PKC介導的自噬在肝纖維化中的作用

尹瑞梨,時佳宏,潘奇正,周德山*

(1.首都醫科大學 人體解剖與組織胚胎學系,北京100069;2.吉林大學公共衛生學院;3.吉林大學中日聯誼醫院)

PKC介導的自噬在肝纖維化中的作用

尹瑞梨1,時佳宏2,潘奇正3,周德山1*

(1.首都醫科大學 人體解剖與組織胚胎學系,北京100069;2.吉林大學公共衛生學院;3.吉林大學中日聯誼醫院)

目的 探討在PKC信號通路介導的自噬在肝纖維化小鼠肝組織中的變化及意義。方法 本研究將C57BL/6小鼠隨機分為兩組：模型組和假手術對照組，其中模型組采用膽管結扎方法誘導小鼠肝纖維化，手術4周后取材。HE染色、Masson染色顯示小鼠肝組織纖維化程度；免疫組化檢測肝組織內LC3蛋白的表達；Western Blot法檢測肝組織中α-SMA、PKCα、p-PKCα和LC3蛋白的表達,最后將人正常肝細胞L02細胞轉染PKCα siRNA后檢測LC3蛋白的表達變化并分析二者之間的關系。結果 HE和Masson染色結果顯示膽管結扎誘導的肝纖維化模型組有明顯的纖維增生。Western Blot結果顯示模型組肝組織中α-SMA、PKCα和p-PKCα蛋白表達明顯高于對照組(P<0.01)，而Western Blot和免疫組化結果均顯示LC3蛋白的表達則明顯降低(P<0.05)。最后，L02細胞在轉染PKCα siRNA后顯示LC3蛋白表達上調(P<0.01)。結論 PKCα信號通路的激活可以抑制自噬的發生，二者的相互作用可能與肝纖維化的發生和發展密切相關。

膽管結扎誘導的肝纖維化；PKCα蛋白；LC3蛋白；自噬

(ChinJLabDiagn,2017,21:0135)

肝纖維化是各種急慢性致病因素持續或反復刺激肝臟，使其纖維組織增生、細胞外基質過度沉積的病理過程[1]。若致病因素持續存在，肝纖維化程度逐漸加重，正常的肝小葉結構破壞，在匯管區出現纖維間隔以及假小葉的形成，進展成為肝硬化，還可繼續發展成為肝癌[2]。已有文獻報道，肝硬化5年后約有5%發展成肝癌，而10年后約有40%發展成肝癌[3]。因此，早期干預治療肝纖維化對預防肝硬化及肝癌的發生十分重要。自噬(Autophagy)是細胞在缺氧、饑餓、高溫等應激狀態時，通過上調自噬水平，降解細胞中多余的成分從而維持細胞的能量代謝。這是真核細胞特有的一種相對保守的分解代謝過程，還能降解細胞內錯誤折疊的蛋白，保護細胞不受病原微生物的破壞，因此自噬在維持細胞穩態中發揮很重要的作用[4]。而自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬三種類型，通常所研究的主要是巨自噬，負責降解細胞內穩定存在并永久存在的蛋白質并產生氨基酸用以維持細胞在缺乏營養時的生存[5]。因此，為了治療肝纖維化，應首先闡明其發生發展機制，而近些年的研究表明自噬在肝臟疾病中發揮重要的作用，如非酒精性脂肪性肝病[6]、病毒性肝炎[7,8]、肝癌[9]以及肝纖維化等。為了進一步闡明自噬在肝纖維化發生發展中的作用，本研究檢測了膽管結扎誘導的肝纖維化小鼠模型中蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和細胞自噬標志性蛋白-微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein Ιlight chain,LC3)的表達水平變化，探討其之間的關系和意義，從而為深入研究肝纖維化的發病機制及干預治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1)動物：C57BL/6小鼠(動物許可證號：SCXK20120001)，雄性，體重18-22g，SPF級，6-8周齡，標準化動物房飼養，于首都醫科大學實驗動物部購置。

2)主要試劑：Masson試劑盒(南京建成生物工程研究所)；即用型免疫組化試劑盒(邁新試劑)；轉染試劑Lipo2000(Invitrogen)；BCA 試劑盒(Thermo)；ECL 超敏發光液(Bio-Rad)兔抗PKCα、p-PKCα多克隆抗體(Cell Signaling)；鼠抗α-SMA單克隆抗體和兔抗 LC3 多克隆抗體(Sigma)；羊抗兔IgG-HRP,羊抗鼠IgG-HRP(Cell Signaling)；PKCα siRNA和Negative Control由北京歐林格生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1) 細胞培養及PKCα siRNA轉染：在37℃,5% CO2的條件下用低糖培養基中加入20% FBS培養人肝細胞系L02細胞(ATCC)。將L02細胞經胰酶消化接種于六孔板中，然后采用Lipo2000介導的方法將PKCα siRNA轉染細胞，最后收集細胞，提取蛋白用于Western Blot檢測。

2) 動物模型制作：20只C57BL/6小鼠(北京維通利華實驗動物有限公司)，雄性，20只小鼠隨機分為假手術組和膽管結扎模型組，每組各10只。模型組采用腹腔注射4%水合氯醛200ul將其麻醉，仰臥位固定于手術臺，沿腹中線打開腹腔，沿十二指腸起始端找到膽總管并將其分離結扎，縫合關腹；假手術組：麻醉后打開腹腔，游離膽總管，縫合關腹[10]。術后正常飲食喂養。手術4周后處死小鼠，取肝組織用于免疫組織化學染色和Western Blot檢測。

3) 肝臟病理學檢測：肝組織用10%福爾馬林固定，常規脫水、透明、浸蠟包埋制作石蠟切片后進行HE染色和Masson染色，并于光鏡下觀察其病理變化。

4) 肝臟LC3免疫組織化學染色：石蠟切片常規脫蠟、入水，微波修復3 min后，晾至室溫后用試劑盒中的3%H2O2甲醇封閉其過氧化物酶，正常羊血清封閉30 min后，滴加稀釋后的一抗LC3(1∶200)，其中對照用PBS代替一抗，4℃過夜后，滴加二抗以及ABC復合物后用DAB顯色，蘇木精復染核，脫水透明后樹膠封片。顯微鏡下觀察并照相。

5) Western Blot檢測PKCα、p-PKCα以及LC3的表達：提取肝組織總蛋白，并用BCA試劑盒測定其濃度。取5μg總蛋白進行12%SDS-PAGE電泳，然后轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1h后分別加入α-SMA、PKCα、p-PKCα以及LC3抗體(均為1:2000稀釋)，4℃孵育過夜，次日用TBST洗3次，然后分別加入二抗(1:3000稀釋)，室溫下孵育1h,TBST洗3次，采用Fusion Fx7曝光機器(法國Vilber Lourmat公司)掃膜并采集圖像，并用Image-J軟件分析其灰度值。

6) 統計學分析：實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠肝臟病理學比較

HE染色顯示假手術組的小鼠肝臟表面光滑，邊緣整齊，未見纖維增生、肝細胞變性、炎性反應，肝小葉和匯管區的形態結構完整(圖1A)，而模型組可見肝細胞排列紊亂，有炎性細胞浸潤，肝細胞散在變性、壞死，小葉周邊出現小膽管樣上皮細胞并增生(圖1B)。Masson染色顯示假手術組沒有或僅有少量纖維組織(圖1C)，而模型組中則纖維增生明顯(圖1D)。

2.2 小鼠肝組織中α-SMA、PKCα、p-PKCα以LC3的表達情況

Western blot 結果顯示：模型組α-SMA的表達增加(P<0.05)，表明膽管結扎誘導的肝纖維化模型制作成功。在纖維化模型組中發現PKCα、p-PKCα的表達量均較假手術組高(P<0.01)，而LC3的表達則顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 兩組小鼠LC3免疫組織化學染色結果比較

膽管結扎手術4周后，分別取兩組的肝組織進行染色。免疫組織化學染色顯示模型組中LC3蛋白的陽性面積明顯少于假手術組，見圖3。

A,HE staining of sham-operated group;B,HE staining of model group;C,Masson staining of sham-operated group;D,Masson staining of mode group (HE，×100；MASSON，×100)

圖1 肝組織病理學檢查

圖2 免疫印跡檢測兩組小鼠肝組織中α-SMA、PKCα、p-PKCα以LC3蛋白的表達

A：sham-operated group；B:model group(×100)

圖3 LC3 蛋白在小鼠肝組織中的免疫組織化學染色

2.4 肝細胞中轉染PKCα siRNA后，LC3蛋白的表達情況

以上結果顯示(圖2和圖3)，PKCα和P-PKCα在纖維化模型組表達增加，而LC3則表達減少，提示PKC信號通路的激活可能抑制自噬。因此，在體外培養的L02細胞內，利用siRNA將PKCα敲降之后(P<0.01)，發現LC3的表達明顯上調(P<0.01)。見圖4。

圖4 免疫印跡檢測L02細胞轉染PKCα siRNA后，PKCα和LC3蛋白的表達情況(A)及其灰度值分析統計圖(B)。*P<0.01

3 討論

肝纖維化是一個復雜的病理過程，其中包含多個細胞因子和信號通路共同參與其發生發展過程[11]。研究的較為清楚的主要有TGFβ-Smad[12]、MAPK、PI3K[13]及PKC信號通路。其中PKC是一種磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于細胞質內，是細胞內傳遞信號的重要介質。根據其激活方式的不同，主要分為三大類：經典型PKC、新型PKC、非典型PKC[14]。而已有研究證明經典型PKC中的PKCα在促進肝纖維化發生發展過程中發揮重要的作用[15]。

在生理情況下自噬主要維持細胞功能的穩定，細胞自噬是個程序化的動態過程，首先形成雙層膜的囊泡結構，將要消化的物質包裹起來后，溶酶體與其外層膜融合成為自噬溶酶體。在自噬體形成過程中，構成囊泡膜結構的蛋白-微管相關蛋白1輕鏈3會不斷地由Ι型轉化為Ⅱ型，因此LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比例是反映自噬流量的重要指標[16]。

肝纖維化過程中，肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)的激活居于主要地位，同時膠原蛋白合成增加降解減少造成ECM的積累增加，使得部分肝細胞缺氧、供給不足。因此可以通過提高HSC細胞的自噬水平，減少纖維蛋白原的產生，從而保護肝細胞減少其損傷[17]。有研究證明自噬自噬增強劑Carbamazepine(CBZ)通過促進α1-抗胰蛋白酶Z(α1 Antitrypsin Z,ATZ)的降解，從而緩解肝纖維化[18]。并且造血因子IL-3、TGFβ激酶1(TAK1)能抑制自噬，而在我們的研究中發現發現PKCα信號通路的激活可能抑制自噬的發生。既往研究表明PKC的激活使LC3 Thr6和Thr29位點的磷酸化，同時LC3Ⅰ向LC3Ⅱ蛋白的轉化減少，使得自噬小體形成減少，從而抑制自噬[19]。而PKCα信號通路如何調控自噬的機制尚不明確，仍需進一步研究，以便為肝纖維化的進一步治療提供理論依據。

[1]舒泳翔，譚詩云，吳鵬波.非酒精性脂肪肝病自噬機制的研究進展[J].醫學研究雜志，2016，1：4.

[2]白啟軒，賈繼東.肝纖維化發生機制及治療進展[J].中國醫學前沿雜志(電子版)，2008，2：15.

[3]Friedman SL.Molecular regulation of hepatic fibrosis,an integrated cellular response to tissue injury[J].J Biol Chem,2000,275(4):2247.

[4]涂芊茜.自噬在脂肪酸誘導肝損傷中的作用及機制的初步研究[D].第二軍醫大學，2011.

[5]舒泳翔，譚詩云，吳鵬波.非酒精性脂肪肝病自噬機制的研究進展[J].醫學研究雜志，2016，1： 4.

[6]Singh R,Kaushik S,Wang Y,et al.Autophagy regulates lipid metabolism[J].Nature,2009,458(7242):1131.

[7]Sir D,Tian Y,Chen WL,et al.The early autophagic pathway is activated by hepatitis B virus and required for viral DNA replication[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(9):4383.

[8]Dreux M,Gastaminza P,Wieland S F,et al.The autophagy machinery is required to initiate hepatitis C virus replication[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(33):14046.

[9]Mizushima N,Levine B,Cuervo AM,et al.Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J].Nature,2008,451(7182):1069.

[10]Kanda T,Ishibashi O,Kawahigashi Y,et al.Identification of obstructive jaundice-related microRNAs in mouse liver[J].Hepatogastroenterology,2010,57(102-103):1013.

[11]吳曉玲，曾維政，蔣明德，等.肝纖維化的信號轉導通路[J].世界華人消化雜志，2006(22)：2223.

[12]Li J,Li X,Xu W,et al.Antifibrotic effects of luteolin on hepatic stellate cells and liver fibrosis by targeting AKT/mTOR/p70S6K and TGFbeta/Smad signalling pathways[J].Liver Int,2015,35(4):1222.

[13]Shu M,Huang DD,Hung ZA,et al.Inhibition of MAPK and NF-kappaB signaling pathways alleviate carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver fibrosis in Toll-like receptor 5 (TLR5) deficiency mice[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,471(1):233.

[14]李 禮，李 靜，耿美玉.蛋白激酶C在腫瘤中的作用及其抑制劑研究進展[J].中國藥理學通報，2009(06)： 708.

[15]Takekoshi S,Kitatani K,Yamamoto Y.Roles of Oxidized Diacylglycerol for Carbon Tetrachloride-induced Liver Injury and Fibrosis in Mouse[J].Acta Histochem Cytochem,2014,47(5):185.

[16]Levine B,Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease[J].Cell,2008,132(1):27.

[17]翟孟賀，周 雄，李杰克，等.細胞自噬對肝纖維化的影響[J].肝膽胰外科雜志，2015(05)： 434.

[18]Hidvegi T,Ewing M,Hale P,et al.An autophagy-enhancing drug promotes degradation of mutant alpha1-antitrypsin Z and reduces hepatic fibrosis[J].Science,2010,329(5988):229.

[19]Jiang H,Cheng D,Liu W,et al.Protein kinase C inhibits autophagy and phosphorylates LC3[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,395(4):471.

The role of PKC-mediated autophagy in liver fibrosis

YINRui-li,SHIJia-hong,ZHOUDe-shan*.

(DepartmentofHistologyandEmbryology,CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China)

Objective To explore the change and importance of PKC-mediated autophagy in mice liver fibrosis tissue.Methods The C57BL/6 mice were randomly divided into two groups:the bile duct ligation model and sham-operated groups.Mice in the model group were treated with bile duct ligation for induced liver fibrosis.After 4 weeks of operation,the degree of hepatic fibrosis was evaluated by HE and Masson staining,firstly.Subsequently,the expression of LC3 in liver tissues was detected by immunohistochemistry assay,and expressions of α-SMA,PKCα,p-PKCα and LC3 in liver tissues were also determined by Western Blot.Finally,the expression of LC3 was detected in L02 cells transfected with PKCα siRNA and the relationship between PKCα and LC3 was assessed.Results More fibrotic liver tissues were found in model group according to HE and Masson staining.As a result,the expression of α-SMA,PKCα and p-PKCα were significantly increased (P<0.01),while that of LC3 was decreased (P<0.01) in liver tissues from model group as compared with those from the sham-operated group by Western Blot and Immunohistochemistry assay.After transfection of PKCα siRNA in L02 cells,the level of LC3 was upregulated (P<0.01).Conclusion The inhibition of autophage by PKCα pathway may contribute to the occurrence and development of liver fibrosis.

Bile duct ligation-induced liver fibrosis;PKCα;LC3;autophagy

1007-4287(2017)01-0135-05

R575.2

A

2016-03-16)

*通訊作者