TUBB3的表達對晚期胃癌紫杉類藥物化療療效和預后的影響*

劉新福 尹嬋 張輝 劉騰飛

據研究統計，胃癌居世界最常見的惡性腫瘤第4位，死亡率居第2位［1］。中國屬胃癌高發區域，占世界發病人數的42%，多數病例常在晚期才會被確診，單純手術的療效差，術后5年生存率低，因此化學治療在晚期胃癌的綜合治療中占有重要地位。目前，晚期胃癌的化療仍然缺乏國際上廣泛接受的標準治療方案，多以氟尿嘧啶、紫杉醇、鉑類、伊立替康、蒽環類藥物較為常見。大部分研究表明β-微管蛋白Ⅲ（ClassⅢ β-tubulin，TUBB3）在肺癌、卵巢癌、頭頸部等多種腫瘤中表達，其表達水平與抗微管類化療藥（如紫杉醇、多西紫杉醇等）療效及患者的生存預后密切相關［2-6］。但目前還存在一些爭議，有研究表明，肺癌中TUBB3的表達不能預測患者預后［7-8］，然而TUBB3在胃癌中研究相對較少。本研究從臨床實際出發，收集臨床晚期胃癌病例，檢測胃癌組織中TUBB3的表達水平，分析其與化療敏感性及預后相關性，從而為制定個體化化療方案及判斷預后提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取邵陽市中心醫院2008年12月至2011年12月臨床及隨訪資料完整并經病理學確診的晚期胃癌患者49例進行回顧性分析（包括失去手術指征的晚期胃癌及術后復發轉移的胃癌患者）。入組標準：1）所有患者均經病理確診，隨訪資料完整且病理標本充足；2）所有患者按美國癌癥聯合委員會（AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）進行評定，均屬于Ⅳ期，體力狀況ECOG評分≤2分，預計生存期在3個月以上；3）無重要器官功能嚴重受損，血常規、肝腎功能均在正常范圍內，無明顯化療禁忌證，可耐受化療；4）治療前3個月內均未接受放化療、生物治療及中藥治療；5）經CT、MRI、胃鏡及超聲內鏡等檢查方法證實具有至少一個可測量的腫瘤病灶，以便化療后進行療效評價，能進行隨訪并預計依從性好；6）至少接受2個周期以上的化療周期。在49例晚期胃癌組織中，有3例患者因組織標本太少被剔除，本研究共入組晚期胃癌有效病例數46例，全組病例臨床資料見表1，各組基線之間具有可比性。排除標準：1）哺乳期、妊娠婦女患者；2）有對研究藥物過敏史或高過敏體質者；3）有其他嚴重心腦疾病，嚴重肝腎功能不全患者；4）近3個月內接受過放化療及生物治療；5）病理標本、病史資料或影像學資料保存不全者。同時收集所有患者臨床資料，包括患者病區、性別、年齡、術后病檢報告、影像學報告等。

1.2 方法

1.2.1 化療方案及臨床療效評價 患者均簽署化療知情同意書，接受紫杉醇（海南中化聯合制藥工業股份有限公司生產）或多西紫杉醇（艾素，江蘇恒瑞醫藥公司）為基礎的化療，具體用法：多西紫杉醇75 mg/m2，靜脈滴注d1或紫杉醇150～175 mg/m2，靜脈滴注，d1，每3周重復，化療前均予地塞米松、非那根等預處理，防止過敏反應發生。其中DCF方案（多西他賽+順鉑+5-氟尿嘧啶）36例，TP方案（紫杉醇/多西紫杉醇+順鉑）11例，多西他賽單藥方案2例；對于年齡＞70歲、PS評分為2分或一般情況較差的患者化療藥物的劑量稍微減量，對能夠耐受的患者給予4～6個周期化療，未完成2個周期化療或失訪的患者作為脫落病例，至少2個周期化療后納入療效評價。每例患者治療2個周期后，重新復查胸部+全腹部+盆腔增強CT、胃鏡，部分患者復查超聲內鏡、消化道鋇餐及全身骨掃描檢測。參照RECIST 1.1實體瘤評價療效標準進行療效評價，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、穩定（stable disease，SD）和進展（progression disease，PD），定義如下：CR定義為臨床癥狀完全消失并且CT檢查病灶完全消失；PR定義為CT檢查所有的腫瘤病灶最長徑及其垂直徑乘積縮小50%以上，并且沒有新的病灶出現；SD定義為所有的腫瘤病灶最長徑及其垂直徑乘積縮小不超過50%，增加不超過25%；PD定義為所有的腫瘤病灶最長徑及其垂直徑乘積增大超過25%以上或者出現新的病灶。所有患者評估時間一致，如出現CR、PR和SD為臨床受益，繼續同方案化療2～4個周期，最多為6個周期，如出現PD，則更改治療方案。總生存期（overall survival，OS）定義為從研究入組開始至因任何原因引起死亡的時間。無進展生存期（pro?gression-free survival，PFS）定義為從研究入組開始至疾病進展的時間，采用門診、電話等隨訪方式，末次隨訪時間為2014年12月。

1.2.2 免疫組織化學及結果判斷 胃癌組織標本用10%福爾馬林固定、石蠟包埋、組織切片（4 μm），采用免疫組織化學SP法檢測ERCC1、TS和TUBB3蛋白，操作按免疫組織化學試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。由2位病理科高級職稱醫師進行單盲閱片，對標本染色結果進行判斷。所有評分分為0、1、2、3和4分，＞2分定義為高表達，≤2分為低表達［9］。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，TUBB3表達與化療療效的相關性進行χ2檢驗，生存曲線采用Kaplan-Meier方法進行描述，TUBB3表達與生存的關系采用log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸模型。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

表1 TUBB3表達與患者臨床特征的關系及單因素分析Table 1 Characteristics of chemotherapy-treated patients and distribution according to TUBB3 expression status and the univariate analysis

2 結果

2.1 胃癌組織中TUBB3蛋白的表達

TUBB3蛋白在46例患者組織中有不同程度的表達，TUBB3蛋白陽性表達主要位于腫瘤組織的胞核，成棕黃色細顆粒狀分布（圖1）；TUBB3低表達組占54.35%（25/46），TUBB3高表達組占45.65%（21/46）。

2.2 晚期胃癌TUBB3表達與化療療效的關系

在46例有效病例中，紫杉類化療藥物療效達CR 1例，PR 17例，SD 22例，PD 6例，化療總有效率（CR+PR）為39.13%（18/46）；TUBB3低表達組有效率為54.17%，TUBB3高表達組有效率為22.73%，兩者差異具有統計學意義（χ2=4.736，P=0.029）。

圖1 胃癌組織中TUBB3蛋白免疫組織化學檢測（DAB×200）Figure 1 Immunohistochemical expression of TUBB3 protein in gastric carcinoma(DAB×200)

2.3 晚期胃癌TUBB3表達與生存預后的關系

截至末次隨訪時間，全部患者無1例失訪，46例患者全部死亡，TUBB3低表達組患者的中位PFS和OS分別為5.9個月和11.6個月，TUBB3高表達組患者的中位PFS和OS分別為3.9個月和7.9個月，TUBB3低表達組較高表達組的PFS和OS均延長，差異有統計學意義（PFS：P=0.032；OS：P=0.001，圖2）。

2.4 晚期胃癌患者OS單因素分析

對7個變量（年齡、性別、ECOG評分、組織學分化程度、轉移臟器數目、淋巴結轉移及TUBB3表達水平）進行單因素分析發現，患者年齡、性別、淋巴結轉移與中位OS無顯著相關（P＞0.05），而ECOG評分、組織學分化程度、轉移臟器數目和TUBB3表達水平與中位OS顯著相關（P＜0.05，表1，圖2）。

2.5 晚期胃癌患者OS多因素分析

對以上4個有統計學意義的變量（ECOG評分、組織學分化程度、轉移臟器數目和TUBB3表達水平）再納入Cox模型進行多因素回歸分析，結果顯示：按照其作用強度得出影響晚期胃癌患者OS的獨立預后因素依次為：TUBB3表達水平、組織學分化程度、轉移臟器數目和ECOG評分，其中TUBB3高表達死亡風險是低表達的4.988倍（95%CI：2.222～11.200；P＜0.05，表2）。

圖2 TUBB3表達與患者預后的曲線Figure 2 The relationship between the expression of TUBB3 and the prognosis of patients

表2 影響晚期胃癌患者預后的Cox回歸分析Talbe 2 Multivariate overal survival analysis by Cox proportional hazard regression model

3 討論

抗微管類化療藥是作用于細胞微管，通過影響紡錘體形成，從而抑制細胞有絲分裂的一類廣譜化療藥。目前常用的抗微管類藥物主要有紫杉醇、多西紫杉醇、長春瑞濱等。胃癌的化療始于20世紀60年代，在眾多的化療藥物中紫杉醇類藥物是胃癌化療的基本用藥。紫杉醇可以促進微管聚合和穩定已聚合微管。在接觸紫杉醇后，細胞內會積累大量微管，從而干擾細胞的各種功能，特別是使細胞分裂停止，從而起到抗腫瘤效果，多西紫杉醇的藥理機制與紫杉醇相似。據研究顯示，TUBB3是微管蛋白家族中的一種亞型，與抗微管化療藥紫杉醇耐藥的關系最密切［10-12］。一項納入1 149例非小細胞肺癌術后患者進行輔助化療的4個隨機對照試驗的交叉效度研究顯示，TUBB3高表達則生存預后差，但未證實TUBB3預測輔助化療的療效［7］。一項研究納入56例復發的非小細胞肺癌患者，結果提示TUBB3陽性表達，選用紫杉醇為基礎的化療療效更差，TUBB3表達可以預測多西紫杉醇的化療敏感性［3］，在卵巢癌、頭頸部腫瘤及胸腺上皮腫瘤均得到相似結果［4-6］。

TUBB3的表達與晚期胃癌患者的生存關系目前研究資料尚少，有研究用紫杉醇為基礎一線治療復發轉移胃癌患者，結果顯示TUBB3可以預測化療的療效，TUBB3低表達則PFS更長，但與OS差異無統計學意義［13］。本研究結果顯示TUBB3低表達組有效率為54.17%，TUBB3高表達組有效率為22.73%，兩者差異具有統計學意義（χ2=4.736，P=0.029）。TUBB3低表達組患者的中位PFS和OS分別為5.9個月和11.6個月，TUBB3高表達組患者的中位PFS和OS分別為3.9個月和7.9個月，TUBB3低表達組較高表達組的PFS和OS均延長，差異有統計學意義（PFS：P=0.032；OS：P=0.001）。單因素及多因素分析得出，TUBB3均為晚期胃癌的預后因素。提示晚期胃癌患者的TUBB3低表達用紫杉醇或多西紫杉醇為基礎的化療緩解率高，預后更好。Cox回歸分析顯示TUBB3表達水平為晚期胃癌患者獨立預后因素，TUBB3高表達死亡風險是低表達的 4.988倍（95%CI：2.222～11.200，P＜0.05），提示晚期胃癌組織中TUBB3的表達是一種判斷患者生存預后的標記物；TUBB3低表達組選擇紫杉醇類藥物可提高化療療效，TUBB3蛋白可作為晚期胃癌選用紫杉醇類藥物化療敏感性的預測指標。

目前有多種檢測TUBB3的方法，免疫組織化學技術、實時定量聚合酶鏈反應技術（RT-PCR）等是最常用的方法，免疫組織化學技術能迅速檢測TUBB3蛋白的表達，廣泛使用于臨床，經濟適用，但存在較差重復性及客觀性。RT-PCR技術是目前檢測TUBB3 mRNA表達水平最敏感的方法之一，但是基層醫院難以實施，主要因為檢測成本較高、操作難。采用免疫組織化學半定量方法檢查胃癌組織中TUBB3的表達是本研究的潛在不足點，為了最大程度降低誤差，本研究采用雙盲方法選擇了2位病理學專家，均對研究不知情，所有標本評分參照以前驗證的免疫組織化學研究評分系統。盡管RT-PCR方法檢測生物標志物信使RNA水平能提供更多的信息，但是免疫組織化學方法使用更廣泛，更容易在臨床上被接受。為了今后進一步研究的深入，免疫組織化學檢測TUBB3的表達時，尋找一個國際標準化、公認的、最佳的腫瘤陽性表達的定義至關重要。此外，還需要一些大樣本前瞻性研究來證實胃癌患者中TUBB3蛋白的表達與患者生存預后及與紫杉醇類藥物化療療效的關系。

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