植物堿基錯配修復系統中Muts蛋白家族研究進展

豐安徽 王伍梅 李桂嬌 郭龍彪 張效忠* 崔永濤*

（1中國水稻研究所，杭州310006；2安徽農業科學院水稻研究所，合肥230000；3四川農業大學水稻研究所，成都611130；4廣西瑞特種子有限責任公司，南寧 530007；*通訊作者：cuiyongtao20@163.com）

植物堿基錯配修復系統中Muts蛋白家族研究進展

豐安徽1，3王伍梅2李桂嬌4郭龍彪1張效忠2*崔永濤1*

（1中國水稻研究所，杭州310006；2安徽農業科學院水稻研究所，合肥230000；3四川農業大學水稻研究所，成都611130；4廣西瑞特種子有限責任公司，南寧 530007；*通訊作者：cuiyongtao20@163.com）

DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）是DNA損傷修復的一個重要途徑，主要用于細胞中DNA合成和遺傳重組時發生損傷過程中出現的單個或少數堿基的缺失、插入以及錯配的修復，它對維持基因組穩定性和DNA復制保真度至關重要。原核生物和真核生物中都有非常保守的MMR系統。在人體DNA修復系統的研究中，發現癌癥的發生與Muts蛋白家族功能缺陷密切相關。類似的在擬南芥和水稻中功能缺陷的Muts蛋白家族（同源蛋白Muts homolog，MSH）會產生增變基因表型，這將為植物的基因功能分析和育種利用奠定基礎。基于此，本文綜述了近年來有關植物DNA錯配修復及相關基因功能的研究進展，特別是植物MMR功能缺陷導致基因突變和微衛星不穩定造成的性狀畸形進行了描述，對Muts蛋白家族各個亞基功能做了分類說明，并對植物中如何利用MSH產生的增變基因突變和如何利用突變育種研究進行了展望。

水稻；DNA錯配修復；Muts蛋白家族；同源重組；突變；穩定

生物基因組的穩定性受到外在和內在因素影響。外在因素包括病毒、X射線、紫外線和亞硝酸鹽等；而內在因素一般是由于生物體自身的復制不準確造成其基因組的不穩定，從而發生基因突變，如DNA復制和轉錄過程中產生的錯配。為保證遺傳穩定性，生物體必然要有一套修復功能來保證DNA復制過程的準確性，從而維持自身基因組的穩定[1]。變異是遺傳多樣性的基礎，雖然基因突變有時對生物進化有促進作用，但大多情況下對生物是有害的。所以在生命的進化史上，很多生物都進化出了維持自身基因組穩定的系統。這些系統包括：（1）直接修復（direct repair，DR）通路[1]；（2）堿基切除修復（base excision repair，BER）通路[2-4]，針對氧化還原或烷基化引起的堿基損傷；（3）核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）通路[4]，修復輻射、化學藥物或蛋白-DNA交聯引起的核苷酸水平的損傷，（4）堿基錯配修復（mismatch repair，MMR）通路[5-6]，糾正錯配堿基；（5）同源重組修復（homologous recombination repair，HR）[7]；（6） 非同源的末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）[8]。此外，最近也發現了內源 RNA 轉錄體能介導與酵母染色體DNA的重組。不同的修復系統的保真性和修復方式有所不同，例如同源重組修復的單鏈斷裂和非同源末端連接的雙鏈斷裂。堿基錯配修復MMR是針對單堿基錯配或者短核苷酸插入或缺失的，最先在原核生物中發現，隨后真核生物也相繼發現了MMR相關的同源基因。MMR系統的修復過程，主要包括以下幾個步驟：第一步是識別新生鏈中非m6AGATC，第二步是掃描新生鏈中錯配的堿基，緊接著就是酶切含錯配堿基的新生DNA區段，產生的空隙由DNA聚合酶和DNA連接酶共同作用，最終修復DNA[9]。

在已知的真核生物修復系統中，MMR蛋白都具有很高的保守性[10-13]。MMR修復系統是由一系列特異性修復DNA錯配堿基的酶分子組成，由于此系統的存在，細胞在DNA復制過程中才能保持忠實性，而遺傳信息的完整性主要依靠DNA復制的忠實性和幾種DNA修復進程的有效性，因此，MMR修復系統在維持遺傳物質的完整性和保守性方面起到重要作用。MMR基因的失活會導致自身突變率增加，從而造成基因的突變和微衛星的不穩定[14]。MMR不僅在DNA修復和維持基因組穩定中起到重要作用，同時也在抑制兩條非同源性DNA雙鏈重組方面起到重要作用[15]。在原核生物中，已發現很多參與MMR修復系統的蛋白，例如大腸桿菌中，有幾個MUT基因MutS、MutL、MutH和UvrD（MutU），其中MutS和MutL在多個物種中都很保守，而MutH是革蘭氏陽性菌特有的。真核生物擁有保守的MutS亞基，能識別DNA復制的細微錯誤，從而保證基因組的穩定性[16-18]。在植物中已經鑒定到了MSH1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、MSH7、PMS1、PMS2、MLH1 和 MLH3 等基因[3，19-25]，對應的表達產物分別屬于不同的亞基，并參與不同修復過程。7個MSH亞基屬于MutS蛋白家族，PMS1、PMS2、MLH1和MLH3則隸屬于MutY蛋白家族。這些蛋白有些直接參與DNA錯配修復，有些是間接參與的，如MSH4和MSH5。雖然MSH4和MSH5未能直接參與MMR修復系統，但是根據同源性比對，MSH4、MSH5與MutY家族有很高的同源性。在這些蛋白中，MSH2和MLH1起核心作用，它們都是和其他蛋白共同形成功能性的蛋白復合體發揮作用的。在原核生物和部分真核生物中，發現MMR缺失突變體會使基因重組率增高。在植物中，雖然存在和真核生物不同的蛋白MSH7[26]，但是其他蛋白都非常保守，說明該修復系統在生物中非常保守。

盡管MMR修復系統在原核生物和動物中研究的非常清晰，但是在植物中，有關MMR修復系統的研究仍不是很清晰，尤其是在一些模式植物中，此類相關研究更是缺乏，如水稻、小麥等。在植物中，通過對模式植物擬南芥的研究，有關植物DNA修復研究已經有了很大的進展，相比動物以及一些深入研究的原核生物來說，植物也擁有很保守的修復系統，并且還擁有獨特于動物的修復蛋白（MSH7），這和植物不能夠移動，需要延伸出更好的修復系統非常吻合。

水稻是我國重要的糧食作物，同時也是基因功能研究的模式植物。目前，在水稻的研究中，已經發現了很多的基因以及代謝通路，但是對于MMR的研究進展還是很少。我們可以借鑒原核生物和真核生物中的MMR的研究進展作為參考，對水稻的MMR修復系統進行深入研究，特別是針對植物的特點，利用基因組不穩定性創造出有利突變，進行育種利用。

1 植物質體中MSH1的功能

MSH1是一個核編碼基因，在植物中是作用于線粒體或其他質體的DNA修復蛋白[27-28]。MSH1基因無論在單子葉還是在雙子葉植物中都非常保守，其對應蛋白擁有不少于6個保守區域，其中有3個區域都涉及到與DNA結合和調控重組[29-31]。植物中的MSH1最初在擬南芥中克隆出來[28]，它和細菌的DNA修復蛋白MutS同源，在維持植物細胞器基因組穩定性中起到重要作用。MSH1的表達受外界環境的影響[32-33]。植物中MSH1在進化過程中有兩次大的變化[29]：第一次是蛋白C端添加了一個GIY-YIG核酸內切酶功能結構域，第二次是添加了一段DNA結合域和一段腺苷三磷酸活性結構域。目前看來，這些區域都是植物中特有的結構域。MSH1基因突變后主要導致細胞器發育相關基因和植物抗逆基因的表達量變化。MSH1基因失去功能后，線粒體基因組的重復序列處交換率明顯增加，并且還會影響核基因的表達。在擬南芥中，當MSH1基因被破壞后，其線粒體中的同源重組率顯著提升，這是由于擬南芥線粒體基因組有超過47條重復序列，且都響應了MSH1基因突變[33]。此外，當MSH1基因被破壞后，葉綠體基因組DNA重排率也出現了下降。當MSH1基因被干涉掉后，高粱、小米、煙草、西紅柿和大豆的后代會出現類似的表型[31]，包括雄性不育、植株變矮、分支增多等基本類似的性狀。例如，在煙草和西紅柿中，MSH1基因被破壞掉后，其細胞質雄性不育顯著提升[34]。這一系列的證據進一步說明了該基因在植物中具有很高的保守性；對RNAi干涉的土豆、煙草、小米和高粱中發現其質體發育不完全會導致葉片出現綠白鑲嵌的表型，表明了MSH1在這些雜色葉子的發育中起到重要作用[27]。對全基因組進行甲基化分析發現msh1突變體的甲基化發生了變化，甲基化區域包括非CG島和著絲粒區域[35]。用msh1突變體和野生型進行雜交，其后代生活活性顯著升高，說明MSH1基因在植物表觀遺傳調控中也起到很重要的作用[31]。目前推測MSH1可能是介導siRNA調控植物基因組甲基化，當然仍需要進一步研究證實。

MSH1基因突變體在育種中也有很大的利用前景。在高粱中，MSH1突變可以產生不同表型的突變體，進而從其后代中選擇一些有利的表型，如穗型、開花時間、較高的生物量等。除此之外，它還可以產生超過4年的穩定變異的突變體，結合傳統育種方法，可以從中尋找到較好的育種材料。細胞質雄性不育主要是由于線粒體開放閱讀框發生了改變，而線粒體基因組在植物基因組進化中起到很大的作用。MSH1突變主要是讓線粒體基因組發生重排，因此可以利用MSH1突變體創造一些細胞質雄性不育材料。研究者發現，將1個芥菜材料MSH1基因干涉掉以后，可以提高芥菜線粒體ORF220拷貝數，并且其干涉突變體花藥發育基因出現上調和下降，該成果可以為以后細胞質雄性不育的研究提供參考[36]。此外，人們對1個西紅柿MSH1基因無義突變體進行研究，發現其后代的生長活力出現明顯增加，研究者推測這可能是由于突變體表觀遺傳導致的。當用DNA甲基化抑制劑處理后，突變體的生長活力下降至野生型水平。這些數據都為以后表觀育種提供了思路，同時也再次證明了表觀遺傳在影響植物生長中起到的重要作用[37]。同時又對西紅柿和土豆進行MSH1干涉處理后，發現都出現了同樣的表型，包括可遺傳的雄性不育以及線粒體重排明顯增加，加之以上芥菜等的研究，我們可以大膽推測此類雄性不育材料有可能在未來育種中得以應用。

2 MSH2和MSH3，MSH6/MSH7形成二聚體介導植物基因組穩定

在細菌以及其他真核生物中，MSH2、MSH6以及MSH3已經被證實能夠形成異源二聚體。在擬南芥中，有2個類MSH6蛋白AtMSH6和AtMSH7。AtMSH2分別和 AtMSH3、AtMSH6還有 AtMSH7形成二聚體，AtMSH2/AtMSH3（MutSβ）二聚體主要是識別單堿基的插入或缺失2-8bp的莖環結構。AtMSH2/AtMSH6（MutSα）二聚體主要識別單堿基替換和短的IDLs，AtMSH2/AtMSH7（MutSγ）主要識別 T/G 替換[38-39]。體外實驗證明了MSH2和MSH6之間的相互作用與MSH2和MSH7之間的相互作用非常類似，且比MSH2和MSH3更易形成二聚體[38]。MSH6和MSH7與其他修復蛋白相互作用的結構域類似，并且都很保守[9]，但是在MSH3中卻未發現含有此類保守的結構域。這說明了MSH2和MSH3形成的二聚體可能是通過其他方式結合損傷的 DNA[38，40-41]。

擬南芥和玉米的MSH7和MSH6有很高的同源性[42-43]。MSH6有近30%的氨基酸保守，長度也只比其他MSH6短了57～250個氨基酸；MSH7和其他MSH蛋白類似，存在一些共同的保守的結構域。擬南芥MSH6和MSH7蛋白的氨基端都存在保守的錯配結合區域，該區域和PCNA（在DNA修復前和修復后都起到重要作用）以及DNA復制蛋白A相互作用[44-47]，在DNA修復中起到重要作用。擬南芥AtMSH2主要在愈傷組織或幼苗中表達，在花序分生組織中的表達量也相對較高。在玉米中也發現了MSH2和MSH7的同源蛋白Mus1和Mus2，但表達量都非常低[3]。

同源重組過程，首先是由一個單鏈的入侵形成異源雙鏈，當兩條異源雙鏈存在單堿基不同時，就會產生錯配，有可能會使同源重組提前終止，并且兩條序列變異度越高，同源重組率越低；相反同源重組的兩條鏈的相似度越高，同源重組率就越高，產生等位基因的可能性也就越高。在酵母細胞里，序列變異度為1%時，可以使同源重組率降低5～23倍，而當序列變異度增長到15%時，其重組率下降了700倍[48]。在植物里，序列變異度為1.6%和1.9%時，可以使重組率降低3.6倍和9.6倍[49-50]。同源重組主要是在染色體的一些重復序列中產生，部分研究證明，當這些反向序列變異度從0.5%增長到9%時，其重組率也相應的下降了4～20倍[51]，這些結果都說明了序列相似度影響重組率。MMR修復系統在同源重組中起到很重要的作用。在細菌和酵母以及哺乳動物中，當MMR蛋白功能缺失后，基因組的重組率會明顯增加[52-55]。而在植物中，當MSH2蛋白功能缺失后，其重組率也會增加。例如，在擬南芥MSH2基因缺失突變體中，當野生型和突變體植株序列變異度同時增加后，野生型植株的重組率明顯下降，而突變型幾乎沒有變化[15，56]。

MMR修復系統中，MSH2在識別錯配堿基過程中起到很重要的作用，而AtMSH2則會抑制同源重組。在MSH-like家族中，AtMSH2是研究最為深入的一種蛋白，當該蛋白功能缺失后，會導致微衛星序列不穩定，同時作為一個增變基因產生一系列突變的后代。說明AtMSH2在維持基因組穩定性中起到重要作用。擬南芥msh2突變體無論是在減數分裂還是有絲分裂，當AtMSH2功能缺失后，其同源重組率顯著上升[14，57]。

植物幾乎都在陽光下生長，經常受到紫外光的照射產生氧代謝產物，影響植物基因組的穩定、種子的發育等，因此植物必須有一套系統來對抗紫外線引起的損傷。早在之前就有這樣的發現，MSH2在動物受到紫外照射后，會在表皮細胞積累[58]，這與在MSH2和MSH6缺失突變體中，動物患皮膚癌的概率明顯增加相一致[59]。也有相關證據證明，MSH蛋白在細胞周期調控中起作用，而細胞周期調控正好和細胞衰老以及細胞代謝相關[60-61]。這些都說明了MSH蛋白在修復細胞受到紫外損傷中起到了重要作用。近年，在植物中的研究也逐漸證明了MSH蛋白在修復紫外損傷中起作用。當玉米受到紫外照射后，發現其MSH蛋白表達量增加[62]。紫外處理擬南芥后發現，MSH2和MSH6蛋白的表達量也增加了，這證明MSH2和MSH6蛋白形成的二聚體可能會修復因紫外而損傷的DNA，從而使植物基因組保持穩定。對擬南芥MSH2和MSH6突變體進行紫外處理，發現植株內部氧化代謝產物明顯增加[5]。這些證據都說明了MMR修復系統對植物由紫外造成的DNA損傷修復起到重要作用，并且存在普遍性。

MMR修復系統產生紊亂后會出現一些很明顯的特征，例如，當生物基因組不穩定時，其基因組微衛星的突變頻率會有變化，這在人類等生物中已經得到證實。在植物中也開始有所研究，并且發現也會出現微衛星不穩定等特征。在已經鑒定到的MSH2突變體中，微衛星都表現出明顯的不穩定性。例如，酵母Msh2突變體的細胞內的微衛星的不穩定性出現了增加，并且抗逆性也有所增加，MSH3突變體也表現出類似的表型。除此之外，在MSH6突變體中，其點突變和微衛星不穩定性都明顯增高。這些說明了此類MMR蛋白在維持體內微衛星穩定性上起到重要作用，并且在原核生物和動物中都存在，說明MMR蛋白在生物中是普遍存在的。而在植物中，盡管研究不多，但是已經發現這類MMR在維持體內微衛星穩定性中也起到重要作用，并且出現類似于原核生物和動物的現象。例如，擬南芥MSH2突變體中微衛星的不穩定性有所增加。此外還發現了MSH7和MSH6也會影響植物的產量，在1個大麥的MSH7缺失突變體中，其結實率和千粒重都低于野生型[26]，而在水稻的MSH6的3個T-DNA插入突變體中發現部分株系的結實率和產量也有所下降[63]。這可能是此類蛋白影響植物體內基因同源重組而導致了生長紊亂。

MMR家族在抑制基因同源重組中起到重要作用，微衛星不穩定就是由于基因的同源重組率出現了增加。而同源重組是產生等位基因的方式之一。因此，更好的理解植物是如何保護其基因組穩定，特別是怎么樣抑制同源重組，對育種也有很大的幫助。育種專家特別希望植物后代的變異度增加，以便從中篩選到良好的育種材料，從而提高產量。因此，對于同源重組必須要進行深入的研究，以為植物育種提供基礎。

3 MSH4和MSH5作用于減數分裂

在原核生物中，MSH4和MSH5主要是在減數分裂中起作用。細胞在減數分裂中會發生同源重組，雙鏈DNA在進行同源重組首先是由雙鏈斷裂的3'端侵入，進入其同源序列，形成Holliday結構，而MSH4和MSH5就是形成Holliday交叉結構所必須的[64-66]。在人類中，hMSH4和hMSH5形成二聚體在Holliday結構中交叉點的節點處起作用[67]。早在2004年就有學者在擬南芥中鑒定到了MSH4基因[68]，該基因突變后不會影響營養生長，但是其花粉敗育率明顯增加，與野生型進一步對比發現，在四分體時，其同源重組交叉點明顯變少，即便是存在交叉點，在細胞中也是非常散亂的，毫無規律性可言。擬南芥中MSH5主要是在重組的后期起作用[23]，當MSH5失去功能后，染色體聯會能夠實現，但是染色體聯會后，第一次減數分裂卻出現延遲，相比野生型，延遲達到8 h左右。擬南芥的MSH5雖然比人類的MSH5要短，但是其C端與人類、酵母等其他真核生物一樣都非常保守[23]。MSH5包含1個保守的螺旋-轉角-螺旋結構[69]，缺乏識別錯配DNA的結構。擬南芥MSH5基因主要在花蕾和花序等有性生殖器官表達[23]，這和MSH5主要在減數分裂起作用十分吻合。MSH5和MSH4必須形成二聚體才具有功能，二者缺一不可。免疫共沉淀實驗證明，無論缺少哪個蛋白，二聚體都無法形成。水稻MSH5和MSH4也是形成二聚體才能發揮作用。在水稻的1個MSH4缺失突變體中，研究者發現雖然其聯會復合物能夠形成，但是其聯會后的交叉點顯著下降，將可以形成二聚體的MSH4和MSH5同時突變后，交叉點仍會下降。與擬南芥以及其他生物相同，酵母雙雜和蛋白拽拉實驗也證明了基因MSH4和MSH5是相互作用的，這也說明了其對應的2個蛋白具有很強的保守性[23]。同擬南芥相似的是，水稻中該二聚體也是在Holliday結構中交叉點起作用，主要是促進CO的形成。水稻的MSH5突變體在營養生長期展示出正常的表型，而在生殖生長期，出現嚴重的敗育。實驗發現，相對于野生型，突變體細胞在減數分裂過程中聯會復合物能夠正常形成，但是重組過程中產生的交叉點卻不能分離，導致水稻敗育。MSH5基因主要是在穗部表達，這和擬南芥表達譜類似。在染色體區域，該基因主要是在第一次減數分裂前期發揮作用[70]。

4 展望

MMR在不同生物體中是一個保守的DNA修復途徑。人們已經詳細地研究了這種用于DNA修復途徑的機制，并且已經從擬南芥中鑒定和克隆了重要的組分如MutS和MutL[20，71-72]。擬南芥MSH基因的相關研究證實了MSH基因家族在進化中非常保守，并且大部分MSH基因都只有1個單拷貝，目前仍需要相關的研究去進一步探索MMR在DNA修復系統中所起的作用。

對于模式植物水稻來說，更加有必要加大其相關研究，探究MMR對水稻一些重要的農藝性狀的影響。水稻誘變育種通常是利用水稻有利的農藝性狀突變基因，通過不同性狀互補的品種之間雜交產生優良農藝性狀的后代，這個過程涉及到生物體內在的基因組信息交流和維持的過程。而它們都需要MMR系統的參與。已知水稻體內單堿基突變容易被MMR系統修復，而雜交會涉及到MMR系統對同源重組的抑制。目前其他作物或植物中有些已得到證實，例如，在擬南芥中MMR系統紊亂后，其后代突變效率明顯增加[73-74]。

目前已有的研究顯示，在水稻中，抑制MMR基因會增加同源重組率，這使其后代變異類型更加豐富；而且抑制MMR相比傳統的EMS誘變除了可以誘導單核苷酸突變還會造成微衛星的不穩定性。盡管MMR在不同物種中是一個保守的DNA修復途徑，但在不同生物體內也會存在差異，曾經有人通過負反饋調節秈稻Shuangsixiangzhan和粳稻Zhonghua11的MMR，發現在矮稈和致死等農藝性狀方面前者要比后者發生的概率要大得多[75]。

通常情況下，MMR發生基因突變可以增加基因組的不穩定性，嚴重時會導致植物的表型出現不同程度的異常，甚至讓植物體無法存活，這也為以后在水稻育種中對其加以利用提出了難題。然而在水稻中尋找到對其表型影響不大，但后代突變頻率增加的MMR突變體卻是可行的，利用這些突變體與骨干親本雜交，可以在短期內創造出更多優異的親本材料。

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Abstract:DNA mismatch repair（mismatch repair,MMR）is an important way of DNA damage repair,and it is mainly used to repair the lack of a single or a few bases,insert and mismatch in the process of DNA damage occurred when DNA synthesis and genetic recombination in the cell,which is very important to maintain genomic stability and DNA replication fidelity.MMR systems are very conservative in both prokaryotes and eukaryotes.It was found that the occurrence of cancer is closely associated with functional defect of the Muts-protein family in the study of human DNA repair system.Similarly,it has been found that functional defect of the Mutsprotein family will appear gene mutant or phenotypes in the Arabidopsis and rice,which will lay the foundation for the further study of plant functional gene analysis and breeding.In this paper,the author reviewed recent advances in the research of mismatch repair of plant DNA and the function of related genes,especially the mutations caused by plant MMR functional defects and microsatellite instability.It is suggested that MMR mutants can be used as a reference for further breeding of MMR-deficient mutants.

Key words:rice;DNA mismatch repair;Muts-protein family;homologous recombination;mutation;stability

Research Progress of Muts-Protein Family in Plant DNA Mismatch Repair System

FENG Anhui1,3,WANG Wumei2,LI Guijiao4,GUO Longbiao1,ZHANG Xiaozhong2*,CUI Yongtao1*
（1China National Rice Research Institute,Hangzhou 310006,China;2Rice Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031,China;3Rice Research Institute of Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China;4Guangxi Ruite Seeds Co.,Ltd,Nanning 530001,China;*Corresponding author:cuiyongtao20@163.com）

S511

A

1006-8082（2017）05-0005-07

2017－06－06

國家科技支撐計劃（2015BAD01B02-2）