男性不育及遺傳因素研究進展

王志強 王劍 陜文生

·綜述與講座·

男性不育及遺傳因素研究進展

王志強 王劍 陜文生

不育癥是一個嚴重的社會問題，其中男性因素所致的不育約占到所有不育癥的一半。我們計劃在近期的文獻的背景下探討在人類精子發生過程中起著重要的作用的在Y染色體或者常染色體上的基因。檢索以下關鍵詞：男性不育基因，精子發生的遺傳學來獲得本文所需信息。結果利用基因敲除小鼠模型闡明的生精功能機制已經取得了顯著的進展，但是該信息并未直接應用于人。然而，已經證實幾個重要基因的突變可以引起不育。本文中將討論Y染色體中無精子癥區域(AZF)的一些確定可導致不育的基因，和常染色體上的SYKP3，KLHL10，AURKC和SPATA16基因。闡明男性不育的潛在基因，可以幫助我們更好理解不育的起因，從而幫助我們更好地為患者量身定制治療策略。

男性不育；無精子癥因素；AURKC；KLHL10；SPATA16；SYCP3

據WHO調查，15%的育齡夫婦存在不育問題，全世界約有8 000萬對左右，并且每年以200萬對的速度遞增。許多社會和環境因素，包括社會進步導致的女性結婚年齡增大，也對導致不孕不育病人數量增多有影響[1]。大約有一半的不孕不育是由男性因素引起的，而男性不育癥的各種治療方法效果都比較穩定，包括采取激素治療、營養療法、抗感染等病因和支持治療，但臨床效果均不理想，尤其是對于不明原因的特發性少、弱精患者，更無特異性療法。盡管輔助生殖技術，尤其MD-TESE(顯微鏡下睪丸取精術)和ICSI(單精子卵泡漿內注射)在一定程度上解決了許多嚴重少、弱精子癥男性患者的生育問題，但目前對于睪丸內沒有成熟精子的病人沒有有效的辦法。盡管有證據表明，許多無精子癥患者有遺傳易感性，但大多數情況下原因仍然未知[2]。最近的基因敲除鼠的研究表明許多基因與無精子癥有關，其機制也在逐漸闡明。然而這些研究鮮有用于人體，因為小鼠的結果與人體試驗并不總是對等。我們這里將討論我們的實驗結果和與無精子癥明確相關的基因。

1 無精子癥和Y染色體

1976年，Tiepolo和Zuffardi首次提出并解釋了Y染色體在無精子癥中扮演的角色。他們在顯微鏡下檢測6例無精子癥的患者并且提出無精子癥致病基因多位于此區，他們將其命名為無精子癥因子(AZF)區[3]。隨后的研究，如Vogt等[4]的研究進一步說明了AZF區的特點，Reijo等[5]發現89例患有非梗阻性無精子癥(NOA)患者中12例(13%)AZF區有缺失。這些研究也表明此區有無精子癥有密切聯系。Vogt等[6]進一步闡明了由于睪丸組織類型不同，微缺失主要集中在3個區域，其將AZF區分為三個亞區：AZFa，AZFb和AZFc。雖然使用MD-TESE從患有AZFa，AZFb或AZFb + AZFc缺失的患者中取出精子非常困難，但是在只有AZFc缺失的患者睪丸中取出精子成功率高達(約70%)[7,8]。

2 無精子癥基因群

DAZ 無精子癥缺失(DAZ)基因，1995年由Reijo等人分離出來[5]。DAZ位于AZFc區。其表達特定于睪丸，并且編碼一個含有RNP/RRM區和一個RNA結合的功能區和七個串聯重復的14個殘基的蛋白[9,10]。Tiepolo和Zuffardi在1976年第一次提出的AZF區的概念之后19年，首次確定了DAZ是人類第一個由于基因突變導致無精子癥的基因。該項研究引起了對其他無精子癥候選基因的研究，但是DAZ仍舊為最有代表性的基因[11,12]。

RBMY 1997年，Elliott等[13]報告了第二例無精子癥基因，RNA結合基序基因(RBMY，位于Y染色體)。RMBY也位于AZFb區，像DAZ一樣轉錄RNA結合蛋白。RMBY特異性表達在胎兒的生殖細胞中，青少年和成年人睪丸中，但是在體細胞如Sertoli細胞中無表達。RMBY的缺失只與生殖細胞分化早期的減數分裂有關。這項研究表明RBMY在精子發生過程中起到了重要的作用。

USP9Y 1999年，Sun等[14]確定了AZFa區一個新的與精子發生相關的基因，USPY9(又稱DFFRY)。應用576個NOA患者或者嚴重的少精子癥患者(精子計數≦5百萬/ml)還有96個健康個體的DNA，通過單鏈構象多態性和序列分析發現其中一個患者有一個4 bp 的內含子剪接供體位點7基因缺失。該缺失導致了一個框架移位和外顯子7的缺乏，引起蛋白水平下降約90%。

3 常染色體

上述提到的基因是典型的位于Y染色體AZF區域的精子發生基因。這個區域已經被深入的研究分析，最近確定的AZF基因是在1999年被確定的USP9Y。然而，有關基因敲除小鼠的研究已確定了大量的常染色體精子發生基因。這表明常染色體上也存在人類精子缺乏癥的相關基因。

SYCP3 Yuan等[15]在基因敲除鼠的研究中報道了SYCP3(SCP3)。聯會絲復合物蛋白3(SYCP3)是一種DNA結合蛋白，與突觸有關并共同參與生殖細胞減數分裂的過程[16-18]。雖然雄性和雌性SYCP3基因敲除小鼠發育都正常，但是純合突變的雄性鼠沒有生殖潛力。這類基因敲除小鼠的睪丸明顯較小，組織學顯示其減數分裂阻滯，即完全沒有正常減數分裂后形成的圓形及細長的精細胞，更沒有成熟的精子。與野生型雌鼠相比，雌性SYCP3基因敲除鼠即使能夠妊娠和分娩，但其生育的后代明顯少。隨后的調查顯示，由于染色體畸變導致胎死宮內幾率升高，從而導致同窩生仔數減少，同時隨著小鼠年齡的增長，死胎率也隨之增加。

我們假設SYCP3在人類精子發生過程中也同樣扮演著重要角色的基礎上，進行了更深入的研究。我們分離出人SYCP3的cDNA，發現該基因位于12號染色體(12q23)上，且在睪丸中有特異性表達[19]。該基因編碼一種236個氨基酸構成的、有兩個卷曲螺旋域的蛋白質。對19個由于異常減數分裂導致的精子缺乏癥患者的SYCP3所有編碼區域和相鄰的內含子的突變進行分析，發現其中2個患者第643核苷酸位點存在一個腺苷基團的雜合缺失點。然而來自75名健康男性的DNA測序未在這些位點發現突變，這也排除基因多態性的可能(P=0.039)。已經確定的是，在鼠SYCP3基因的3個區域出現的卷曲螺旋域在蛋白質結合中起著重要的作用[20]。在人基因組中該缺失點位于卷曲螺旋域編碼區，這能導致轉錄框架轉移和終止密碼子的提前出現，最終導致一個不完整的卷曲螺旋區域形成。我們進行了該突變的功能分析，結果顯示，截短了人的SYCP3失去了介導蛋白質間相互作用的功能。

這些發現代表著第一個常染色體精子缺乏相關基因的識別過程，即在Y染色體AZF區域以外的，位于人12號染色體的SYCP3。Bolor等[21]隨后報道了人SYCP3基因突變與復發性流產有關，26個不明原因復發性流產的女性中有2人攜帶SYCP3基因獨立的雜合核苷酸突變，這在150名可生育女性的檢測結果中是不存在的。對隱匿這2種突變之一的微基因轉錄本進行分析，結果顯示這兩種突變均影響正常剪接，可能導致c端突變蛋白的產生。當在不同的系統中共同表達時，這種突變蛋白可在體外與其野生型相互作用，抑制SYCP3蛋白質形成正常的纖維。已有研究顯示，這些突變可能會通過顯性抑制的方式導致異常的聯合絲復合物的形成，從而導致染色體行為異常，這可能會反過來導致復發性流產。這些數據表明，SYCP3上的突變會通過減數分裂阻滯導致男性精子缺乏和女性復發性流產。

由于發現SYCP3基因突變導致男性不育，所以現在許多研究人員在尋找其他可能導致男性不育的常染色體基因突變。

KLHL10 2006年，Yatsenko等采用了一種新的方式來識別與男性不育有關的基因[22]。他們探索了從人精液中惰性轉錄精細胞里獲得mRNA全長的可行性，以此作為從候選生殖相關基因中鑒別生殖相關突變的非侵入性診斷方式。精子濃度范圍大的不育癥患者，其多種單倍體生殖細胞表達基因的逆轉錄聚合酶鏈反應的效率為91%～99%。使用這種方法,研究者們確定了7名少精子癥患者生殖細胞特異性基因KLHL10(位于17q21)上的錯誤和剪接突變。鼠KLHL10是精子形成的關鍵基因，且其通過劑量敏感的方式發揮作用。雜合性的KLHL10無效突變的特點是生殖細胞損失和精子細胞形態缺陷[23]。270個嚴重少精癥患者中有3人存在KLHL10突變，而在395人的對照組中沒有這種情況。在酵母菌相互作用實驗中，2個KLHL10錯義突變(A313T和Q216P)導致其翻譯產物與野生型蛋白質形成受損的同源二聚體，最終導致蛋白功能障礙。這些結果表明，少精癥患者的KLHL10突變減少了同源二聚體的形成。

Dieterich等[24,25]對10個不育癥男性進行了全基因組微衛星掃描分析，這10個患者有正常體細胞核型，但精子形態不典型，主要表現為大頭精子，不同數量的尾部以及染色體內容增加。在這10個患者中，研究者們發現了一個共同的純合性區域，該區域有極光激酶C基因(AURKC，位于19q13)，AURKC在睪丸中有顯著表達[26,27]，并被推測參與胞質分裂，有絲分裂和減數分裂[28,29]。在全部10個患者中均檢測到AURKC編碼區存在單個核苷酸缺失(c.144delC)。基礎突變(L49Wfsx22)導致翻譯過早終止，產生一種缺乏激酶結構域的截短蛋白。體內和體外的功能分析顯示了截短蛋白功能嚴重缺失。AURKC的純合突變導致大頭的多倍體精子形成，并導致男性不育。另有研究報道，AURKC顯著突變導致巨型精子癥[30,31]。

SPATA16 圓頭精子癥是一種罕見的疾病(在不育男性中發生率<0.1%)，為嚴重的精子畸形癥，表現為一次射出的精液中全部都是圓頭精子而無頂體精子，或一部分是圓頭精子、同時伴有不同比例(20%～90%)的精子頂體缺乏[32,33]。精液中全都是圓頭精子的男性是沒有生育能力的，這些患者即使是借助ICSI，生育率仍然很低。圓頭精子癥源于精子形成障礙，雖然其根本原因仍未確定，但家族病例報告[34]和逆行性小鼠模型實驗[35,36]支持遺傳因素的病因理論。然而，還沒有發現可誘發疾病的突變。Dam等[33]報道了1個家族中的3個不育癥兄弟均存在精子生成特異性基因SPATA16(位于3q26)的純合性突變。2014年，Karaca等[37]報道了第一例成功通過ICSI授孕成功的SPATA16純合子突變的29歲不育癥男性病例。

結論

男性因素不育是導致不孕不育的重要原因。目前男性不育的幾個原因，包括內分泌疾病，染色體異常和Y染色體的微缺失已確定。然而，大多數的男性不育癥仍然無法解釋，非梗阻性無精子癥更是精子缺乏癥最嚴重的形式。據估計，超過2 500個基因在精子發生中發揮作用，并很可能這些基因突變或異常導致許多不明原因的男性不育癥患者。隨著現代分子生物學和遺傳學的不斷發展，尤其是高通量測序技術和基因捕獲技術臨床應用的發展，會有越來越多的與不育有關的新基因被發現，將為男性不育的遺傳學診斷開辟新的道路。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.039

項目來源：甘肅省自然科學基金項目(編號：1606RJZA167);甘肅省中醫藥管理局科研項目(編號：GZK-2014-48)

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