肺癌腫瘤標志物神經元特異性烯醇化酶抗原適配子的篩選及其應用

趙運旺，朱家寧

西北師范大學化學化工學院，甘肅蘭州730070

技術方法

肺癌腫瘤標志物神經元特異性烯醇化酶抗原適配子的篩選及其應用

趙運旺，朱家寧

西北師范大學化學化工學院，甘肅蘭州730070

目的提出一種基于適配子快速檢測肺癌腫瘤標志物的方法。方法利用指數級富集配體的系統進化技術篩選其高特異性適配子，通過流式細胞術檢測親和力，最終選出一條高親和力、強特異性的適配子。枸櫞酸鈉還原法制備納米金顆粒。建立基于免標記納米金和適配子的分析方法，并對其方法進行考察。結果通過6輪篩選得到三條NSE的高特異性、強親和力的適配子，其中，a適配子特異性最高。同時利用篩選得到的肺癌腫瘤標志物a適配子和納米金顆粒建立一種快速檢測NSE抗原的方法。結論該方法具有較好的準確度，為肺癌的早期檢測提供了一種新的手段。

神經元特異性烯醇化酶抗原；適配子；納米金；肺癌；腫瘤標志物

肺癌是目前世界范圍內致死率最高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的生命健康。大部分患者就診時已經是肺癌中晚期，從而導致失去了最佳的治療時機。肺癌患者的5年生存率極低，僅有5％～10％［1］。因此，早期診斷對提高肺癌病人生存率尤為關鍵。目前臨床上采用肺癌血清腫瘤標志物聯合檢測的診斷手段，提高了肺癌診斷的準確性、靈敏度［2］。目前，常見的肺癌血清腫瘤標志物有：神經元特異性烯醇化酶（NSE）、癌胚抗原、細胞角蛋白19片段等［3］。其中NSE已經證明可以作為肺癌早期檢測的判斷指標。

適配子是一種具有高親和力、強特異性的識別靶標的單鏈DNA或RNA［4］，與蛋白質結合的適配子因其單鏈核酸的堿基序列多樣性及結構多樣性，可通過形成發卡、莖環、G-四鏈體等二級/三級結構與蛋白質靶標的空間結構匹配，形成與靶分子高親和力和強特異性結合。其具有優于傳統抗體的諸多優點，例如：作用的靶分子范圍廣泛，無免疫原性，穩定性好，易于修飾等，因而可以代替抗體應用于臨床檢測和治療［5-7］。因此選用NSE抗原作為靶標分子，主要依賴于傳統的SELEX技術，本實驗采取的消減SELEX技術是一種改良后的SELEX技術，主要原理為SELEX篩選時去除與非特異性靶標分子結合的寡核苷酸序列，然后將消減后的寡核苷酸序列與目標靶分子結合進行正篩。篩選得到高特異性、強親和力的NSE抗原適配子，利用該適配子和納米金顆粒建立了一種快速檢測肺癌腫瘤標志物NSE抗原的方法。為肺癌的早期診斷提供一種新的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

ssDNA文庫：5'-GCAATGGTACGGTACTTCCN30-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'，上游引物：5'-GCAATGGTACGGTACTTCC-3'，下游引物：5'-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'，帶生物素的下游引物：Bio-5'-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'，ssDNA文庫和引物由英駿生物技術有限公司合成。

試劑：NSE抗原（2 mg/mL），NSE抗體（2 mg/mL）購自Sigma，磁珠、鏈霉親和素磁珠購自Promega，實時定量PCR試劑盒購自TOYOBO，PBS購自上海生工。其他試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 NSE抗原適配子的篩選

1.2.1 NSE抗原與磁珠結合將1×106磁珠，加入0.1 mol/L碳二亞胺EDC，0.1 mol/L N-N-羥基琥珀酰亞胺NHS各1 mL，室溫下活化30 min。PBS洗3遍，將活化好的磁珠平均分成兩份，分別標記為“+”、“-”，將1 μL NSE抗原與標記有“+”的磁珠混合，37℃震蕩2 h，PBS洗3遍，4℃保存備用。1 μL NSE抗體與標記有“-”的磁珠混合，與NSE抗原方法一致。

1.2.2 NSE抗原適配子篩選取100 pmol的ssDNA文庫，用PBS稀釋到1 mL，充分混勻，95℃、10 min及4℃、10 min。將預處理好的ssDNA文庫與NSE抗體-磁珠復合物孵育，37℃震蕩1 h，分離磁珠，回收上清，將上清與NSE抗原-磁珠復合物孵育，37℃震蕩1 h。PBS洗磁珠，加入200 μL純水，95℃加熱5 min，回收上清。1.2.3 RT-PCR擴增富集取180 μL RT-PCR反應體系各加入1 μL上游引物和帶生物素的下游引物，加入18 μL ssDNA模板10 μL，充分混勻，20 μL∕管分裝，進行RT-PCR擴增，擴增到S型曲線最高點停止擴增。

1.2.4 ssDNA次級庫的制備將RT-PCR擴增產物與偶聯鏈霉親和素磁珠，37℃，孵育45 min，在堿性條件下變性得到ssDNA，用于下一步的篩選。

1.2.5 RT-PCR實時檢測篩選進程將每輪篩選得到的次級ssDNA文庫與NSE抗原-磁珠復合物，37℃孵育30 min，PBS洗滌3遍，RT-PCR檢測特異性NSE抗原ss-DNA富集的變化。

1.2.6 克隆與測序將第6輪富集的ssDNA次級文庫用不帶生物素的引物擴增成dsDNA。將1 μL PCR擴增產物與1 μL T載體混勻，37℃反應5 min。將連接后的產物與50 μL Trans-T感受態細胞充分混勻，冰浴30 min。42℃熱激30 s，立即置于冰上2 min。取200 μL菌液涂板，培養12 h。挑取邊緣光滑的白色單克隆至0.5 mL含氨芐和卡納霉素的培養基中，過夜培養。挑選陽性克隆團，送公司測序。

1.2.7 NSE抗原適配子的親和力檢測10 μL NSE抗原包被微孔板，4℃過夜。將標記有FITC的適配子a、b、c稀釋為不同的濃度，分別加入到NSE抗原包被的96孔板中，37℃，孵育1 h。洗去不能結合NSE抗原的非特異性ssDNA，熒光儀測測定其熒光值，激發波長460 nm，發射波長520 nm［8］。同時每組設置平行實驗。與NSE抗原結合的特異性的ssDNA的量可以通過測定熒光值的大小，同時參考其標準曲線來獲得，根據計算得到的NSE抗原ssDNA的量進行非線性回歸，分析得到NSE抗原適配子的解離常數（Kd）值。

1.2.8 適配子與肺癌血清特異性結合檢測取1×106磁珠，平均分成兩份，分別標記為“+”“-”，200 μL肺癌血清與標記有“+”的磁珠混合，200 μL正常人血清與標記有“-”的磁珠混合，37℃震蕩1 h，PBS洗3遍，在“+”、“-”中分別加入FITC標記的a適配子100 μL，室溫振蕩30 min，PBS洗3遍。用流式細胞術分析磁珠表面的熒光強度。

1.2.9 NSE抗原適配子二級結構的分析模擬使用DNAMAN軟件，分析模擬NSE抗原適配子的二級結構。

1.3 快速檢測肺癌腫瘤標志物NSE納米金-適配子檢測體系的建立

納米金顆粒是用氯金酸的檸檬酸還原法制得［9］。將NSE抗原適配子用PBS稀釋成0.1 mmol∕L，向酶標板中各加入50 μL的適配子溶液，然后加入不同濃度的NSE抗原，37℃孵育30 min，加入50 μL的納米金顆粒溶液，37℃，孵育30 min，再加入50 mmol/L的NaCl溶液混勻，進行光譜分析，繪制得到對應的納米金-適配子檢測體系的標準曲線。取濃度為1600、200、12.5 nmol/L的溶液用上述方法分別測定，一次實驗中每個濃度分別設置3份重復，并設置不含NSE抗原的空白對照。按照上述方法分別檢測A700和A520，計算出A700/A520的數值，最后以A700/A520的均值與3倍標準差的和代入相應的標準曲線計算出濃度，即可得到檢出限［10-12］。

2 結果

2.1 篩選富集過程

經過6輪SELEX篩選富集后（圖1），通過RT-PCR檢測，在第4輪時，檢測到與NSE抗原-磁珠復合物結合的ssDNA明顯地比與NSE抗體-磁珠復合物結合的ssDNA多，說明與NSE抗原結合的適配子已經富集，直到第6輪篩選，適配體富集已經達到飽和。

圖1 SELEX技術篩選流程

2.2 NSE抗原適配子測序結果

第6輪篩選得到的ssDNA文庫，經純化、連接、轉化到Trans-T感受態細胞中，培養獲得單克隆菌落。經測序獲得3條適配子序列（表1）。

表1 適配子測序序列

圖4 流式細胞術檢測a適配子與肺癌血清、正常人血清的結合

2.3 適配子與NSE抗原結合的特異性考察

對a、b、c三個適配子進行親和力檢測，結果如圖2所示，在一定的范圍內，測定的熒光值與三條適配子的濃度呈正比關系，這也說明篩選得到的3條NSE抗原適配子都與NSE抗原具有較高的親和力。經過計算，3條適配子的Kd值都達到了納摩爾級，適配子a與NSE抗原的親和力最強。

圖2 適配子親和力檢測結果

2.4 適配子二級結構預測

根據DNAman軟件分析模擬適配子的二級結構可知，篩選得到的這3條適配子的二級結構為莖環和口袋結構，環主要為凸環和圓環（圖3）。適配子的特異性二級結構決定了其與NSE抗原結合的方式。

圖3 適配子二級結構預測

2.5 NSE抗原適配子與肺癌血清結合的特異性考察

NSE抗原適配子與肺癌血清結合的特異性考察結果顯示，a適配子與正常人血清結合明顯弱于與肺癌血清的結合（圖4）。

2.6 納米金顆粒-適配子檢測體系的建立

當適配子的濃度在12.5～600 nmol/L時，適配子濃度的對數與A700/A520呈負相關，線性方程是y=－0.542x+1.899，R2=0.9896，其中y表示A700/A520，x表示濃度的對數（圖5）。

圖5 適配子濃度對數與吸光值之間的關系

3 討論

適配子是一類大小為70～80 bp左右的寡核苷酸分子，可以與靶標分子高親和力、強特異性地結合，在一定的情況下，還可能發揮某些生物學效應。因為適配子具有靶分子范圍廣、相對分子質量小、無免疫原性、易于人工合成、修飾和標記等優點，適配子在臨床診斷、基礎研究，甚至在疾病治療領域中都顯現其重要的應用價值。因此適配子能夠成為最具前景的抗體替代品。ssDNA文庫可以形成發夾、假結、凸環和G-四分體等空間結構，然后與靶分子穩定地結合，通過篩選和富集，最終獲得高親和力、高特異性的寡核苷酸序列。1990年Tuerk等［13］最早通過經典SELEX技術篩選到噬菌體T4 DNA聚合酶的RNA適配子。Fang等［14］利用合成的DNA適配子與熒光淬滅方法可以高通量地檢測和區分體液中不同種類的蛋白質。NSE抗原是肺癌腫瘤標志物之一，而本研究則利用消減SELEX技術，以磁珠為篩選介質，通過6輪快速篩選得到適配子，并利用該適配子和納米金顆粒建立了一種快速檢測肺癌腫瘤標志物的方法。該實驗過程耗時不足40 min，同時免去ELISA中的反復洗板過程，成為本研究最大亮點。

消減SELEX篩選是個循序漸進的過程，每輪篩選效率的高低決定了篩選輪數的多少。本研究在前幾輪的篩選中，投入較高量的NSE抗原與ssDNA文庫孵育，使ssDNA文庫中能與NSE抗原特異性結合的ssDNA盡可能多的保留。在后續的篩選中，當特異性結合的ssDNA通過RT-PCR擴增得到富集，隨著篩選輪數的增加，逐漸減少NSE抗原的投入量，從而增加ssDNA與NSE抗原之間結合的競爭力，從而提高了篩選效率，使特異性結合的ssDNA快速富集。同時為了提高篩選的特異性，增加了反篩。通過RT-PCR檢測篩選進程，發現第4輪適配子已經開始富集，經過6輪篩選，適配體富集已經達到飽和。

利用DNAMAN軟件分析模擬適配子的二級結構顯示，篩選得到的適配子結構主要以莖環口袋為主，這可能是NSE抗原與適配子結合的結構基礎。通過測定每個適配子的親和0力，結果顯示a適配子與NSE抗原的親和力最高，大口袋小莖環結構的適配子與NSE抗原的結合最緊密。

由于納米金顆粒具有獨特的生物化學性質和生物相容性，當適配子結合到納米金的表面，使其表面帶有高密度的負電荷，這樣即使在高濃度的鹽溶液中納米金顆粒仍然是保持分散狀態[15-17]。當待測血樣中有NSE抗原時，適配子-NSE抗原復合物形成，適配子折疊形成穩定的高級結構。這樣在一定濃度的鹽溶液中，納米金聚集，溶液顏色由紅色變為藍色。利用這一反應原理，本研究設計出一種能夠快速檢測肺癌腫瘤標志物NSE的方法，并得到了適配子濃度對數與吸光值之間的關系。為肺癌的早期檢測提供了一種新的分子生物學方法。同時也有利于進一步研究各適配體與肺癌腫瘤標志物NSE的親和力和結合位點。

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An aptamer-based analytical method for rapid detection of lung cancer tumor markers NSE antigen

ZHAO Yunwang,ZHU Jianing
College of Chemistry and Chemical Engineering,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China

Objective To explore a new aptamer-based rapid detection method for lung cancer tumor markers.Methods Highly specific adaptive were screened by using systematic evolution of ligands(SELEX)and affinity were detected by flow cytometry. So as to choose a high affinity and high specificity of aptamer.Gold nanoparticles were prepared through sodium citrate reduction.The method based on label-free analysis of gold nanoparticles and aptamers were established,with methodological investigation.Results High specificity and strong affinity of 3 NSE were obtained through 6 rounds of screening,with highest specificity of a.A rapid method for the detection of NSE antigen were established through the selection of tumor markers of lung cancer and gold nanoparticles.Conclusion The method has a good accuracy for the early detection of lung cancer provides a new means.

NSE antigen;aptamers;nanometer gold;lung cancer;tumor markers

2016-09-13

國家自然科學基金（81360333）

趙運旺，碩士，E-mail:1021357025@qq.com