豬圓環(huán)病毒和大腸桿菌混合感染的診斷

豬圓環(huán)病毒和大腸桿菌混合感染的診斷

馬莉莉，常春龍，常敬偉，倪宏波＊
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

黑龍江省大慶市某豬場暴發(fā)豬病，臨床主要表現(xiàn)豬體溫升高、腹瀉、日漸消瘦等癥狀。為了確診該豬場的發(fā)病原因，實驗室無菌提取病豬肺臟的DNA、RNA，經(jīng)分離純化進行PCR檢測，同時進行細菌鑒定，生化試驗等，最終PCR擴增結(jié)果診斷為豬圓環(huán)病毒和大腸桿菌的混合感染。藥敏試驗結(jié)果分析表明該分離菌對畜炎寧(克拉維酸+阿莫西林注射液)、頭孢唑啉、阿米卡星和頭孢噻呋高度敏感，并給豬場提出了有效的防治措施，為豬場對該類疾病的防控提供了參考。

豬圓環(huán)病毒；大腸桿菌；混合感染；藥敏試驗

豬圓環(huán)病毒病（Porcine circovirus disease）是由豬圓環(huán)病毒引起的豬一種新的傳染病，其臨床診斷表現(xiàn)多種多樣，會造成免疫力降低，主要特征為體質(zhì)下降、腹瀉及內(nèi)臟器官等廣泛病理變化[1]，特別是腎臟、脾臟及全身淋巴結(jié)高度腫大、出血和壞死等。豬大腸桿菌病（Escherichia coli disease）是由病源性大腸桿菌引起的仔豬腸道傳染性疾病，以發(fā)生腸炎、腸毒血癥為特征。1～7日齡仔豬發(fā)生的一種急性、高度致死性的腸道傳染病[2]，臨床以灰白色稀便為主要特征，發(fā)病率高，死亡率低。該病一般發(fā)生于個別豬群，有時整群發(fā)病，以前多見于春秋季節(jié)，但現(xiàn)在的流行特點是沒有明顯的季節(jié)性。新生仔豬24 h內(nèi)最易感染發(fā)病。一般出生后3 d左右發(fā)病，最遲不超過7 d。

1 發(fā)病情況

黑龍江省某豬場有200頭豬，其中保育豬90頭。2016年11月初該豬場部分保育豬突然體溫升高至42 ℃，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查得知該豬場發(fā)病率20%，死亡率3%，發(fā)病豬被毛凌亂，行動緩慢，皮膚蒼白；表現(xiàn)為食欲廢絕，呼吸急促，體溫升高，消瘦；病豬也有咳嗽，黃疸，體表淋巴結(jié)腫大，貧血，逐漸消瘦衰竭死亡等臨床癥狀。

2 剖檢變化

病死豬耳根部、背部和股內(nèi)側(cè)皮膚有紅色點狀和片狀紅斑，部分豬腹下、臀部皮膚出現(xiàn)不規(guī)則隆起丘疹，呈現(xiàn)出紫色狀。淋巴結(jié)呈化膿性病變，并且充血水腫；打開胸腔，見心包積液；肺表面腫脹壞死；胸膜炎、腹膜炎，心包膜內(nèi)有大量炎性滲出物；肺呈彌散性、間質(zhì)性肺炎變化；腎臟脾髓交界處出血，腎臟表面有出血點。腸道急性卡他性炎癥，胃膨脹，胃底黏膜潮紅；腸壁黏膜充血，水腫；腸腔有黃白色內(nèi)容物。通過流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀和病理剖檢變化初步懷疑為豬圓環(huán)病毒和大腸桿菌混合感染，需進一步通過實驗室方法確診。

3 實驗室診斷

3.1 細菌學(xué)檢測

無菌采取病死豬的肝臟、肺臟接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后挑取典型菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征。結(jié)果為麥康凱培養(yǎng)基長出粉色，光滑，圓形菌落；在伊紅美藍培養(yǎng)基長出紫黑色，金屬光澤菌落，對其進行革蘭氏染色鏡檢，染為紅色菌落，可見兩端鈍圓，短小桿狀菌，革蘭氏染色為陰性（如圖4，圖5和圖6）。

3.2 藥敏試驗

圖1 四肢皮膚壞死

圖2 腎臟脾髓交界出血

圖3 肺臟腫大壞死

圖4 革蘭氏染色兩端鈍圓桿狀菌

圖5 麥康凱鑒別培養(yǎng)基

圖6 伊紅美藍鑒別培養(yǎng)基

在血平板上培養(yǎng)純化的單菌落，貼藥敏片于培養(yǎng)基進行37℃培養(yǎng)。結(jié)果表明該分離菌對畜炎寧、阿米卡星、頭孢唑啉和頭孢噻呋高度敏感；對強力霉素、慶大霉素和硫酸頭孢喹肟中敏；對氟苯尼考、恩諾沙星和林可霉素耐藥（表1）。

表1 藥敏試驗結(jié)果

3.3 生化鑒定

分離純化的菌進行生化試驗，過氧化氫酶、糖類發(fā)酵、硫化氫和尿素酶等試驗，結(jié)果能發(fā)酵糖類，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、不產(chǎn)生H2S，不分解尿素，符合大腸桿菌生化特性（表2）。

表2 生化試驗

3.4 PCR檢測

按照 TIANamp Virus DNA/RNA Kit病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取病毒的DNA和RNA，用豬瘟病毒、豬藍耳病毒、高致病性豬藍耳病毒、圓環(huán)病毒和偽狂犬病毒的特異性引物進行PCR反應(yīng)擴增。引物參照GenBank發(fā)表的基因序列設(shè)計并合成（見表3）。結(jié)果顯示第4泳道在490 bp左右有一條帶，與圓環(huán)病毒片段相符，見圖7。綜合診斷可以確診該病例為豬圓環(huán)病毒和大腸桿菌混合感染。

4 討論

黑龍江省大慶市某豬場送檢的病豬通過實驗室診斷確診為豬圓環(huán)病毒和大腸桿菌混合感染。豬場曾接種相關(guān)疫苗，但抗體水平不足以抵抗病毒的侵襲，造成疫病流行，所以應(yīng)制定合理的免疫程序，避免繼發(fā)感染[3]。隨著集約化、規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬場的疾病情況更加復(fù)雜。豬圓環(huán)病毒病屬于免疫抑制性疾病，一旦發(fā)病就會降低豬的免疫力，將給養(yǎng)豬場造成很大經(jīng)濟損失，因此豬場必須建立健全衛(wèi)生防疫制度，嚴格監(jiān)督執(zhí)行[4]。

表3 引物列表

圖7 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

1）對病豬進行隔離，無害化處理，搞好環(huán)境衛(wèi)生，疫苗接種等綜合防治措施，避免病原入侵。及時治療發(fā)病豬，防止傳染給其他豬[5]。對豬舍通道設(shè)備等全面消毒，每3天消毒1次，盡量做到清除環(huán)境中潛在病原微生物，保證消毒效果。環(huán)境凈化，疫情嚴重威脅時，在多數(shù)豬場尚無多點生產(chǎn)體系情況下，育肥舍要單元式全進全出的管理[6]，每個豬舍用具、人員等要獨立，不可共用。2）制定合理的免疫保健程序，改善飼養(yǎng)管理，合理搭配日糧，改善空氣質(zhì)量，降低氨氣和硫化氫的濃度[7]，減少環(huán)境帶來的應(yīng)激，以及避免飼喂霉變飼料等，飼料要定期添加抗生素和維生素，增強機體的免疫力。3）制定免疫程序，合理制定計劃，根據(jù)當?shù)叵鄳?yīng)感染毒株進行疫苗注射，合理定期進行抗體情況的監(jiān)測[8]，保證豬群的健康水平；減少應(yīng)激因素對仔豬的影響，病豬要進行對癥治療，選用黃芪多糖等[9]。總之，防治豬場病毒和細菌性的混合感染最主要就是做好消毒措施，并且調(diào)節(jié)動物機體的免疫功能，通過多方面的渠道最終才能達到抵抗病毒的入侵。

[1] 喬瑾，趙保生.規(guī)模化豬場生物安全控制技術(shù)研究[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2011(4)：30-35.

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[3] STEVENSON G W， KIUPEL M，MITTAL S K，et al. Ultra structure of porcupine circovirus in persistently infected PK-15 cells [J]. Vet Pathol，1999，36(5)：368-378.

[4] 王麗峰，黨占國.當前豬病治療困難的原因及防控對策[J].畜牧與飼料科學(xué)，2011，32(8)：118-119.

[5] 林進秋，李沐華.豬圓環(huán)病毒2型和致病性沙門氏菌的混合感染[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2005，30(6)：33-34.

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[8] 康麗娟，張鳳玲，于德和，等.豬圓環(huán)病毒病Ⅱ型的診斷與防治[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2005(10)：27-28.

[9] 張家崢，李召展，劉小燕，等.豬圓環(huán)病的防制對策[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2004(2)：11-13.

2016-11-18)

馬莉莉 (1992-) 女，黑龍江人，在讀碩士，研究方向為分子細菌學(xué)和免疫學(xué)

*通訊作者：倪宏波(1972-)男，黑龍江人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子細菌學(xué)和免疫學(xué)研究