兩種擴增儀對聯合毛細管電泳技術的聚合酶鏈式反應的影響

吳小芳，陸建林

順德職業技術學院，廣東佛山528000

兩種擴增儀對聯合毛細管電泳技術的聚合酶鏈式反應的影響

吳小芳，陸建林

順德職業技術學院，廣東佛山528000

目的使用兩種擴增儀進行常規擴增和毛細管電泳，觀察兩種擴增儀對結果的影響以及有何不同。方法運用PowerPlex試劑盒對DNA在Applied Biosystems 9700和Hema 9700兩種擴增儀上進行擴增，擴增包括對血卡進行直接擴增和對提取后的DNA進行擴增，然后在Applied Biosystems 3130XL上進行毛細管電泳檢測；使用同一DNA進行5次重復試驗進行擴增儀的穩定性檢測；使用7種非人樣本DNA進行種屬特異性檢測；運用不同稀釋度的2800陽性標準品進行靈敏度檢測；對使用兩種擴增儀擴增檢測后的所有結果進行分析、討論和評價。結果使用兩種擴增儀進行擴增檢測后，其分型結果在兩種擴增儀之間沒有明顯差別，其分型結果均穩定準確且在兩種擴增儀上呈現一致性，種屬特異性檢測結果一致，靈敏度檢測結果一致。結論兩種擴增儀在進行常規擴增檢測時，其結果在兩種擴增儀之間沒有明顯差別，其結果呈現出一致性，兩種擴增儀均可應用于常規擴增。

擴增儀；聚合酶鏈式反應；毛細管電泳；分型

聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，聚合酶連反應（PCR）技術可看作是生物體外的特殊DNA復制，能將微量的DNA大幅增加［1］。目前，常規檢測步驟包括DNA提取、定量、復合STR擴增、電泳檢測等已經成為廣大實驗室的常規實驗，使用PCR擴增儀進行復合STR擴增則是其中至關重要的一步［2］，而PCR儀器的發展中PCR溫度循環至關重要，PCR擴增儀各參數必須準確無誤，DNA聚合酶以及快速升/降溫速率的PCR擴增儀［3］的出現，使快速PCR技術在各科研實驗中實現大規模應用成為可能。國內許多研究文獻均局限于舊式的PCR擴增儀，隨著科技的發展，新型的PCR擴增儀層出不窮，國內外多家公司均有推出不同類型的PCR擴增儀，而國內外不同擴增儀之間結果有何不同的相關研究卻很局限，所以本文針對在國內外具有代表性的Applied Biosystems公司的9700 PCR擴增儀和黑馬公司的Hema 9700PCR擴增儀進行擴增檢測，通過血卡直接擴增［4-6］和DNA擴增，對兩種擴增儀的檢測結果進行比對來評估不同擴增儀對最終分型結果的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本

志愿者靜脈血卡60份，類人猿、猴、羊、豬、兔、鼠、狗的DNA各2份[7-8]，樣本DNA50份。

1.2 主要試劑和儀器

PowerPlex?21試劑盒［9］（Promega，美國），ABI 9700擴增儀（Applied Biosystems，美國），Hema 9700擴增儀（珠海黑馬醫學儀器有限公司，中國）ABI 3130XL遺傳分析儀（Applied Biosystems，美國）。

1.3 方法

1.3.1 DNA擴增PowerPlex?21擴增體系：Master Mix 5μL，Primer Mix 5μL，滅菌水13μL，模板DNA2μL。擴增程序：96℃1 min，94℃10 s，59℃1 min，72℃30 s，30個循環；60℃延伸10 min；25℃保

存［10］。

1.3.2 直接擴增PowerPlex?21擴增體系：Master Mix 5μL，Primer Mix 5μL，滅菌水15μL，0.5 mm血卡。擴增程序：72℃20 min，96℃1 min，94℃10 s，59℃1 min，72℃30 s，30個循環；60℃延伸10 min；25℃保存［10］。

1.3.3 穩定性擴增同一份DNA（編號D7）參照DNA擴增的擴增體系和擴增程序重復擴增5次，同1份血卡（編號F3）參照直接擴增的擴增體系和擴增程序重復直接擴增5次［11］。

1.3.4 種屬特異性擴增使用類人猿、猴、羊、豬、兔、鼠、狗的DNA參照DNA擴增的擴增體系和擴增程序進行擴增。

1.3.5 靈敏度擴增使用濃度分別為1、0.75、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032 ng/μL［12］的2800樣本參照DNA擴增的擴增體系和擴增程序進行擴增。

1.3.6 電泳檢測擴增后使用ABI 3130XL型分析儀進行檢測，電泳檢測時，PowerPlex?21試劑盒上樣混合物為10μL甲酰胺和2μL ILS500混勻為12μL，加入1 μL擴增產物或ladder，具體操作參照PowerPlex?21試劑盒使用說明。

1.3.7 數據分析所得DNA檢測圖譜獲得13個基因座以上正確分型且各等位基因峰高高于50RFUs為有效分型[13-14]，重復試驗結果按照同一基因座出現該峰2次以上的統計學原則進行統計分析［15］。

2 實驗結果

2.1 DNA擴增

對50份樣本DNA使用PowerPlex?21的標準擴增體系和擴增程序進行擴增，然后使用3130XL測序儀進行檢測，共獲得1534個STR等位基因，所有DNA在兩臺擴增儀擴增后均獲得良好分型結果，準確性均為100％，同一份樣品擴增檢測后，其峰高和峰面積在兩臺擴增儀間無明顯差異（圖1）。

2.2 直接擴增

對60份志愿者靜脈血卡使用PowerPlex?21的標準擴增體系和擴增程序進行直接擴增，然后使用3130XL測序儀進行檢測，共獲得1875個STR等位基因，所有血卡在兩臺擴增儀擴增后均獲得良好均衡的分型結果，準確性均為100％，同一份樣品擴增檢測后，其峰高和峰面積在兩臺擴增儀間無明顯差異（圖2）。

2.3 穩定性檢測

使用PowerPlex?21的標準擴增體系和擴增程序對同一份DNA（編號D7）重復擴增5次，然后使用3130XL測序儀進行檢測，其峰高峰面積在兩臺擴增儀間無明顯差異；使用PowerPlex?21的標準擴增體系和擴增程序對同一份血卡（編號F3）重復直接擴增5次，然后使用3130XL測序儀進行檢測，其峰高峰面積在兩臺擴增儀間無明顯差異。

2.4 種屬特異性檢測

使用PowerPlex?21的標準擴增體系和擴增程序對類人猿、猴、羊、豬、兔、鼠、狗7種非人DNA樣本進行擴增，然后使用3130XL測序儀進行檢測，檢測結果顯示，在ABI 9700擴增儀擴增后，類人猿檢測出9個片段，其中2個片段在等位基因bin上。猴和豬分別均檢測出1個等位基因片段，均不在等位基因bin上。羊、鼠、兔和狗的樣本均未檢測出特異性分型；在Hema 9700擴增儀擴增后，類人猿檢測出11個片段，其中3個片段在等位基因bin上。羊、猴和豬分別均檢測出1、2和1個等位基因片段，均不在等位基因bin上。鼠、兔和狗的樣本均未檢測出特異性分型。

2.5 靈敏度檢測

使用PowerPlex?21的標準擴增體系和擴增程序對1、0.75、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032 ng/μL的2800陽性標準品進行擴增，然后使用3130XL測序儀進行檢測，ABI 9700擴增儀和Hema擴增儀擴增后檢測結果均顯示樣品濃度達到或超過0.063 ng/μL時可以獲得完整分型結果且各等位基因峰高高于50RFUs，0.063 ng/μL的2800陽性標準品檢測結果顯示，在D3S1358位點出現非特異擴增，在D2S1338位點、D19S433位點和Penta D位點出現等位基因丟失現象，0.032 ng/μL的2800陽性標準品檢測結果顯示，在D3S1358位點出現非特異擴增，在D2S1338位點、D19S433位點、Penta D位點、Penta E位點、D8S1179位點和TPOX位點出現等位基因丟失現象，且相同濃度的陽性標準品2800擴增檢測后，其峰高在兩臺擴增儀間無明顯差異（圖3）。

3 討論

本實驗通過使用PowerPlex?21試劑盒在Applied Biosystems 9700和Hema 9700兩種擴增儀上進行擴增，通過DNA擴增、血卡直接擴增、穩定性檢測、種屬特異性檢測和靈敏度檢測等發現兩臺擴增儀在擴增效力上沒有明顯差異，其峰高和峰面積呈現極大的一致性。

ABI 9700擴增儀外觀為藍色液晶大屏幕顯示屏，PCR編程及運行過程簡便直觀，升降溫速率為3.5℃/s，一個主機可配多種不同類型的樣品基座，調換方便簡單，檢出率高，適用于常規擴增，與3130XL等常規測序儀相適用，并且攜帶自動斷電保護，恢復供電后自動執行未完成程序。Hema9700擴增儀外觀為高清晰超大5.7寸彩色大屏幕中文LCD，用戶界面的擴增過程相關參數和圖表顯示更直觀，編程簡單快捷，升溫速率≥4.0℃/S，降溫速率≥3.5℃/S，標準模塊是：（96×0.2+77×0.5）mL混合模塊；可另選384well模塊；模塊更換方便、快捷，檢出率高，適用于常規擴增，與3130XL等常規測序儀相適用，具有斷電記憶功能和時間遞增/遞減功能，適合長鏈基因（450 nm以上）的擴增，具有溫度遞增/遞減功能，適合科研需求，從我們常規使用來看，Hema 9700擴增儀更具備經濟實用的特點，界面為中文操作，更符合實驗員語言需求，屏幕較大，觀察也更為便捷等。

圖1 兩臺擴增儀上DNAPowerPlex?21擴增分型結果

從DNA擴增結果和血卡直接擴增結果來看，ABI 9700擴增后的檢測結果與Hema9700擴增后的檢測結果沒有明顯差異，檢測的圖譜中均沒有位點丟失現象，其峰高在不同位點呈現一致性。穩定性檢測結果顯示，ABI 9700擴增后的檢測結果與Hema 9700擴增后的檢測結果沒有明顯差異，其分型峰高在兩臺擴增儀和5次擴增中沒有明顯差異，在不同位點呈現一致性。

種屬特異性檢測結果顯示，兩臺擴增儀在擴增同樣的非人DNA樣本時，其分型結果呈現一致性，ABI 9700與Hema 9700擴增儀分別在類人猿DNA上檢測出9個和11個片段，在羊DNA上分別檢測出0和1個片段，在猴DNA上分別檢測出1和2個片段，在豬DNA上均檢測出1個片段，在鼠、兔和狗上均未檢出任何片段，二者在檢測到的片段上呈現一致性。靈敏度結果顯示，在同一個濃度的2800下，ABI 9700擴增后的檢測結果與Hema9700擴增后的檢測結果沒有明顯差異，在不同濃度的2800上，兩臺擴增儀的檢測結果呈現一致性，隨著2800的濃度降低，分型峰高也逐漸降低，在2800濃度為0.032 ng/μL時開始出現丟點現象，兩臺擴增儀在丟點的位點上呈現一致性。

圖2 兩臺擴增儀上血卡PowerPlex?21直接擴增分型結果

在馬洪濱等［16］關于兩種PCR擴增儀檢測結果的比較中，兩臺擴增儀擴增后其檢測結果沒有明顯差異，而在湯春園等［17］關于兩臺不同廠家的PCR擴增儀的研究報告中，也有指出，不同PCR擴增儀進行擴增后，其檢測結果并沒有明顯差異，在蔣明等［18］關于3種常見型號PCR擴增儀的研究報告中也指出，3臺擴增儀擴增后其結果統計無顯著統計學意義。這些既往研究結果與本文最終得出的研究結果是相一致的，使用國內外不同擴增儀進行擴增后檢測，其結果并未有明顯差異。結合外觀、性能、DNA擴增、血卡直接擴增、穩定性檢測、種屬特異性檢測和靈敏度檢測結果綜合考量，兩臺擴增儀擴增效果間無明顯差異，兩臺擴增儀均可適用于常規擴增，可廣泛應用于各實驗室和科研院所。這一研究結果有助于廣大實驗室在選購擴增儀時提供重要參考依據，本研究結果也有助于實驗人員在分析實驗結果時，排除使用了不同擴增儀的問題，也有助于實驗人員相互交流實驗儀器的使用情況等。

圖3 不同濃度的2800在ABI9700和Hema9700擴增儀上的擴增分型結果平均峰高圖

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Effect of the polymerase chain reaction combined capillary electrophoresis on two amplification instruments

WU Xiaofang,LU Jianlin
Medical Colledge,Shunde Polytechnic,Foshan 528000,China

Objective To observe the effects and differences between the two amplification instruments combined capillary electrophoresis.Methods DNA extracted were amplified with the optimized PCR method and cycling protocol using Powerplex 21 kit on the Applied Biosystems 9700 and HEMA 9700 instrument,including direct amplification and DNA amplification,and then genotyped using Applied Biosystems 3130xl.Same DNA test was repeated five times to test the stability of the instrument,seven kinds of non-human DNA samples were detected and 9947 was used as positive standard to test the sensitivity.Then genotyping results were validated and discussed.Results Genotyping results between the two instruments had no significant differences,genotyping results were stable and accurate and showed consistency in species-specific detection and sensitivity detection between the two amplification instruments.Conclusions There is no significant difference between the two amplification instruments of the routine amplification test and the results were consistent.The results showed that the two amplification instruments could be used in routine amplification.

amplification instrument;polymerase chain reaction;capillary electrophoresis;typing

2016-09-15

吳小芳，碩士，助教，E-mail:670313991@qq.com

陸建林，碩士，副教授，E-mail:184778962@qq.com