰性對照組相比，陽性對照組的成脂誘導培養基明顯促進了ASCs的成脂分化，成脂相關基因PPARγ、LPL、adipophilin表達均明顯升高（P＜0.01）；成脂誘導培養基中添加PRP時，PPARγ、LPL、adipophilin表達均明顯升高（P＜0.05），而加入PRP的體積分數為10%、20%、30%時，對PPARγ、adipophilin表達的影響差異有統計學意義（P＜0.05），20%PRP組對LPL表達的促進作用最為明顯（P＜0.01）。

3 討論

本研究首先利用膠原酶消化法，從人離體脂肪組織中分離培養ASCs，并對細胞分子表面標志加以檢測。經過傳代純化后，ASCs呈梭形貼壁生長，且具有較強的增殖能力。間充質干細胞（mesenchymalstemcell，MSCs）通過分子表面抗原黏附于細胞外基質[10]，ASCs陽性表達黏附分子CD29及CD44，使其黏附于細胞外基質；同時ASCs還陽性表達CD105，與CD29、CD44一起體現了ASCs具有MSCs的表面分子特性[11]；陰性表達CD14、CD31、CD34及CD45說明該實驗所得的ASCs不是造血/白細胞/內皮細胞[12]；此外，ASCs陽性表達CD49d，而陰性表達CD106，這與骨髓間充質干細胞（bonemarrowderivedstemcells，BMSCs）正好相反[13]，結合細胞組織來源，從而說明了本研究所獲取的細胞并非BMSCs。

本研究采用BAUSSET等[14]建議的兩步離心法來制備PRP；另外，在此基礎上選用沉降系數在紅細胞與血小板之間的人淋巴細胞分離液，使離心過程中紅細胞與棕黃層完全分隔開來，去除了紅細胞的摻雜，進一步提升了血小板回收率，本研究得到的PRP中血小板濃度為全血中的8.95倍，遠遠滿足PRP中的血小板濃度應達到全血中的5倍以上[7]的基本要求。

圖2 第3代ASCs表面分子標志的流式細胞術檢測結果

表2 全血及PRP中血小板計數結果（×109/L）

CCK-8檢測表明，培養基中加入PRP能夠明顯促進ASCs的增殖，這是因為PRP激活后能夠釋放高濃度的PDGF、TGF-β、FGF等生長因子，它們能夠刺激、促進MSCs的有絲分裂，促進細胞內周期蛋白CyclinD1的表達，從而加速細胞增殖[15-16]。本研究進一步比較了不同量的PRP對ASCs增殖的影響，發現20%為最適宜的用量。盡管有少數關于PRP對ASCs增殖影響的研究，但對于PRP的最佳用量卻結論不一。KAKUDO等[17]認為培養基中添加5%PRP能夠明顯促進ASCs的增殖，但是當增加到20%時基本無促進作用；而LIU等[18]卻報道PRP促進ASCs增殖的最佳濃度為10%～12.5%。分析原因可能由不同的研究中PRP的制備方法、內含血小板或生長因子的濃度不同所致。

圖3 不同培養條件下ASCs的增殖曲線

圖4 各組ASCs第4天時OD值比較

圖5 各組ASCs成脂分化相關基因表達比較

RT-PCR結果顯示，ASCs經成脂誘導培養基誘導培養3周后，成脂分化相關基因PPARγ、LPL、adipophilin表達上調，而在誘導培養基中添加PRP使這些基因的表達進一步升高。既往研究表明：PPARγ在脂肪生成相關基因的調節中發揮關鍵作用[19]；LPL是脂肪生成過程中的一種脂質交換酶[20]；adipophilin與細胞和組織中的脂質堆積密切相關[21]。這些基因表達的上調說明PRP促進了ASCs的成脂分化。這或許是由PRP中所含的TGF引起，有研究表明TGF超家族成員之一的骨形成蛋白-2（bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2）可以誘導間充質祖細胞向脂肪細胞分化[22-23]。另外，有研究[24]表明，PRP可與胰島素協同作用一起促進ASCs的成脂分化。這些研究與我們的實驗結果都說明了PRP能夠促進ASCs向脂肪細胞分化。

綜上所述，我們制備的PRP對ASCs的增殖及成脂分化均有一定促進作用，且以20%體積分數PRP作用為佳；本研究為PRP、ASCs應用于脂肪組織再生提供了前期理論基礎。

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（本文編輯：吳昔昔）

Effects of platelet-rich plasma on proliferation and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells in vitro

LI Feng1, HUANG Shengbin2, ZHAO Shupan3, DENG Hui4. 1.Department of Oral and Maxillofacial

Surgery, Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Institute of Oral Science, Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 3.Department of Stomatology, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, Guangzhou, 510120; 4.Department of Periodontics, Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To evaluate the effects of platelet-rich plasma (PRP) on the proliferation and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) in vitro.Methods:ASCs were isolated and cultured from human free fat tissue. The surface molecular markers of ASCs were determined with fow cytometry. PRP was prepared from human whole blood. Cell count kit-8 (CCK-8) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to evaluate the infuence of PRP (0, 10%, 20%, and 30%) in medium on ASC proliferation and adipogenic differentiation, respectively.Results:The platelet count in PRP was over 5 times of that in whole blood. CCK-8 showed that medium supplemented with PRP promoted ASCs proliferation signifcantly and the stimulatory potency of 20% PRP was the greatest. RT-PCR detected upregulated adipogenic-related genes, such as peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ), lipoprotein lipase (LPL) and adipophilin.Conclusion:These results indicates PRP facilitated the proliferation and adipogenic differentiation of ASCs, which is of great value for adipose tissue engineering.

platelet-rich plasma; adipose-derived stem cells; cell proliferation; adipogenic differentiation

R78

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.002

2016-05-31

國家自然科學基金資助項目（81500817）；浙江省自然科學基金資助項目（LY15H140008）；溫州市公益技術研究醫學項目（Y20140708）；浙江省醫藥衛生科技計劃一般項目（2016KYB184）。

李鋒（1985-），男，山東泰安人，主治醫師，博士。

鄧輝，副教授，副主任醫師，Email：dh0726@163.com。