基于分散固相萃取液相色譜-串聯質譜法測定大米中8種真菌毒素

孫偉華，楊 歡，曹趙云，馬有寧，秦美玲，柴爽爽，陳銘學

(中國水稻研究所 農業部稻米及制品質量監督檢驗測試中心，浙江 杭州 310006)

基于分散固相萃取液相色譜-串聯質譜法測定大米中8種真菌毒素

孫偉華，楊 歡，曹趙云，馬有寧，秦美玲，柴爽爽，陳銘學*

(中國水稻研究所 農業部稻米及制品質量監督檢驗測試中心，浙江 杭州 310006)

建立了大米中HT-2毒素、T-2毒素、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和黃曲霉毒素B1共8種真菌毒素的快速測定方法。比較了3種基于分散固相萃取原理的樣品前處理方法(即QuEChERS方法、EMR-lipid方法以及DisQuE方法)對8種真菌毒素的回收率；以提取后加標法考察大米基質中各目標物LC-MS/MS分析的基質效應。結果表明，QuEChERS樣品前處理方法不適于伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和赭曲霉毒素 A分析；而EMR-lipid樣品前處理方法無法消除玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素 A在大米中的基質效應。據此采用DisQuE方法并優化LC-MS/MS分析參數，一次進樣監測16對離子對(每個化合物2對離子對)分析大米中的8種真菌毒素殘留量。8種真菌毒素在3個添加水平下的回收率為70.0%～124.1%，相對標準偏差為0.9%～16.9%，檢出限(S/N≥3)為1.2～60.0 μg/kg。該方法準確、靈敏，適用于大米中多種真菌毒素的快速分析。

QuEChERS方法;EMR-lipid方法;DisQuE方法;LC-MS/MS;真菌毒素;大米

真菌毒素(Mycotoxin) 是由霉菌等真菌產生的有毒的次生代謝產物，也稱霉菌毒素，可廣泛污染農作物、食品及飼料等植物源性產品[1-2]，其中對農產品和食品的污染最為嚴重。目前在自然界中已發現有400多種真菌毒素，其中最為關注的有黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)、展青霉素(Patulin)、赭曲霉毒素(Ochratoxin,OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)、伏馬毒素(Fumonisin,FB)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、T-2毒素等[3]。研究表明，這些真菌毒素不僅會對食品有影響，如導致食品霉敗變質、營養物質損失及品質降低，還對人和動物造成極大危害，抑制其體內DNA，RNA，蛋白質和各種酶類的合成、破壞細胞結構并引起真菌毒素中毒[4-5]。部分真菌毒素具有致癌、致畸、致細胞突變的“三致”作用[4,6-8]。據聯合國糧農組織(FAO)統計，每年全球農產品污染率高達25%，損失達10億噸；據我國國家糧食局統計，每年有3 100萬噸糧食在生產、儲存、運輸的過程中受到真菌毒素污染，約占糧食年總產量的6.2%[9-10]。糧食及其制品作為人類不可或缺的主要食物和動物飼料的主要來源，真菌毒素的污染越來越受到關注。許多國家在近幾十年來陸續制定并頒布了諸多相關的法律法規和毒素限量標準，以確保人類的食物安全[4-5]。

由于對真菌毒素的強制限量規定和各項監控措施的實施，強力促進了真菌毒素檢測方法的發展。與其他眾多的真菌毒素檢測方法相比，液相色譜-質譜聯用法(LC-MS/MS)可以通過保留時間和破碎離子共同完成定性定量分析，具有準確、穩定、可靠等特點，其中最顯著的技術優勢是多組分、多類別真菌毒素的同時分析檢測，是一種靈敏度和選擇性極高的真菌毒素檢測方法[11-12]。但由于糧食種類多、成分復雜、理化性質各不相同、在特定條件下可能會發生相互作用，產生基質干擾。因此，樣品前處理通常采用免疫親和柱[13]、多功能凈化柱[14-16]、固相萃取柱[17-18]、凝膠色譜法等凈化方法[19]，但這些方法成本高、操作繁瑣、工序復雜，不利于大量樣品中多種毒素的同時分析檢測。QuEChERS方法最先于2003年應用于水果和蔬菜中的農藥多殘留檢測[20]，是近年發展起來的用于真菌毒素檢測的分散固相萃取方法，其利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用達到凈化除雜的目的[21-22]。相較于其他凈化方法，QuEChERS方法具有操作簡單、快速便捷、經濟耐用等優點。

本文參考以分散固相萃取用于稻谷中多種真菌毒素分析的研究，采用QuEChERS方法[23]、Agilent QuEChERS dSPE EMR-lipid方法[24]以及Waters DisQuE方法[21]，考察了不同分散固相萃取方法對8種真菌毒素的回收率；以提取后添加法[25-26]考察了大米基質中各目標化合物LC-MS/MS分析的基質效應。優化LC-MS/MS分析參數以提高靈敏度，選擇動態多反應監測(Dynamic MRM)采集模式，一次進樣即可完成8種真菌毒素的定性定量分析。該方法簡便快速，可操作性強，免去了繁瑣的固相萃取柱凈化步驟，并降低了免疫親和柱檢測成本，為企業及食品安全監管部門提供了有效的技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

Survryor系列液相色譜儀(美國ThermoFisher公司)，TSQ Quantum Access Max三重四極桿質譜儀，配電噴霧離子源(ESI,美國ThermoFisher公司)，高速勻漿機(德國IKA公司)。

1.2 試劑與材料

乙腈(色譜純,德國Merck公司);甲酸(色譜純,美國Tedia公司);實驗用水為Milli-Q高純水；黃曲霉毒素B1(AFB1,2.01 μg/mL)、赭曲霉毒素 A(OTA,10.34 μg/mL)、HT-2毒素(HT-2,100.7 μg/mL)、T-2毒素(T-2,100.6 μg/mL)、玉米赤霉烯酮(ZEN,100.1 μg/mL)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON,100.3 μg/mL)、伏馬毒素B1(FB1,50.9 μg/mL)、伏馬毒素B2(FB2,50.1 μg/mL)標準品均購于Romer公司。EMR材料(美國Agilent公司)，DisQuE材料(美國Waters公司)。

1.3 工作溶液的配制

混合標準工作溶液：分別取適量的各單標儲備液，配成含0.5 mg/L AFB1，OTA；2.5 mg/L T-2，HT-2，ZEN；25 mg/L FB1，FB2；以及10 mg/L DON的混合標準工作溶液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，轉移并密封于棕色玻璃瓶中，于-20 ℃下避光保存。使用時以乙腈逐級稀釋成所需濃度的工作溶液。

1.4 樣品前處理方法

1.4.1 QuEChERS方法稱取5.0 g樣品于250 mL聚乙烯離心管中，加入20 mL水浸泡30 min，再加入25 mL乙腈，勻漿提取后，分別加入10 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉，勻漿并離心(5 000 r/min,5 min)。取上層乙腈相4 mL于預先加有1.2 g MgSO4，0.1 g PSA和0.1 g C18的離心管中，渦旋振蕩，離心(5 000 r/min,1 min)后，取上清液過0.22 μm有機相濾膜，濾液待測[23]。

1.4.2 EMR-lipid方法稱取5.0 g樣品于50 mL聚乙烯離心管中，分別加入含0.1%甲酸的乙腈-水(80∶20)提取液10 mL、含0.1%甲酸的乙腈-水(20∶80)提取液10 mL，超聲提取30 min，離心(5 000 r/min,5 min)，合并上清液，再加入1 g檸檬酸鈉、1 g氯化鈉、4 g硫酸鎂和0.5 g檸檬酸氫鈉，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)。于EMR-lipid萃取管(dSPE 1010)中加入5 mL水，渦旋振蕩后，再加入5 mL上清液，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)，將全部上清液轉移至EMR-lipid凈化管(Polish 0101)，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)后，取上清液過0.22 μm有機相濾膜，濾液待測[24]。

1.4.3 DisQuE方法稱取5.0 g樣品于50 mL聚乙烯離心管中，分別加入10 mL超純水、10 mL甲酸-乙腈(10∶90)提取液，超聲提取30 min，加入1 g檸檬酸鈉、1 g氯化鈉、4 g硫酸鎂和0.5 g檸檬酸氫鈉，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)。取5 mL上清液于DisQuE萃取管中(含750 mg硫酸鎂、250 mg PSA、150 mg C18和150 mg Al-N)，渦旋振蕩并離心(5 000 r/min,5 min)，取上清液0.1 mL，用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，混勻后過0.22 μm有機相濾膜，濾液待測[21]。

1.5 色譜-質譜條件

1.5.1 色譜條件色譜柱：XSELECTTMHSS T-3柱(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫：30 ℃；進樣體積：2.0 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液；B為甲醇；流速：200 μL/min；梯度洗脫條件：0～15.0 min，40%～100% B；15.0～20.0 min，100% B；20.0～20.1 min，100%～40% B；20.1～28.0min，40% B。

1.5.2 質譜條件電噴霧(ESI)正、負離子切換模式采集，其中DON，AFB1，OTA，HT-2，T-2，FB1和FB2采用正離子模式，ZEN采用負離子模式。正、負噴霧電壓分別為3 kV和-2.2 kV；離子源溫度為350 ℃；鞘氣壓力為241 kPa；輔助氣流量為1.5 mL/min；碰撞氣(Ar)壓力為0.2 Pa；離子傳輸管溫度為350 ℃；檢測方式：選擇反應監測(SRM)。其他質譜參數見表1。

表1 分析物的質譜采集離子信息

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 LC-MS/MS分析參數的優化

采用蠕動泵注射方式，分別對8種目標化合物標準品溶液進樣，通過母離子掃描發現，除玉米赤霉烯酮(ZEN)外，所有目標物在正離子模式下均比負離子模式具有更高的響應，且均為[M+H]+準分子離子峰。而ZEN在負離子模式下獲得最佳靈敏度，形成[M-H]-峰。通過二級質譜優化，得到8種真菌毒素的最佳MRM采集參數(如表1)。

分別以乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸水、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相，分別考察了8種化合物的分離度、峰形及響應值。試驗結果表明采用甲醇-水溶液作為流動相時絕大多數目標化合物具有較高的靈敏度，而向水相中添加0.1%甲酸后，各物質的響應值均有一定程度的提升，且OTA和HT-2毒素可獲得最佳的靈敏度，離子化效率明顯提高。因此選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為最優的流動相。

圖1 3 種QuEChERS樣品前處理方法應用于毒素添加水平為10～500 μg/kg大米樣品的回收率比較Fig.1 Comparison of recoveries of three versions of QuEChERS sample preparation method for rice samples spiked with 10-500 μg/kg toxins

2.2 樣品前處理方法的選擇

考察了3種QuEChERS樣品前處理方法對8種真菌毒素的提取回收率，以大米為基質，在添加水平(10 μg/kg:AFB1,OTA;100 μg/kg:HT-2,T-2,ZEN;250 μg/kg:FB1,FB2;500 μg/kg:DON)下，分別采用QuEChERS方法、EMR-lipid方法和DisQuE方法進行提取。由圖1可以看出，當以乙腈-水體系(QuEChERS方法)對8種真菌毒素提取時，FB1，FB2和OTA的回收率均小于10%，其他5種真菌毒素的回收率為95%～116%，因此QuEChERS方法適用于DON，AFB1，HT-2，T-2和ZEN的測定。而當提取溶劑為甲酸-乙腈共萃取劑(EMR方法提取液中含0.1%甲酸,DisQuE方法中含10%甲酸)時，能夠兼顧FB1，FB2和OTA的提取效果。這與已有報道基本一致[21,27]，由于多數真菌毒素偏酸性[1]，特別是OTA(苯基丙氨酸部分的pKa=4.4)對提取液pH值較為敏感，而甲酸-乙腈的酸性環境可抑制真菌毒素的電離，使得目標化合物在乙腈中的分配系數增加，從而提高了提取效率。EMR-lipid方法測得AFB1和HT-2的回收率小于60%，但EMR-lipid方法能夠同時滿足FB1，FB2，T-2，ZEN和OTA的測定，回收率均大于85%。而DisQuE方法能夠兼顧8種真菌毒素的提取效果，回收率均大于72%。

基質效應(Matrix effect,ME)是影響LC-MS/MS定量分析準確性的重要因素。實驗采用基質效應強弱來進一步評價DisQuE方法和EMR-lipid方法的純化效果[25]。分別以兩種方法處理得到的樣品粗提液、樣品純化后溶液和0.1% 甲酸水溶液配制8種真菌毒素的混合標準溶液。各目標化合物的質量濃度范圍為：AFB1，OTA：0.2～25.0 μg/L；HT-2，T-2，ZEN：5.0～250.0 μg/L；FB1，FB2：10.0～500.0 μg/L；DON：20.0～1 000.0 μg/L。經LC-MS/MS測定，以目標化合物定量離子的峰面積(y)對含量(x,μg/L)繪制標準曲線。以前兩組樣品獲得的曲線斜率與后一組樣品獲得的曲線斜率比值(η)來判定基質效應的強弱[28]。η值越接近1，基質效應越弱；η值偏離1越大，基質效應越強。結果表明，與DisQuE方法相比，EMR-lipid方法的基質效應較強(如圖2)。當樣品經EMR-lipid方法凈化后，ZEN和OTA均表現出較強的基質效應，ZEN的η值為1.80，而OTA的η值高達2.36。而當樣品經DisQuE方法凈化后，各目標化合物的基質效應明顯減弱，其η值在1.00～1.16之間。由于兩種方法的稀釋倍數不同，因此比較了在稀釋倍數相同的情況下DisQuE方法和EMR-lipid方法的基質效應。結果表明，即使在稀釋相同倍數的條件下，EMR-lipid方法仍具有較強的基質效應，其η值介于0.92～2.31之間。這可能是由于DisQuE方法采用C18和Al-N作為吸附劑，C18可有效去除基質中的脂類、糖類等親脂型雜質，Al-N則通過與基質中含有N，O，P，S等化合物形成金屬簇來有效地除去極性雜質[21]。而EMR-lipid方法只能去除親脂類等雜質[24]。

由此可見，DisQuE方法具有較好的純化效果，提高了方法的準確度。因此最終選擇DisQuE方法作為本實驗的樣品前處理方法。

2.3 方法學驗證

用0.1%的甲酸水溶液配制一系列濃度的標準溶液，在優化條件下進行測定，分別以各分析物定量離子的峰面積對質量濃度(μg/L)繪制標準曲線。各化合物的線性范圍如表2所示，其相關系數均大于0.995 7。

表2 方法的靈敏度、相關系數(r)及回收率(n=6)

*y:peak area;x:mass concentration of analyte,μg/L

采用外標法定量，應用“1.4.3”的DisQuE樣品前處理方法，在大米空白基質(安徽省小樓村) 中添加低、中、高3個濃度水平的標準溶液進行加標回收實驗，計算平均回收率和相對標準偏差(RSD,n=6)。在大米樣品中添加不同濃度的待測物，按本方法進行檢測，以S/N=3確定各目標化合物的檢出限(LOD)，以S/N=10確定各目標化合物的定量下限(LOQ)。結果表明，目標分析物的平均加標回收率為70.0%～124.1%，RSD為0.9%～16.9%；8種目標物的LOD為1.2～60.0 μg/kg，LOQ為4.0～200.0 μg/kg(表2)，方法的靈敏度完全滿足國家標準對真菌毒素的限量檢測要求[18,29]。圖3為空白大米加標回收的定量離子色譜圖。

圖3 空白大米加標回收的定量離子色譜圖

2.4 實際樣品檢測

利用本方法，對農貿市場采購的20份大米樣品進行測定。結果表明，大米樣品中均不同程度地檢出FB1和FB2，其余真菌毒素均未檢出。FB1,FB2在大米樣品中的提取離子色譜圖見圖4。

3 結 論

本文建立了一種基于分散固相萃取原理的DisQuE前處理技術，結合液相色譜-串聯質譜快速測定大米中黃曲霉毒素B1等8種真菌毒素的方法。通過比較QuEChERS，EMR-lipid以及DisQuE 3種不同前處理方法凈化后目標物的提取效率及基質效應，驗證了DisQuE提取方法的有效性。通過優化液相色譜與質譜的采集參數，得到了最佳的儀器檢測條件。方法學考察及實際樣品的檢測證明，該方法實用、可靠，具有簡單、經濟、快速、準確等優點，可作為大米中真菌毒素的快速檢測方法。

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Determination of Eight Mycotoxins in Rice by Dispersive Solid Phase Extraction Coupled with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Wei-hua,YANG Huan,CAO Zhao-yun,MA You-ning,QIN Mei-ling,CHAI Shuang-shuang,CHEN Ming-xue*

(Rice Product Quality Inspection and Supervision Center of Ministry of Agriculture,China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China)

A rapid method was developed for the determination of HT-2 toxin,T-2 toxin,fumonisin B1,fumonisin B2,zearalenone,ochratoxin A,deoxynivalenol and aflatoxins B1 in rice.Three dispersive solid phase extraction sample preparation methods,including QuEChERS method,EMR-lipid method and DisQuE method,were compared for the determination of 8 mycotoxins in rice.The recoveries of the three extraction methods for the toxins were studied.The method of after-extraction addition was used to evaluate the matrix effects for mycotoxins in rice by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).As a result,the QuEChERS method was not suitable for the analysis of fumonisin B1,fumonisin B2 and ochratoxin A.The EMR-lipid methods could not overcome the matrix effects of zearalenone and ochratoxin A in rice.In this study,mycotoxins were extracted by DisQuE method,and analysed by LC-MS/MS under the optimized condition with monitoring 16 pairs of MS/MS transitions of precursor ions(two for each mycotoxin) in one single run.Recoveries at three fortified levels in rice ranged from 70.0% to 124.1% with relative standard deviations of 0.9%-16.9%.The limits of detection(S/N≥3) were in the range of 1.2-60.0 μg/kg.The method was proved to be highly efficient,robust and sensitive,and was suitable for the simultaneous analysis of mycotoxins in rice.

QuEChERS method;EMR-lipid method;DisQuE method;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);mycotoxins;rice

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.01.008

2016-07-03；

2016-08-04

國家農產品質量安全風險評估項目(GJFP2016001001);中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目(2014RG006)

*通訊作者：陳銘學，研究員，研究方向：農產品質量安全風險評估技術，Tel:0571-63370275，E-mail:cmingxue@163.com

O657.63；S852.44

A

1004-4957(2017)01-0047-07