急性白血病患兒骨髓單個核細胞轉鐵蛋白受體、鐵蛋白、Beclin1、LC3表達及意義

姚鳳丹，徐學聚，穆慢慢，張園，閔燕平，董南南，張婉妍

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

·臨床研究·

急性白血病患兒骨髓單個核細胞轉鐵蛋白受體、鐵蛋白、Beclin1、LC3表達及意義

姚鳳丹，徐學聚，穆慢慢，張園，閔燕平，董南南，張婉妍

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院，鄭州 450052)

目的 觀察急性白血病患兒骨髓單個核細胞(BMMNC)中轉鐵蛋白受體(TfR)、鐵蛋白(FN)及自噬相關基因Beclin1、LC3表達情況，并探討其意義。方法 46例急性白血病患兒,其中急性淋巴細胞白血病(ALL)患兒30例(ALL組)、急性髓細胞白血病(AML)患兒16例(AML組)，另取同時期健康兒童16例(對照組)。取各組骨髓液制備BMMNC，采用逆轉錄PCR技術檢測BMMNC中的TfR、FN、Beclin1、LC3 mRNA，采用Pearson相關分析分析TfR、FN分別與Beclin1、LC3的關系。結果 ALL組BMMNC中TfR、FN、Beclin1、LC3 mRNA的相對表達量較對照組高(P均<0.01)。AML組BMMNC中Beclin1、LC3 mRNA的相對表達量較對照組低(P均<0.01)，TfR、FN mRNA的相對表達量較對照組高(P均<0.01)。在ALL組、AML組及對照組，TfR與Beclin1、LC3表達均呈負相關(P均<0.05)，F(xiàn)N與Beclin1、LC3表達均呈正相關(P均<0.05)。結論 TfR、FN在急性白血病患兒BMMNC中表達升高；Beclin1、LC3在ALL中表達增高，而在AML中表達下降；隨著自噬活性的增強，TfR表達下調、FN表達上調。

急性白血?。昏F代謝；轉鐵蛋白受體；鐵蛋白；自噬；Beclin1基因；LC3基因；兒童

急性白血病是一種造血干細胞的惡性克隆性疾病，是我國最常見的小兒惡性腫瘤之一，其病因、發(fā)病及復發(fā)機制至今仍未完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，急性白血病的發(fā)生發(fā)展中存在自噬活性異常[1]以及鐵代謝的異常[2]。近年來在神經退行性疾病的研究發(fā)現(xiàn)，自噬和鐵代謝關系密切[3]，鐵蛋白的降解是通過自噬溶酶體途徑這一觀點引起廣泛關注，但在兒童白血病方面兩者的關系研究較少。急性白血病分為急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性髓細胞白血病(AML)兩大類。本研究通過檢測兩類急性白血病患兒骨髓單個核細胞(BMMNC)中轉鐵蛋白受體(TfR)、鐵蛋白(FN)及自噬相關基因(Beclin1、LC3)的表達情況，了解急性白血病患兒自噬和鐵代謝情況，探討自噬與鐵代謝在兒童急性白血病發(fā)生發(fā)展中的關系及作用,為兒童急性白血病提供新的治療靶點和治療策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年10月～2015年10月鄭州大學第一附屬醫(yī)院兒科血液病區(qū)住院初診或復發(fā)的急性白血病患兒46例，男34例、女12例，年齡<16歲。其中ALL患兒30例(ALL組，男23例、女7例，年齡<16歲)、AML患兒16例(AML組，男11例、女5例，年齡<16歲)。另選擇16例(男10例、女6例，年齡<16歲)同時期健康兒童作為對照組。各組性別、年齡具有可比性。留取各組患兒骨髓液標本于4 ℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑及儀器 淋巴細胞分離液、TRIzol、引物、逆轉錄PCR試劑盒由上海生工生物公司提供；氯仿、無水乙醇、異丙醇、PBS液由鄭州萊寶實驗器材有限公司提供。超低溫冰箱(美國FORMA公司)，臺式離心機(美國Sigma公司)，SIM-F124制冰機(日本三洋公司)，普通冰箱(河南新飛電器有限公司)，DYY-Ⅲ水平電泳槽(北京六一儀器廠)，PCR擴增儀(德國Biomatra公司)，GS-15R臺式低溫高速離心機(美國Beckman公司)。

1.3 BMMNC制備方法 取肝素抗凝1 mL骨髓液，加等量PBS液充分混勻，用等體積的人淋巴細胞分離液分選單個核細胞，將細胞重懸于PBS液中，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BMMNC中TfR、FN、Beclin1、LC3 mRNA檢測方法 采用逆轉錄PCR技術檢測。用TRIzol法提取BMMNC總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度。取1 μg RNA樣品，參照逆轉錄PCR試劑盒說明逆轉錄成cDNA。引物序列：TfR上游為5′-TGCCAGCCCACTGTTGTAT-3′，下游為5′-AAGGAAAGGGAAAGCAGCA-3′，擴增片段145 bp。FN上游為5′-ATCACCCTCACCAACCTCAC-3′，下游為5′-TCCCTCGGAACATCAGAAAC-3′，擴增片段122 bp。Beclin1上游為5′-GAAGACACAGGAGGCAGTGG-3′，下游為5′-AGGACACCCAAGCAAGACC-3′，擴增片段124 bp。LC3上游為5′-CCTTCTTCCTGCTGGTGAAC-3′，下游為5′-TTTCCTGGGAGGCGTAGAC-3′，擴增片段120 bp。內參GAPDH上游為5′-GGAGCCAAAAGGGTCATCACTC-3′，下游為5′-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3′，擴增片段174 bp。所有引物由上海生工生物公司合成。反應體系：RealSuper Mixture 10 μL，模板2 μL，引物Mix(上下游引物各10 μmol/L)4 μL，共20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸40 s，共40個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。產物行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描。以TfR、FN、Beclin1、LC3基因與內參GAPDH的比值代表各自mRNA相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組BMMNC中Beclin1、LC3、TfR、FN mRNA表達比較 見表1。

表1 各組BMMNC中Beclin1、LC3、TfR、FN mRNA表達比較

注：與對照組相比，*P<0.01。

2.2 各組BMMNC中TfR、FN與Beclin1、LC3的相關性 ALL組中TfR與Beclin1、LC3表達呈負相關(r分別為-0.899、-0.925，P均<0.01)，F(xiàn)N與Beclin1、LC3表達呈正相關(r分別為0.969、0.947，P均<0.01)。AML組中TfR與Beclin1、LC3表達均呈負相關(r分別為-0.876、-0.923，P均<0.001)；FN與Beclin1表達呈正相關(r分別為0.906、0.894，P均<0.01)。對照組中TfR與Beclin1、LC3表達呈負相關(r分別為-0.895、-0.938，P均<0.01)；FN與Beclin1、LC3表達呈正相關(r分別為0.879、0.924，P均<0.01)。

3 討論

隨著對白血病發(fā)病、耐藥及復發(fā)機制的不斷深入研究，目前白血病患兒的預后已得到明顯改善，急性白血病的長期無事件生存率及總生存率不斷提高。探索白血病發(fā)病機制、尋找新的治療靶點、應用靶向治療提高白血病患兒總體生存率和生存質量成為目前的研究熱點。

自噬是一種溶酶體介導的用以清除折疊錯誤的蛋白、聚合的大分子蛋白以及受損的細胞器的降解途徑。如果體內缺乏自噬或者自噬活性異常，就會導致多種疾病的發(fā)生，如惡性腫瘤、神經退行性疾病和心血管疾病[4]。研究顯示自噬對白血病細胞的生存影響具有雙刃劍作用：一方面可以產生保護性作用，維持白血病細胞的存活；另一方面可以促進白血病細胞的凋亡[5]。自噬相關因子Beclinl和LC3在自噬體的形成及成熟階段發(fā)揮著重要的調控作用[6]，細胞和組織內Beclin1和LC3的表達量能夠反映細胞的自噬程度。胡曉燕等[7]用電鏡和實時熒光定量PCR相結合的方法研究發(fā)現(xiàn)，在急性白血病初治組和復發(fā)難治組中自噬相關基因Beclin1、MAPLC3 mRNA的表達明顯上調，自噬活性的明顯增強與急性白血病的發(fā)生發(fā)展、耐藥密切相關。王叨等[8]在兒童急性白血病關于自噬的研究也證實了這一點。Kim等[9]發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑羥氯喹通過抑制自噬活性，誘導阿糖胞苷耐藥的AML細胞凋亡。隨著靶向治療腫瘤的觀點深入人心，近年來越來越多的研究是通過調控急性白血病自噬活性，促進腫瘤細胞自噬性死亡，從而達到治療腫瘤的目的。

鐵是機體內許多蛋白質的關鍵輔助分子，這些蛋白是細胞行使基本代謝活動和特有功能的關鍵。鐵代謝的平衡對于機體的健康至關重要，劉玉峰等[10]研究表明鐵超載可促進白血病細胞生長、抑制其凋亡，鐵剝奪促進其凋亡。鐵的轉運和吸收通過TfR介導轉鐵蛋白的內化過程實現(xiàn)，體內多余的鐵則以FN的形式儲存在胞質內，TfR和FN常被作為反映細胞鐵代謝水平的良好指標。有動物實驗證實，鐵超載是癌癥的高危因素，肝癌、乳腺癌等腫瘤細胞中存在鐵代謝的異常，鐵蛋白表達明顯上調[11]。

近年來在多種疾病細胞的研究中發(fā)現(xiàn)自噬和鐵代謝關系密切相關，F(xiàn)N通過自噬溶酶體途徑進行降解[12]。在白血病[13]，通過對K562細胞分解產物行脈沖標記實驗發(fā)現(xiàn)FN首先出現(xiàn)在胞液中，然后出現(xiàn)在溶酶體上，但是給予抗壞血酸鹽藥劑(溶酶體抑制劑類似物)處理后FN在溶酶體上明顯減少。Asano等[14]也證實，自噬抑制劑3-MA也可以抑制鐵螯合劑(鐵缺乏)引起的FN減少現(xiàn)象。Mancias等[15]研究發(fā)現(xiàn)自噬小體表面的NCOA4蛋白介導FN的降解，NCOA4基因沉默的細胞在鐵螯合劑處理后，由于缺乏NCOA4，不能引導FN在溶酶體上募集而散在分布在胞質中，因而FN降解減少；NCOA4基因沉默的細胞轉染小鼠NCOA4 cDNA后，F(xiàn)N在溶酶體上募集，F(xiàn)N降解增加。

一般多取BMMNC進行白血病基因檢測，提取BMMNCs來檢測可提純細胞，提高檢測有效性。本研究表明，TfR、FN和自噬相關基因Beclin1、LC3在各組BMMNC中均有表達。ALL、AML組TfR、FN表達較對照組均明顯增高，提示急性白血病患兒存在鐵的代謝異常，白血病細胞需要大量的鐵來滿足自身快速的增長。與對照組相比，ALL組Beclin1、LC3表達升高，AML組Beclin1、LC3表達降低，提示急性白血病患兒體內存在自噬活性異常。在ALL組，自噬相關基因Beclin1、LC3 mRNA表達上調，自噬活性增強，促進了ALL細胞清除氧自由基及損傷細胞器，維持自身內環(huán)境的穩(wěn)定，實現(xiàn)自身細胞增殖，這可能是兒童ALL發(fā)生發(fā)展的原因。而在AML中，Beclin1、LC3 mRNA表達下調，這可能是兒童AML自噬活性減弱的分子機制，自噬活性的減弱可能有利于AML細胞的逃逸，這可能是兒童AML發(fā)生發(fā)展的原因。上述結果進一步體現(xiàn)了自噬對腫瘤細胞的雙面性，通過上調或下調自噬活性，有利于腫瘤細胞逃離免疫監(jiān)視、化療毒性及營養(yǎng)匱乏的不良環(huán)境，促進腫瘤細胞存活。本研究結果還顯示，在ALL組、AML組及對照組中，TfR與Beclin1、LC3的表達呈負相關，而FN與Beclin1、LC3的表達呈正相關，表明隨著自噬活性的增強，TfR表達下調、FN表達上調。這可能是因為隨著自噬活性的增強，F(xiàn)N降解增多，鐵釋放增多，胞內游離鐵增多，因而TfR mRNA降解而FN mRNA穩(wěn)定表達；而隨著自噬活性的減弱，F(xiàn)N降解減少，鐵釋放減少，胞內游離鐵減少，因而TfR mRNA穩(wěn)定表達而FN mRNA受抑制。

綜上所述，急性白血病發(fā)病與體內鐵代謝紊亂及白血病細胞自噬活性的改變有關，且鐵代謝紊亂與腫瘤細胞自噬活性的改變有一定相關性。但是，目前關于急性白血病發(fā)病中自噬引起鐵代謝紊亂的信號轉導機制仍不明確，深入研究其機制可通過干擾信號轉導中間分子的表達，從而為兒童急性白血病的靶向治療提供新策略。

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