15個生防菌株乙酸乙酯提取物對松材線蟲的殺蟲活性*

魏博涵 張鍇 申加興 唐慧 宋瑞清

（東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

15個生防菌株乙酸乙酯提取物對松材線蟲的殺蟲活性*

魏博涵 張鍇 申加興 唐慧 宋瑞清**

（東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

篩選的15個生防菌株乙酸乙酯提取物對松材線蟲的殺蟲活性研究表明，淡紫擬青霉菌株P(guān)T1殺蟲效果最佳，24 h、48 h和72 h校正死亡率均達(dá)到100%；木霉菌株T-28在24 h校正死亡率達(dá)到78.64%，48 h為97.12%，72 h達(dá)到100%；T-19和T-43在72 h校正死亡率分別達(dá)到63.17%，63.59%。

松材線蟲；淡紫擬青霉；木霉；厚垣孢普可尼亞菌；提取物；殺蟲活性

松材線蟲病是一種以病原松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)為主導(dǎo)的，綜合有人為參與、媒介天牛傳播、寄主松樹、樹棲真菌和伴生細(xì)菌及環(huán)境因素的復(fù)雜病害系統(tǒng)，是松樹上一種毀滅性病害，被稱為“無煙的森林火災(zāi)”[1]。我國自1982年發(fā)現(xiàn)該病以來，現(xiàn)已擴(kuò)展到江蘇、浙江、安徽、廣東、山東、湖北、香港等地，造成林業(yè)經(jīng)濟(jì)、森林生態(tài)上的巨大損失和自然景觀的嚴(yán)重破壞，并對我國的松樹造成巨大威脅[2,3]。目前，松材線蟲的防治以化學(xué)防治為主，但由于化學(xué)防治存在易產(chǎn)生抗藥性、污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡等諸多問題，因此研制開發(fā)低毒低殘留、環(huán)境友好型的植物源、微生物源等生物農(nóng)藥日益受到重視。木霉菌（Trichoderma spp.）是一類廣譜拮抗菌，能拮抗多種病原真菌，具有生產(chǎn)速度快、產(chǎn)孢量大、易培養(yǎng)、作用機(jī)制多的特點，是微生物農(nóng)藥的重要生產(chǎn)菌株[6]。厚垣孢普可尼亞菌（Pochonia chlamydospora）是一種即可以寄生在線蟲上，又可以在土壤中營腐生生活的一種兼性寄生菌，利用其寄生線蟲的特點，可研制生物菌株用于防治[7]。淡紫擬青霉菌（Paecilomyces lilacinus）是目前防治植物根結(jié)線蟲的最有效生物制劑[8]，是防治植物線蟲較有潛力的生物防治菌劑之一，對植物線蟲卵具有較強(qiáng)的寄生能力[9]。鑒于此，本研究以木霉菌、厚垣孢普可尼亞菌和淡紫擬青霉菌等線蟲生防菌株為研究對象，對松材線蟲進(jìn)行室內(nèi)殺蟲活性研究。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株與松材線蟲

木霉菌8株（T-13、T-14、T-19、T-28、T-33、T-35、T-43、T203），厚垣孢普可尼亞菌4株（PC1、PC2、PC3、PC4），淡紫擬青霉菌3株（PT1、PT2、PT3），均來源于中國林科院微生物菌株平臺。灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、松材線蟲NXY61均由中國林科院森環(huán)森保所張星耀課題組提供。上述菌種均保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物實驗室，各菌株具體信息見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

試驗用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）（配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL）和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）（配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL）。

1.1.3 試驗儀器

SHB-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、TDL-40B臺式離心機(jī)（D-37520 osterode made in Germany）、HZQ-F100恒溫振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）、LDZX-40AI自動型不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、SW-CJ-2F超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、FA2004N電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

表1 研究所用菌株及來源

1.2 各菌株活性成分提取

1.2.1 發(fā)酵液的制備

用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)木霉菌、淡紫擬青霉、厚垣孢普可尼亞菌3屬15個菌株。在超凈工作臺用直徑為5 mm的無菌打孔器切取在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的各菌株菌餅，接種于盛有250 mL PD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種3～4片菌餅，置于搖床上（25℃，150 r/min）振蕩培養(yǎng)10天。

1.2.2 提取菌株活性成分

收取培養(yǎng)10天的培養(yǎng)液，用4層紗布過濾，將濾液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，比例為1∶3。萃取2天后，用分液漏斗分液得到提取液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到少量液體，再滴加5 mL吐溫80即得到各菌株的活性成分。

1.3 線蟲培養(yǎng)

用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)灰葡萄孢，放置于培養(yǎng)箱中（25℃）培養(yǎng)。

在超凈工作臺中接種松材線蟲于灰葡萄孢中，培養(yǎng)10天。用400目尼龍篩布采用貝爾曼漏斗法分離線蟲，4 h后用PBST（1倍）緩沖液沖洗線蟲2次，在離心機(jī)（3 500 r/min，5 min）中離心去掉雜質(zhì)后，用PBST緩沖液稀釋線蟲液，重復(fù)3次，最后收取到線蟲液。

1.4 室內(nèi)線蟲毒力測定

用提取好的各菌株活性成分對線蟲液進(jìn)行毒力測定，即將各菌株活性成分150 μL及線蟲液50 μL混合后置于96孔板中，重復(fù)3次，并以未滴加活性成分的吐溫80為對照，處理后24 h、48 h和72 h進(jìn)行觀察和測定，并計算校正死亡率。

2 結(jié)果與分析

松材線蟲處理后，在4倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)死亡線蟲數(shù)（線蟲僵直不動視為死亡）及線蟲總數(shù)，綜合所有提取物對松材線蟲的處理圖(圖1～圖3，其它略)，并計算其校正死亡率的結(jié)果（圖4）表明，15個菌株都有一定的殺蟲效果，其中淡紫擬青霉PT1的殺蟲效果最好，24 h校正死亡率高達(dá)100%，48 h和72 h也分別為100%；木霉菌株T-28的24 h校正死亡率為78.64%，48 h為97.12%，72 h達(dá)到100%；T-19、T-43的72 h校正死亡率分別達(dá)到63.17%、63.59%。

圖1 T-28處理后的松材線蟲顯微鏡圖

圖2 PT1處理后的松材線蟲顯微鏡圖

圖3 tuwen液對照組的松材線蟲顯微鏡圖

圖4 各菌株乙酸乙酯液提取物殺蟲效果

3 結(jié)論與討論

采用乙酸乙酯對8株木霉菌株、3株淡紫擬青霉菌菌株、4株厚垣孢普可尼亞菌株的活性成分進(jìn)行提取后，用其對松材線蟲進(jìn)行毒力測定結(jié)果表明，15個菌株乙酸乙酯提取物均具有一定的殺蟲效果，其中淡紫擬青霉PT1的殺蟲效果最好，其次為木霉菌株T-28、木霉菌株T-19和T-43。

［1］董錦艷，李國紅，張克勤.真菌殺線蟲代謝物的研究進(jìn)展［J］.菌物系統(tǒng)，2001,2(2)：286-296.

［2］謝立群，趙博光.松材線蟲病的病理學(xué)研究進(jìn)展［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，25(2)：204-208.

［3］楊振德，趙博光，郭建.松材線蟲行為學(xué)研究進(jìn)展［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003,27(1):87-92.

［4］羅蘭，謝丙炎，楊宇紅，等.具殺線蟲活性的蘇云金桿菌篩選研究［J］.植物病理學(xué)報，2007，37(3)：314-316.

［5］彭雙，閆淑珍，陳雙林.具殺線蟲活性植物內(nèi)生細(xì)菌的篩選和活性產(chǎn)物［J］.微生物學(xué)報，2011，51(3)：368-376.

［6］程麗云.木霉菌的種類鑒定及生防菌株的篩選［D］.福建：福建農(nóng)林大學(xué)，2007.

［7］萬永虎.厚垣孢普可尼亞霉菌ZK7菌株生防制劑的研制及田間使用［D］.云南：云南大學(xué)，2013.

［8］李芳.淡紫擬青霉菌生物學(xué)特性與次生代謝物質(zhì)生物效應(yīng)研究［D］.福建:福建農(nóng)林大學(xué)，2005.

［9］姜培增，李宏園，陳鐵保.淡紫擬青霉防治植物線蟲研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2006，8(6)：38-41.

第1作者簡介：魏博涵（1995-），女，本科生。

The Insecticidal Activities of Ethyl Acetate Efficiently Extracts from Fifteen Bio-control Strains to Pine Wood Nematode

WEI Bohan
（The Northeast Forestry University,HeilongjiangHarbin150040）

Efficient strains for killing pine wood nematode were screened through the research on insecticidal activities of ethyl acetate efficiently extracts from fifteen bio-control strains to pine wood nematode.They arePaecilomyces lilacinusPT1，TrichodermaSPP.T-28，TrichodermaSPP.T-19 and TrichodermaSPP.T-43.Paecilomyces lilacinusPT1 has the best killing effect to the nematode,the death rate reached 100%within ether 24 h,48 h or 72 h，the death rate ofTrichodermaSPP.T-28 reached 78.64%in 24 h，48 h for 97.12%and reached 100%in 72 h;TrichodermaSPP.T-19 andTrichodermaSPP.T-43 death date in 72h was 63.59%，63.17%respectively.These strains can be used as efficient strains for further research.

Bursaphelenchus xylophilus;Paecilomyces lilacinus;Trichoderma;Phchonia chlamydosporia; Killing activities toBursaphelenchus xylophilus

S 763.306.4

A

1001-9499（2017）01-0024-03

宋瑞清（1964-），教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事菌物開發(fā)利用及林木病害可持續(xù)控制。

2016-11-29

（責(zé)任編輯：王岳）

*由948項目資助（項目編號：2015-4-34）；東北林業(yè)大學(xué)本科生創(chuàng)新項目