子宮內膜癌組織和血清中的CD26表達及其診斷價值*

楊曉清 朱怡 姚鋒 陳肖靜 張玉泉

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性最常見的惡性腫瘤之一，目前發病率和死亡率呈逐年上升趨勢。因EC發病的確切分子機制尚不明確，尋找新的診斷及治療靶基因對EC的預防、治療及預后具有重要的意義。

二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidaseⅣ，DPPⅣ）又稱CD26是1966年發現的跨膜糖蛋白［1］，為一種含766個氨基酸的單鏈結構蛋白，其前6個氨基酸殘基位于胞漿中，7～28個氨基酸殘基由疏水性氨基酸組成并橫跨細胞膜，其余部分位于細胞外，可透過細胞膜分泌到膜外而成為可溶性CD26（soluble CD26，sCD26）［2］。同時，CD26具有非酶功能，可與細胞外基質蛋白等相互作用而促進細胞的黏附、遷移和轉移［3］。鑒于這些功能，CD26在臨床許多疾病的發生、發展，尤其在腫瘤的研究中，其表達水平與腫瘤初始階段的惡性轉化、進展以及免疫調節密切相關［4］。因此，本研究旨在探討人正常子宮內膜增生期、分泌期及Ⅰ型EC病理不同分級組織中的CD26及血液中的sCD26表達，為進一步闡明CD26在EC發生、發展中的作用及其在臨床診斷中的價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年1月至2015年12月南通大學附屬醫院行診斷性刮宮及行手術治療的EC病理不同分級患者的組織標本，其中正常子宮內膜增生期和分泌期的組織標本各30例、依據國際婦產科聯盟（FIGO）的EC診治指南（2015年版）收集術后病理證實為Ⅰ型EC的G1、G2及G3級組織標本各40例。應用免疫組織化學法檢測后，采集2016年1月至2017年9月經門診體檢的健康育齡女性和住院治療的Ⅰ型EC患者的血液標本，其中正常子宮內膜增生期和分泌期的血液標本各20例、Ⅰ型EC的G1、G2級各20例、G3級15例（EC血液標本均選擇患者月經周期為增生期的病例）。本研究獲得南通大學附屬醫院倫理委員會批準及患者本人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 將組織切片置60℃烤箱烤片2 h脫蠟水化，微波修復，3%H2O2溶液阻斷內源性過氧化物酶，羊血清封閉后，加入購自英國Abcam公司的兔抗人CD26一抗（體積稀釋比例為1：800），濕盒孵育4℃過夜。第二天加入二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染，透明封片。使用PBS代替一抗作為陰性對照。

顯微鏡下隨機選取5個高倍視野（×200）進行觀察以及結果判定。在每個視野中，計數8條子宮內膜腺體及100個細胞中的陽性細胞數，若視野中不足8條腺體，則對視野中的所有細胞進行計數，判斷標準根據陽性細胞的比率和細胞膜著色強度得分進行評價。評估結果采用不同的得分表示：陽性細胞與總細胞數相比的比率＜5%為0，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度中的陰性為0，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每個標本的最終得分為陽性細胞比率的得分×染色強度的得分，得分＜4分為低表達，得分≥4分為高表達。染色結果由兩位有經驗的病理科醫師雙盲下進行獨立判定。

1.2.2 ELISA法 經驗證CD26表達水平后，分析標本血清中的sCD26表達。對所采集的正常及EC患者的血液樣本行3 000 r/min，離心20 min后提取上層血清，-80℃冰箱保存備用。CD26檢測ELISA試劑盒購自美國R&D公司，實驗步驟按產品說明書進行，在450 nm波長下測各孔的光密度值（OD值），依據標準品的濃度及對應的OD值繪制標準曲線，計算樣品中蛋白濃度，并取平均值。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料均以均數±標準差（）表示，采用獨立樣本t檢驗；計數資料間比較采用χ2檢驗。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行組間差異分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 正常子宮內膜組織及Ⅰ型EC組織中的CD26表達水平及與Ⅰ型EC的病理分級的關系

免疫組織化學染色結果顯示，CD26蛋白陽性表達的棕黃色顆粒定位于腺體上皮細胞膜及部分細胞質，正常子宮內膜增生期和分泌期組織中CD26陽性率分別為3.33%（1/30）和56.67%（17/30），子宮內膜分泌期的CD26陽性率（OR為17.00）與正常子宮內膜增生期（OR為1.00）相比明顯增高，分泌期的CD26表達水平＞增生期，兩者的差異具有統計學意義（P＜0.05）；Ⅰ型EC的G1、G2、G3級組織中的CD26陽性率分別為37.50%（15/40）、62.50%（25/40）、85.00%（34/40），G1、G2及G3級組織中的CD26陽性率（ORG1為11.25、ORG2為18.75及ORG3為25.50）與正常子宮內膜增生期（OR為1.00）比較明顯增高，G3級的CD26表達水平＞G2級＞G1級，差異均具有統計學意義（P＜0.05，圖1，表1）。CD26表達水平與Ⅰ型EC病理分級呈正相關。

2.2 門診體檢的健康育齡女性及Ⅰ型EC患者的血清中的sCD26表達

采用ELISA檢測受試者血清中的sCD26表達水平發現，經門診體檢的健康育齡女性血清中的sCD26表達水平均較低，正常子宮內膜增生期與分泌期的sCD26表達水平進行比較差異無統計學意義（P＞0.05）；在Ⅰ型EC患者中，G3級患者血清中的sCD26表達水平與正常子宮內膜增生期的健康育齡女性相比明顯增高，兩者比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；雖Ⅰ型EC的G1級患者血清中的sCD26表達水平較低，但隨著EC病理分級增高，sCD26表達水平也明顯增加，G3級患者血清中的sCD26表達水平與正常子宮內膜增生期的健康育齡女性相比差異具有統計學意義（P＜0.05，表2）。

圖1 免疫組織化學法檢測正常子宮內膜及Ⅰ型EC病理不同分級組織中的CD26表達（H&E×200）Figure 1 The expression of CD26 protein was detected in the normal endometrium and different pathological degree of I EC tissues by immunohistochemistry(H&E×200)

表1 60例正常子宮內膜及120例I型EC病理不同分級組織中的CD26表達Table 1 CD26 expression in 60 normal and 120 different pathological grades of typeⅠEC groups

表2 40例門診體檢的健康育齡女性及55例I型EC病理不同分級患者血清中的sCD26表達Table 2 The level of soluble CD26 in the serum of 40 healthy women and 55 patients with different pathological grades of typeⅠEC groups

3 討論

近年來，研究表明CD26在腫瘤發生、發展特別是在腫瘤的侵襲和轉移過程中發揮著重要作用［4］。但有關CD26表達水平在不同腫瘤中的研究報道卻有不同。在某些腫瘤中，CD26作為腫瘤抑制因子發揮抑制作用［5-6］，而在另一些腫瘤中，CD26卻又是與腫瘤侵襲、轉移密切相關的蛋白［7］。

目前國內外關于CD26與EC發生、發展關系的研究報道較少，國外Khin等［8］通過免疫組織化學法及流式細胞術分別檢測了CD26在EC組織中及子宮內膜癌各細胞系中的表達，認為其表達水平與病理分級呈負相關。國內邸石等［9］采用免疫組織化學法檢測了子宮內膜樣腺癌中的CD26表達，與Khin等［8］得出的結論一致。隨著CD26在腫瘤中作用機制的研究深入，越來越多的研究得出與之前研究結果相悖的結論。在對卵巢癌的研究中，既往研究認為［5］CD26高表達可抑制卵巢腫瘤惡性表型，對卵巢具有保護作用。但最近的研究卻發現CD26參與卵巢癌的發生發展，且CD26表達水平越高，患者生存期越短，預后越差，并認為CD26為上皮性卵巢癌的潛在預測標記物［7］。同樣，在其他腫瘤的研究中也出現與之前研究結果相悖的結論［6］。因此進一步深入探究CD26在EC中的作用及作用機制顯得尤為重要。

本課題組的前期研究發現在EC細胞中，當CD26過表達后可促進體外癌細胞的增殖和遷移，而干擾CD26表達后則可以抑制癌細胞的惡性生物學行為［10］。本研究發現，CD26在正常子宮內膜的增生期、分泌期及Ⅰ型EC病理不同分級的組織中均有表達。在正常子宮內膜分泌期組織中的CD26表達水平＞增生期，在Ⅰ型EC的G3級組織中的CD26表達水平＞G2級＞G1級，CD26表達與病理分級呈正相關。本研究與既往報道的EC組織中的CD26表達有所區別［9］，可能與病例選擇或檢測方法的不同有關，有待于今后增加臨床組織樣本，尤其是在Ⅱ型EC組織樣本中研究分析。

為進一步明確CD26在EC發生、發展中的作用及明確CD26是否可以作為血液的早期檢測、病情進展及晚期復發的評估指標，本研究在對臨床組織樣本研究的基礎上，進一步采集了門診體檢的健康育齡女性及病理不同分級的Ⅰ型EC患者的血清標本，檢測其血清中的sCD26表達水平。本研究結果發現，處于月經周期增生期及分泌期的正常育齡女性血清中的sCD26表達水平均較低。在Ⅰ型EC患者中隨著病理分級的增高，sCD26表達水平逐漸增加，G3級患者血清中的sCD26表達水平明顯高于健康育齡女性，差異具有統計學意義。盡管本研究中的sCD26表達水平隨著Ⅰ型EC病理分級增高逐漸增加，但G1級患者血清中的sCD26的表達水平與正常子宮內膜增生期的健康育齡女性相比無顯著性差異，這一結果還有待于今后進一步標準化樣本及增加樣本量來進行驗證并解釋。本研究對Ⅰ型EC患者血清中的sCD26表達水平進行檢測，并分析了與EC病理分級的關系，Ⅰ型EC患者血清中的sCD26表達水平增加或可成為臨床EC血液檢測標記物的一個新方向，對EC的發生、發展具有一定的預測意義。

綜上所述，對于Ⅰ型EC患者，EC組織中的CD26表達與病理分級呈正相關，血清中的sCD26表達水平亦與EC疾病的進展密切相關，這將有助于揭示EC發生、發展的機制，為EC的診斷、治療提供新的參考依據。

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