RP-HPLC法測定SO2處理前后新疆無核葡萄干中的B族維生素

林江麗，王金霞，張雪霞，王吉德

(新疆大學 化學化工學院，新疆 烏魯木齊 830046)

RP-HPLC法測定SO2處理前后新疆無核葡萄干中的B族維生素

林江麗，王金霞，張雪霞，王吉德*

(新疆大學 化學化工學院，新疆 烏魯木齊 830046)

建立了高效液相色譜同時測定SO2處理前后無核葡萄干中4種B族維生素(VB1,VB2,VB3和VB6)的分析方法。考察了流動相組成、pH值及梯度洗脫程序對分離效果的影響。最終采用pH 4.4緩沖溶液和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，4種B族水溶性維生素的線性范圍為0.1～20 mg/L，r2>0.999，檢出限為0.013～0.064 mg/L，方法的平均回收率為83.0%～101.4%，相對標準偏差為0.6%～4.8%。同時利用該法對SO2處理前后無核葡萄干中4種維生素含量的影響進行研究。結果表明，空白無核葡萄干中VB6的含量最大，VB1含量較低；但SO2處理對葡萄干中VB1的含量影響最大，其它3種B族維生素的含量變化不大。該方法簡便，快速，準確性和重現性均較好，可用于葡萄干中B族維生素的測定。

高效液相色譜；SO2處理；B族維生素；葡萄干

新疆無核白葡萄是最重要的制干品種[1]，其品質優良、營養豐富，具有補血氣、抗衰老、抗氧化和消炎等功效[2-5]，應用開發前景廣闊。葡萄干除了富含人體所需的營養物質如氨基酸、葡萄糖等物質外，還含有豐富的水溶性維生素[6-9]，其中維生素的含量對葡萄干的品種有重要影響。B族水溶性維生素是人體正常生理活動必不可少的物質，其攝取量缺乏會引起嚴重的疾病，人體嚴重缺乏VB2和VB3時，常表現為口角炎、皮炎、腹瀉和癡呆等癥狀，缺乏VB1會導致腳氣病[10]。新疆無核葡萄在干制過程中常添加一定量的SO2及其鹽類來抑制果粒褐變并延長其貨架期，但添加的SO2及其鹽類易與維生素等物質發生化學反應[11]，這不僅增加了SO2的殘留量，而且直接影響葡萄干的品質。

目前對于水溶性維生素分析檢測的方法有分子熒光法[12-13]、微生物法(MBA)[14-15]、毛細管電泳(CE)[16-17]、液相色譜-質譜法(LC-MS)[18-20]和高效液相色譜法(HPLC)[21-24]等。高效液相色譜法因其分離速度快，樣品前處理簡單，樣品用量少而廣泛應用于水溶性維生素的分離分析，其分析研究對象多為樣品基質相對簡單的維生素片和液態樣品(如蜂蜜、飲料)中維生素的測定。但目前，國內外采用HPLC法對經SO2處理的無核葡萄干中B族維生素的相關研究鮮有報道。

本文采用RP-HPLC法對新疆無核葡萄干中的4種B族水溶性維生素(VB1，VB2，VB3和VB6)進行分析，同時考察了SO2處理對無核葡萄干中4種B族水溶性維生素的影響，并對樣品前處理和色譜條件進行了優化。旨在對無核葡萄干的品質評價提供理論參考，同時也對SO2處理的食品中B族維生素的質量監控提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

空白葡萄干為采摘后的無核葡萄在無任何添加的情況下避光自然陰干；商品葡萄干為市售。

SO2處理葡萄干：100 g空白葡萄干置于干燥器中，稱取5.0 g偏重亞硫酸鈉于50 mL燒杯中，加入50%硫酸20 mL，產生的SO2氣體對空白葡萄干樣品進行熏蒸處理7 d后，取出葡萄干樣品密封置于-80 ℃保存待測。

乙腈(色譜純，Dikma公司)，VB1,VB2,VB3,VB6對照品(純度≥99%,阿拉丁試劑有限公司)；磷酸二氫鉀為國產分析純；實驗用水為電阻率18.2 MΩ·cm的高純水。

1.2 儀器與設備

SPD-20A型高效液相色譜儀(島津公司)；PHB-8型筆式pH計(上海佑科儀器儀表有限公司)；Coulter Avanti J-25型高速離心機(美國Beckman公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Classic UF型純水儀(韓國Classic UF公司)；FW-80型高速粉碎機(北京市永光明醫療儀器有限公司)；微孔濾膜0.22 μm(上海興亞凈化材料廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制準確稱取VB1，VB2，VB3和VB6標準品各0.002 5 g，用pH 2.5的HCl溶液分別定容于25.00 mL容量瓶中，分別配成各維生素質量濃度為100.0 mg/L的儲備液，用錫箔紙作避光保存，放置4 ℃冰箱中。檢測前根據需要配成不同質量濃度的混標溶液。

1.3.2 樣品前處理條件的優化向低溫保存的葡萄干樣品中加入液氮使樣品低溫均質化。稱取均質化的葡萄干樣品6.00 g置于50 mL具塞三角瓶中，準確加入25.00 mL pH 2.5的HCl溶液密封。調節浸提液pH值范圍為1.0～4.0，浸提溫度為10～50 ℃，超聲時間為10～40 min。浸提液高速離心10 min(10 000 r/min)，上清液定容至25.00 mL容量瓶中。

取1.00 mL樣液，加入0.1 g聚酰胺吸附劑，高速離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.3.3 色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-SP 柱(250 mm × 4.6 mm,5.0 μm)，流動相：A為乙腈，B為一定pH值的緩沖溶液；流速:0.6 mL/min，柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

2.1.1 浸提液pH值對B族維生素提取量的影響考察了浸提液pH值(1.0，2.0，2.5，3.0，4.0)對樣品中4種B族水溶性維生素提取量的影響。結果表明，隨著浸提液pH值的增大，VB1提取量逐漸減小，當pH 1.0時其提取量最大；VB2和VB6提取量逐漸增大，當pH 3.0時兩種維生素的提取量均達到最大值；VB3的提取量先增大后減小，當pH 2.0時其提取量最大。綜合上述因素，pH 3.0為VB2和VB6的最佳提取pH值，但該條件下不利于VB1的提取，pH 2.0為VB3的最佳提取條件，且VB1，VB2和VB6的提取量均較大。為了最終確定浸提液的pH值，考察了pH 2.0和3.0兩種不同浸提液中4種B族水溶性維生素的提取量、回收率及相對標準偏差(RSD)。從表1可看出，pH 2.0和3.0時，4種維生素的測定結果比較接近，平均回收率為89.2%～103.7%，RSD不大于4.6%，該結果說明pH 2.0和3.0時4種維生素均能被充分提取。為了保證樣品中VB1的充分提取且不影響其它維生素的提取量，確定采用pH 2.0的浸提液對樣品中的4種維生素進行浸提。

表1 pH 2.0和pH 3.0時葡萄干中4種B族維生素的提取量、平均回收率和RSDs(n≥3)

2.1.2 浸提溫度對B族維生素提取量的影響考察了浸提溫度(10，20，30，40 ℃)對樣品中4種B族維生素提取量的影響。圖1結果顯示，隨著溫度的升高，VB1的提取量逐漸降低；VB2的提取量逐漸增大，VB3的提取量先增加后減小，30 ℃時其提取量達到最大值；VB6的提取量逐漸增加，30 ℃后其提取量幾乎不變。綜合考慮，本實驗選擇20 ℃對樣品各維生素進行提取。

2.1.3 超聲時間對B族維生素提取量的影響考察了超聲時間(10，20，30，40 min)對樣品中4種維生素提取量的影響。結果顯示，隨著超聲時間的增加，VB1和VB6的提取量逐漸增大，而VB2和VB3的提取量先增大后減小，當超聲時間分別為20 min和30 min時，VB2和VB3的提取量達到最大值。綜合考慮，本實驗最終選擇30 min對樣品各維生素進行提取。

圖2 pH 4.4時4種B族維生素的色譜圖Fig.2 Chromatogram of of four B-vitamins at pH 4.4

2.2 色譜條件的優化

調節和控制流動相pH值是優化分離條件的重要因素。調節流動相pH值(4.0～5.6)，對4種維生素混標溶液進行分析。結果顯示，流動相pH 4.4時，4種B族水溶性維生素的分離效果最好(見圖2)，因此確定流動相最佳pH值為4.4。

流動相的組成是優化分離條件的另一重要因素。等度洗脫對于基質較為復雜的葡萄干樣品中的4種B族水溶性維生素不能實現較好的分離分析。因此須采用梯度洗脫來調節流動相的極性，以改善樣品中待分析組分的分離效果。通過對樣品中干擾物與目標物，以及4種目標物之間的相互分離的結果進行分析，最終確定的梯度洗脫程序為：0～2.0 min，98%B，2.0～20.00 min，80%B，20.00～30.00 min，98%B。

2.3 方法學及性能評價

2.3.1 線性范圍與檢出限配制一系列不同濃度的4種維生素混標溶液，進行液相色譜分析。以峰面積(Y)對維生素的質量濃度(X，mg/L)作圖，得到關系曲線。以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限，其線性關系與檢出限結果見表2。結果表明，4種B族水溶性維生素在一定濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999 2，檢出限均不大于0.064 mg/L，說明此方法可應用于樣品中維生素的定量分析。

表2 4種B族維生素的線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限(n≥3)

2.3.2 回收率與相對標準偏差取6.0 g商品葡萄干樣品，按照“1.3.2”方法進行樣品前處理，分別添加維生素VB1，VB2，VB3和VB6標準品適量，每個添加水平測定3次，進行回收率與精密度實驗，結果見表3。4種維生素的平均回收率為83.0 %～101.4 %，相對標準偏差(RSD)為0.6 %～4.8 %，方法的準確度與精密度滿足定量分析的要求。

表3 4種B族維生素的回收率及相對標準偏差(n≥3)

圖3 標準品(A)與樣品(B)的色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standards(A) and real sample(B)

2.4 實際樣品的測定

依據優化后的色譜條件測定無核葡萄干中4種B族水溶性維生素的含量，樣品色譜圖和標準品色譜圖見圖3，測定結果見表4。從表4可以看出，空白葡萄干(無任何添加自然陰干無核葡萄干)和商品葡萄干中均檢出4種B族維生素，其中空白葡萄干中VB6的含量最高，達到13.96 mg/kg，VB1的含量最低，僅為2.16 mg/kg。

表4 葡萄干中4種B族維生素的含量(n≥3)

2.5 SO2處理對目標物的影響

在最佳色譜條件和樣品提取條件下，分別對SO2處理前后的無核葡萄干樣品中的4種B族水溶性維生素進行分析，結果見表4。由表4可以看出，葡萄干中添加SO2對4種B族水溶性維生素的含量影響程度不同，SO2處理對無核葡萄干中的VB1含量影響最為顯著，而對其它3種B族維生素含量的影響不大。空白和商品無核葡萄干中VB1的含量分別為2.16 mg/kg和2.01 mg/kg，而SO2處理后的無核葡萄干樣品中未檢出VB1。該實驗結果與文獻報道SO2及其鹽類易與VB1發生化學反應的觀點相一致[13]。上述結果說明，富含VB1的食品中不能采用添加SO2及其鹽類作為抗氧化劑和抑菌劑。

3 結 論

由于葡萄干中B族維生素的含量直接影響葡萄干的品質，對葡萄干中B族水溶性維生素含量的準確測定對于葡萄干營養價值的評定具有重要意義。因此建立了高效液相色譜法測定新疆特色干果無核葡萄干中4種B族水溶性維生素含量的分析方法。該方法在一定濃度范圍內相關系數、線性范圍、檢出限、回收率及RSD均較好。同時利用該法對SO2處理前后的無核葡萄干中的4種B族水溶性維生素進行定量分析。實驗結果表明，SO2處理對無核葡萄干中的VB1含量影響較大。該方法的建立對食品中B族水溶性維生素的分析檢測提供了技術支持。

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Determination of B-Vitamins in Xinjiang Currants Treated with SO2by RP-HPLC

LIN Jiang-li，WANG Jin-xia,ZHANG Xue-xia,WANG Ji-de*

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

A RP-HPLC method was developed for the determination of four B-vitamins(VB1,VB2,VB3，VB6) in currant after treated with SO2.The effects of mobile phase,pH value and gradient elution procedure on chromatographic separation were studied.The mobile phase was a mixture of pH 4.4 buffer solution and acetonitrile.Under the optimal conditions,the detection limits of four B-vitamins in currants were in the range of 0.013-0.064 mg/L.The linear ranges were between 0.1 mg/L and 20 mg/L with correlation coefficients(r2) larger than 0.999.The average recoveries for the method were in the range of 83.0%-101.4%while RSDs were in the range of 0.6%-4.8%.At the same time,the contents of these vitamins before and after treated with SO2were investigated.The results showed that the content of VB6in currant was the highest and that of VB1was lower.But the change of VB1content in currant treated with SO2was the largest,and the contents of other three species of B-vitamins changed very little.The method showed the advantages of simplicity,rapidness,accuracy and reproducibility,and was suitable for the determination of B-vitamins in currants.

high performance liquid chromatography(HPLC);SO2;B-vitamins；currants

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.021

2016-08-13；

2016-09-20

新疆維吾爾自治區自然科學基金面上項目(2013211A015)

*通訊作者：王吉德，博士，教授，研究方向：應用化學，Tel:0991-8582807,E-mail：xjuwangjd@163.com

O657.72；O629.4

A

1004-4957(2017)01-0122-05