美系大白豬LEF-1基因多態性與乳頭數及生長性狀的相關性研究

*（.華中農業大學農業部豬遺傳育種重點實驗室，湖北 武漢 40070；.湖北省畜禽育種中心，湖北 武漢 4007；.浙江天蓬集團有限公司，浙江 江山 4）

美系大白豬LEF-1基因多態性與乳頭數及生長性狀的相關性研究

胡閃耀1，楊 華2，姜佳佳3，毛 翠3，毛慧敏3，王利通3，王國水3，左 波1*
（1.華中農業大學農業部豬遺傳育種重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.湖北省畜禽育種中心，湖北 武漢 430072；3.浙江天蓬集團有限公司，浙江 江山 324111）

乳頭數是衡量母豬整體繁殖性能的重要指標之一，增加母豬有效乳頭數對于提高仔豬哺乳成活率具有重要意義。該試驗采用PCR-RFLP技術，在美系大白（633頭）群體中，對LEF-1基因的多態性進行檢測和遺傳效應分析。研究結果發現，在美系大白豬中檢測到LEF-1基因三種基因型（AA、AG和GG基因型）的存在，但不同基因型個體之間乳頭數無顯著差異。

豬；LEF-1；SNP；關聯分析

1 前言

淋巴增強結合因子1（LEF-1）屬于調節蛋白家族的一員，是最早被發現參與乳腺形成的調節因子之一。LEF-1是經典Wnt信號通路中的調節因子之一，該信號通路在胚胎發育過程中，可以調節早期的乳腺形態發生變化[1-2]。因此，S.Tetzlaff等將LEF-1作為影響豬乳頭數的候選基因，并在其3’端UTR發現了兩個SNPs（EU719607：g.1351T＞C，g.1666A＞C）與豬乳頭數顯著相關[3]；Xu RX等以3個中國地方豬種和大白豬為材料，對LEF-1基因進行重測序，分別在第4外顯子和第9內含子上檢測到兩個新的突變位 點（NC_010450.3：g.99514A＞G，119846C＞T）。關聯分析發現，這兩個突變位點均可以顯著影響豬乳頭數[4]。這些研究結果表明，LEF-1基因可作為影響豬乳頭數的候選基因進行深入的研究。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

美系大白豬633頭（源自浙江開盛生態農業發展有限公司）。基因組DNA采用血液基因組DNA中量提取試劑盒（離心柱型）提取，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

2.2 基因型檢測

本實驗主要利用PCR-RFLP技術進行基因分型，本研究所用引物根據Xu RX（2014）發表的引物序列合成引物：（F）5′--TGATTCTTGTTACTGCTGATGC--3′，（R）5′-- ACCACCCACCCAATGACA--3′。PCR反應體系為20 μL包含以下成分：Sense primer（10 μM），0.5 μL；Antisense primer（10 μM），0.5 μL；ddH2O，8.0 μL；DNA，1.0 μL；2×Es Taq MasterMix（ 含染 料 ），10.0 μL。 反 應 程 序 為：94 ℃，4 min；34個 循 環（94 ℃，30 s-Tm，40 s-72 ℃，根據片段長度有所不同，1 000 bp按30 s設計）；72 ℃，5 min；25 ℃，1 min。PCR產物利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

酶切反應體系為20 μL，其中 PCR production，10.0 μL；FastDigest EcoRII，1.0 μL；10×FastDigest Green Buffer，2.0 μL； ddH2O，7.0 μL。37 ℃消化30 min，然后利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照保存圖片，統計基因型。

2.3 基因效應分析

本實驗所采用模型為：Tijkl=μ+Gi+Fj+Sk+Pl+eijklm，Tijkl為 性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應（包括基因加性效應和顯性效應）；Fj、Sk、Pl為固定效應，分別為家系、性別、批次，eijklm為殘差效應。采用SAS軟件GLM模型自編程序完成，同時采用reg程序計算基因加性效應和顯性效應，并進行顯著性檢驗。

3 結果與分析

3.1 LEF-1基因的PCR-EcoRIIRFLP多態性檢測

LEF-1基因酶切分型的PCR產物長為344 bp，見圖1，利用EcoRII內切酶酶切后分別產生189 bp和155 bp的片段，根據酶切后產生的條帶類型將三種基因型分別命名為：AA型（189 bp+155 bp），AG型（344 bp+189 bp+155 bp），GG型（344 bp）。1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。

3.2 LEF-1基因在大白豬中的基因頻率分布及與乳頭數和生長性狀的關聯分析

3.2.1 LEF-1基因在大白豬群體中的基因頻率

圖1 LEF-1基因PCR電泳結果

圖2 LEF-1基因PCR-EcoRII-RFLP酶切分型結果

表1 大白豬LEF-1基因EcoRII-RFLP基因型頻率和等位基因頻率

表2 LEF-1基因EcoRII多態性與美系大白豬乳頭數和生長性狀的關聯分析

利用PCR-EcoRII-RFLP技術對LEF-1基因多態性進行檢測，在美系大白豬中檢測到三種基因型，對各基因型頻率進行統計，結果如表1所示。

由表1可以看出，在美系大白豬群體中LEF-1基因的AA基因型頻率高于AG和GG基因型，A等位基因屬于優勢等位基因。另外，該基因在美系大白豬中不符合哈迪-溫伯格平衡（P＜0.05）。

3.2.2 LEF-1基因多態性與美系大白豬乳頭數及生長性狀的關聯分析

分別對LEF-1基因對美系大白豬乳頭數及生長性狀的遺傳效應進行分析，分析結果見表2。關聯分析結果表明，在美系大白豬群體中LEF-1基因對乳頭數、初生重、體長等性狀都沒有顯著影響。

4 討論

本實驗對LEF-1基因的SNP（g.99514A＞G）位點在美系大白豬中的多態性進行了檢測。在美系大白豬中AA、AG和GG三種基因型均有分布，其中A等位基因頻率為0.805，屬于優勢等位基因，這與Xu RX等人的研究結果一致[4]。關聯分析研究結果顯示，在美系大白群體中AA基因型個體的乳頭數略高于AG型和GG型個體，但沒有達到顯著水平，這與Xu RX等人的研究結果并不一致[4]，說明LEF-1基因的g.99514A＞G突變位點對美系大白豬的乳頭數變異沒有影響。由此推測該突變位點可能只是一個連鎖性的標記，并不是引起豬乳頭數變化的因果突變位點，在不同的群體中對乳頭數的遺傳效應也不一致。因此，LEF-1基因作為一個影響豬乳頭數的候選基因，還需要對其進行進一步的研究，檢測是否存在功能性的突變位點，并在不同群體中擴大樣本進行分析驗證。

[1] VAN GENDEREN C，OKAMURA R M，FARINAS I，et al.Development of several organs that require inductive epithelial-mesenchymal interactions is impaired in LEF-1-deficient mice[J].Genes & development，1994，8(22)：2691-2703.

[2] BORAS-GRANIC K，CHANG H，-GROSSCHEDL R，et al.Lef1 is required for the transition of Wnt signaling from mesenchymal to epithelial cells in the mouse embryonic mammary gland[J].Developmental biology，2006，295(1)：219-231.

[3] TETZLAFF S，JONAS E，PHATSARA C，et al.Evidence for association of lymphoid enhancer-binding factor-1(LEF1) with the number of functional and inverted teats in pigs[J].Cytogenetic and genome research，2009，124(2)：139-146.

[4] XU R X，WEI N，WANG Y，et al.Association of Novel Polymorphisms in Lymphoid Enhancer Binding Factor1(LEF-1) Gene with Number of Teats in Different Breeds of Pig[J].Asian-Australasian journal of animal sciences，2014，27(9)：1254.

2016-12-20）

本項目受國家科技支撐計劃（項目編號：2014BAD20B01）、浙江省重大科技專項（項目編號：2014C02010）、中央高校基本科研業務費專項（項目編號：2014PY038；2662016PY012）資助

胡閃耀（1988-），男，河南平頂山人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖方面研究，E-mail：shy907530102@qq.com

左波，華中農業大學，動科動醫學院教授，E-mail：zuobo@mail.hzau.edu.cn