基于聚合物添加劑譜庫的緩沖鹽中塑料藥品包裝材料難揮發可溶出物的快速分析方法研究

邢雪彬，張 云，孫姝琪，杜振霞*，秦孫星，董 彥

(1.北京化工大學 理學院，北京 100029；2.上海樂純生物技術有限公司，上海 201600)

基于聚合物添加劑譜庫的緩沖鹽中塑料藥品包裝材料難揮發可溶出物的快速分析方法研究

邢雪彬1，張 云1，孫姝琪1，杜振霞1*，秦孫星2*，董 彥2

(1.北京化工大學 理學院，北京 100029；2.上海樂純生物技術有限公司，上海 201600)

采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)，結合基于UNIFI軟件建立的174種聚合物添加劑的譜庫，實現了塑料藥品包裝材料中難揮發可溶出物(Extractables)的快速篩查和準確定量。樣品經氯仿萃取后，以甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相在CORTECS C18(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)色譜柱上進行分離，在質譜電噴霧正離子模式下，UPLC-QTOF-MS進行篩查和定量分析。結果表明，浸泡60 d緩沖鹽(25 ℃)中檢出4種物質，利用譜庫篩查確定其中1種物質是鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)，采用外標法定量，測得其溶出量為1.98 μg/L；其余3種物質可通過精確質量數、MSE譜圖等進行推斷定性，利用結構與質量數相近的鄰苯二甲酸二環己酯(DCHP)為內標進行定量，3種提取物的總含量為10.80 μg/L。利用DIDP進行回收率實驗，5，10，20 μg/L 3個加標水平的回收率為90.1%～97.1%，相對標準偏差(RSD，n=6)不大于3.7%。該方法快速、準確、靈敏，適用于藥品包裝材料的安全性考察。

難揮發性可溶出物；藥品包裝材料；超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS);譜庫篩查

塑料由于其良好的化學穩定性和機械、加工性能，可方便而廉價地替代玻璃或金屬等材料，因而在藥品包裝上應用廣泛[1]。然而，塑料的性能是通過許多添加劑的引入而實現，其中部分添加劑顯示出極端的遺傳毒性、肝毒性或致畸性[2-5]。藥品在直接接觸包裝材料的過程中，包裝材料中殘留單體、添加劑或降解產物可能會遷移、溶出到藥品中，對人體造成危害。美國FDA(the US Food and Drug Administration)從2013年開始，藥物召回事件呈爆炸式增長(僅2013年召回藥物多達1 225種，而之前9年內，累計召回藥物才2 217種)，其中由于包裝材料導致的藥物污染成為召回事件發生的主要原因。基于此，FDA頒布了相關法規對包裝材料溶出物進行控制。法規中明確指出，包裝材料的制造商需對即將上市的包裝材料進行藥物相容性試驗。因此，包裝材料制造商必須要確保材料中遷移物的種類和含量不會對人體產生負面影響[6]。我國也在2015年發布了YBB 00032005-2015《鈉鈣玻璃輸液瓶》等130項直接接觸藥品的包裝材料和容器國家標準的公告(2015年第164號)[7]，進一步加強了對藥品包裝材料的監管。

目前，有關包裝材料中溶出物的檢測方法主要包括氣相色譜法(GC)[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[10-12]及液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[13-15]。現有文獻主要研究食品包裝材料中溶出物，而藥品包裝材料溶出物分析鮮見報道。且這些方法只針對特定的某幾類添加劑，而在實際的應用中，塑料藥品包裝材料中的可溶出物可能是未知、多種類的混合物。因此，建立一種快速篩查、檢測分析塑料藥品包裝材料中所有難揮發可溶出物(Extractables)的方法，對保障藥品安全有十分重要的意義[16-18]。

本文采用液液萃取作為前處理手段，利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)檢測PBS緩沖鹽溶液中的溶出物，利用實驗室已建立的聚合物添加劑譜庫[19]及Waters UNIFI軟件對分析結果進行快速篩查和定量分析，建立了藥品包裝材料中難揮發可溶出物的快速測定方法，為包裝材料廠商以及使用單位合理選擇包裝材料提供了參考數據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS，Waters，美國)，渦旋儀，Milli-Q Advantage A10 超純水系統(Millipore，美國)，MTN-2800D 氮吹儀(Auto Science，天津)，SHA-BA水浴恒溫振蕩器(華普達，江蘇)，采集軟件(UNIFI，Waters，美國)。

色譜純和質譜純甲醇(Fisher公司，美國)，色譜純甲酸，Milli-Q Ⅰ級超純水，三氯甲烷(分析純，北京化工廠)，鄰苯二甲酸二異癸酯(純度99.5%，北京華威銳科化工有限公司)，鄰苯二甲酸二環己酯(純度99%，北京華威銳科化工有限公司)，氯化鈉固體、磷酸二氫鉀固體(純度99.5%，阿拉丁，美國)，磷酸氫二鈉固體(純度99%，阿拉丁，美國)。儲液袋容積為500 mL，由上海樂純生物技術有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶出試驗PBS緩沖鹽體系：1.00 L緩沖鹽含NaCl 8.76 g，Na2HPO42.87 g，KH2PO40.31 g，PBS緩沖鹽體系的pH值為7.5。

儲液袋溶出實驗：由儲液袋硅膠管入口向儲液袋中灌裝250 mL PBS緩沖鹽溶液，保證儲液袋內表面均能接觸到溶液，在水浴恒溫振蕩器中(25±1) ℃振蕩60 d后待測。另將250 mL PBS緩沖鹽溶液在玻璃瓶中相同條件下儲存，作為空白對照。

1.2.2 樣品前處理從儲液袋中移取5 mL PBS緩沖鹽溶液于15 mL具塞玻璃管中，加入2 mL蒸餾氯仿，渦旋10 min使其萃取充分后靜置60 min。移去上層水相，有機相在40 ℃下氮吹至干，用0.5 mL甲醇-氯仿(體積比為9∶1)復溶后，進行UPLC-QTOF-MS檢測。

1.2.3 UPLC-QTOF-MS條件利用UPLC-QTOF-MS檢測實際樣品，所用色譜和質譜條件與基于UNIFI軟件建立的聚合物添加劑譜庫條件完全相同。色譜條件：色譜柱：Waters CORTECS UPLC C18(2.1 mm×100 mm，1.6 μm);流動相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B);梯度洗脫程序：0～3 min，60%～99% A；3～9 min，保持99% A；9～9.1 min，99%～60% A；9.1～11 min，60% A。流速0.3 mL/min，進樣量5 μL。

質譜條件：電離模式：ESI+；檢測模式：MSE；毛細管電壓：3 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；錐孔電壓：30 V，碰撞能量為20～40 eV；LockSpray：m/z556.277 6，每30 s切換1次進行質量數的校正。

在實際分析時，按此色譜-質譜條件對樣品進行檢測后，利用譜庫對分析結果進行處理，即可完成篩查和匹配定性。

1.2.4 標準溶液的配制準確稱取一定量DIDP和DCHP，用蒸餾過的三氯甲烷溶解，配制成10.00 g/L單標儲備液，再分別用甲醇稀釋成一系列濃度梯度的標準溶液。每次使用前，現配現用。

2 結果與討論

2.1 萃取溶劑的優化

由于大多數的包材添加劑均為弱極性化合物，且液液萃取的萃取溶劑應與水不互溶。本實驗選取3種不同的萃取溶劑(甲苯、氯仿、乙酸乙酯)考察了在不同添加水平(5，10，20 μg/L)下對常見的薄膜添加劑DIDP的萃取效果。按照 “1.2.2 ”方法對樣品進行處理，結果表明，以甲苯為萃取溶劑時，回收率為53.1%～58.0%；以乙酸乙酯為萃取溶劑時，由于乙酸乙酯部分溶于水，導致回收率進一步降低為51.1%～51.2%；而以氯仿為萃取溶劑時，回收率為90.1%～97.1%，因此選取氯仿為萃取溶劑。

2.2 聚合物添加劑譜庫定性標準

圖1 實際樣品(上)和空白樣品(下)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of real(top) and blank(below) samples

圖2 識別目標和非目標塑料包材難揮發可溶出物的流程Fig.2 Workflow for identification targeted and non-targeted extractables

2.3 實際樣品的快速篩查方法

用UPLC-QTOF-MS對500 mL儲液袋儲存的PBS緩沖鹽和空白溶液進行測定(25 ℃，60 d)。為保證實驗數據的準確性，平行實驗6次。對比實際樣品和空白樣品的色譜圖可知，實際樣品中有區別于空白樣品的4個明顯的色譜峰(圖1)，說明該4個不同保留時間的色譜峰所代表的化合物源于PBS緩沖鹽環境下包材的溶出。利用譜庫對結果進行分析，結果表明，4.76 min是DIDP溶出。其他色譜峰的識別均不能通過譜庫直接檢索得到。

對于不能直接利用譜庫識別的質荷比所代表的化合物，可利用UNIFI軟件進行定性分析，定性流程如圖2所示。首先基于精確質量數和同位素的匹配度來推測這些未知化合物的可能元素組成，以2.09 min色譜峰，m/z317.172 3為例。如圖3，從MSE低能量的譜圖中可知該質荷比所代表的化合物不含鹵素，可能含有偶數個氮元素或不含氮元素，根據這些信息可利用“元素組成”功能推測其可能的元素組成，經分析推斷出的元素組成為C17H26O4，且其質量數誤差低于1 ppm，i-FIT 置信度接近100%，則可確定該化合物的元素組成為C17H26O4。然后利用該元素組成通過軟件直接檢索網絡數據庫ChemSpider來推測該元素組成的可能結構：首先選擇相似類別或被研究的最多的化合物結構進行結構和譜圖的匹配驗證，假設此結構正確，利用 “碎片離子匹配” 工具自動判斷MSE高能量通道下譜圖的碎片離子是否歸屬于該化合物。如圖4所示，MSE高能量通道下的m/z221.115 7是歸屬于m/z317.172 3的碎片離子(碎片斷裂結構合理)，多個碎片離子的歸屬即可確證該化合物結構，具體定性結果見表1。

圖3 m/z 317.172 3的元素組成Fig.3 Elemental composition of m/z 317.172 3

2.4 線性關系、方法檢出限與定量下限

利用標準品采用外標法定量DIDP；3種推斷出的化合物由于無標準品，選擇結構式與分子量均相近的DCHP(m/z330.418)對這3種難揮發可溶出物進行定量。取1 g/L的DIDP和DCHP標準溶液，用甲醇分別稀釋成質量濃度梯度為1，2，5，10，20，50 μg/L的標準溶液。在聚合物添加劑譜庫的色譜質譜條件下利用UPLC-QTOF-MS測定2種標準添加劑，以不同分子離子的響應面積比對相應目標物的濃度繪制標準曲線，以標準樣品的3倍信噪比(S/N=3)對應的化合物濃度作為儀器的檢出限(LOD)，以S/N=10確定儀器的定量下限(LOQ)。結果表明，在1～50 μg/L質量濃度范圍內，2種標準添加劑(DCHP，DIDP)呈良好線性，其線性方程分別為：y=1 911.7x+3 365.4(r=0.995),y=488.6x+2 751.2(r=0.994)，LOD分別為0.3，0.5 μg/L，LOQ均為1.0 μg/L。表明此方法具有較高的檢測靈敏度。

圖4 m/z 317.172 3的碎片離子推測

2.5 回收率與精密度

為了考察方法的準確性和可靠性，取DIDP標準溶液采用標準加入法，在空白PBS緩沖鹽溶液中加入5，10，20 μg/L 3個濃度水平，每個添加水平重復6次，在聚合物添加劑譜庫的色譜-質譜條件下利用UPLC-QTOF-MS進行回收率的測定，并計算方法的精密度。結果表明，添加劑在上述3個濃度水平下的回收率分別為97.1%，90.1%，95.8%，相對標準偏差(RSD，n=6)分別為3.7%，3.6%，2.4%，完全滿足實際分析的需求。

2.6 實際樣品的定量

利用所建立的方法分析了在PBS緩沖鹽溶液環境中藥品包裝材料的溶出物及其含量，具體篩查結果見表1。結果顯示，包材中DIDP溶出濃度為1.98 μg/L，其余3種化合物濃度為3.24～3.97 μg/L，表明該藥品包裝材料在PBS緩沖鹽溶液中的難揮發溶出物含量較低，符合法規要求。

表1 實際樣品的篩查結果

*there wasn't the compound in the library，the possible compound could be inferred by the mass spectra and UNIFI software,which was quantified by the standard of DCHP(譜庫中不含該化合物，可通過質譜圖及UNIFI軟件推測其結構，并用DCHP定量)

3 結 論

本文建立了基于聚合物添加劑譜庫的PBS緩沖鹽中塑料藥品包裝材料難揮發可溶出物的快速分析方法。采用液液萃取對實際樣品進行前處理，UPLC-QTOF-MS分析并利用基于UNIFI軟件建立的聚合物添加劑譜庫進行檢測和篩查，對緩沖鹽中的難揮發可溶出物進行定性和定量分析。本方法分析快速、選擇性好、靈敏度高、定性定量準確，實現了藥品包裝材料中難揮發可溶出物的快速篩查與定量，對藥品包裝材料的安全性考察具有重要意義。

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Analysis of Nonvolatile Extractables in Pharmaceutical Packaging Materials in Buffered Saline Based on Polymer Additive Library

XING Xue-bin1,ZHANG Yun1,SUN Shu-qi1,DU Zhen-xia1*,QIN Sun-xing2*,DONG Yan2

(1.College of Science,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China； 2.Shanghai LePure Biotech Co.,Ltd,Shanghai 201600,China)

A rapid method for the determination of extractables in pharmaceutical packaging materials was developed by ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight-mass spectrometry(UPLC-QTOF-MS) based on UNIFI software and a polymer additive library.The samples were extracted with chloroform,and then the extractables were separated on a CORTECS C18(2.1 mm×100 mm,1.6 μm) column using a binary solvent system composed of methanol and 0.1% formic acid water solution.Screening and quantitative analysis were accomplished by UPLC-QTOF-MS under positive electrospray ion mode.The results showed that four extractables were detected in buffered saline(25 ℃,60 days).Diisodecyl phthalate(DIDP) was identified by library searching and quantitated by external standard method with a concentration of 1.98 μg/L.The other three extractables were inferred and identified by accurate mass and MSE spectra match,and they were quantitated with dicyclohexyl phthalate(DCHP).The total content of the three compounds was 10.80 μg/L.The recovery analysis was carried out to evaluate the method with DIDP.The results indicated that the recoveries of DIDP ranged from 90.1% to 97.1% with relative standard deviation(RSD) no more than 3.7%(n=6) at three spiked concentration levels(5,10,20 μg/L).The method was rapid,accurate and sensitive,and was suitable for the safety investigation on pharmaceutical packaging materials.

nonvolatile extractables;pharmaceutical packaging material;ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole-time-of-flight mass spectrometry(UPLC-QTOF-MS);library searching

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.004

2016-05-18；

2016-07-15

國家質量監督檢驗檢疫總局(201510024)

*通訊作者：杜振霞，教授，研究方向：復雜基質中痕量物質分析方法研究，Tel:010-64433909，E-mail:duzx@mail.buct.edu.cn 秦孫星，工程師，研究方向：藥品包裝材料檢測分析，Tel:021-57791703，E-mail:qinsunxing@lepurechina.com

O657.63;F767.6

A

1004-4957(2017)01-0025-06